均質(zhì)法提取側(cè)柏葉中黃酮類化合物的研究

楊振楀，李瑞海，賈天柱

均質(zhì)法提取側(cè)柏葉中黃酮類化合物的研究

楊振楀1，李瑞海2*，賈天柱2

目的 選擇均質(zhì)法從側(cè)柏葉中提取黃酮類化合物。方法 采用比色法，以蘆丁為對照品，建立了含量測定法。采用單因素試驗法，對比超聲、微波、回流和均質(zhì)提取法，并利用正交試驗，以均質(zhì)時間、甲醇濃度、料液比和次數(shù)4個因素進行考察，結(jié)果 總黃酮濃度在0.008 96～0.053 76 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，加樣回收率為102.07，RSD為2.77%。正交試驗結(jié)果：均質(zhì)時間15 min，甲醇濃度為70%，料液比1∶10，提取1次。結(jié)論 所建立的含量測定法簡單易行，均質(zhì)法比其他方法更為簡便，省去對物料粉碎的步驟，且正交試驗確定的試驗結(jié)果穩(wěn)定、可靠，可用于工業(yè)生產(chǎn)。

側(cè)柏葉；總黃酮；蘆丁；正交試驗；均質(zhì)法

0 引言

黃酮類化合物是廣泛存在于自然界中的一類化合物，常以游離態(tài)或糖苷的形式存在，側(cè)柏葉中已知的黃酮類成分除藥典規(guī)定的槲皮苷外，還含有楊梅苷、楊梅素、槲皮素、山柰酚、穗花杉雙黃酮、扁柏雙黃酮等黃酮類成分。鑒于側(cè)柏葉的黃酮類成分良好的活性作用，擬對其進行進一步研究。均質(zhì)提取法提取速度快、溫度低、能耗低且目的成分得率高。本實驗擬選取蘆丁為對照品，采用紫外分光光度法對不同方法提取的側(cè)柏葉總黃酮進行含量測定，并利用正交試驗法，確定側(cè)柏葉總黃酮成分均質(zhì)法的最佳提取工藝[1-5]。

1 試劑與試藥

1.1 藥品與試劑 蘆丁(大連美侖生物技術(shù)有限公司20130528)；側(cè)柏葉經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學尹海波教授鑒定均為柏科植物側(cè)柏Platycladusorientalis(L.)Franco的干燥枝梢和葉；甲醇、稀乙醇、石油醚(60～90 ℃)、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等其他試劑均為分析純。

1.2 儀器 分光光度計(日本日立)；UV Solutions 2.1工作站；ESB-500高剪切均質(zhì)乳化機(上海易勒機電實驗室)；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(榮華儀器制造有限公司)；超聲波提取器(奧特賽恩斯儀器有限公司)；0.000 01 g電子天平(SARTORIUS CP225D)。

2 方法

2.1 側(cè)柏葉總黃酮類成分含量測定方法的建立

2.1.1 蘆丁標準品溶液[1]精密稱取干燥至恒定質(zhì)量的蘆丁對照品適量，置于100 mL容量瓶中，加入50%乙醇使其溶解定容至刻度，搖勻，制得濃度為0.224 0 mg/mL的蘆丁標準品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取側(cè)柏葉樣品，粉碎，研細后精密稱取1.0 g，置于索氏提取器中，加入石油醚(60～90 ℃)25 mL回流提取4 h，棄去石油醚提取液，藥渣揮干，加甲醇25 mL回流提取至無色，提取液蒸干，殘渣加稀乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，加稀乙醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.1.3 測定法及最大吸收波長的確定 取上述蘆丁對照品溶液5 mL，置于25 mL容量瓶中，加水6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，放置6 min，加氫氧化鈉溶液10 mL，再加水至刻度，放置15 min，以相應試劑作為空白，在波長200～800 nm范圍內(nèi)掃描，確定蘆丁的吸收波長為510 nm。見圖1。

圖1 蘆丁對照品200～800 nm范圍掃描曲線

2.1.4 蘆丁對照品標準曲線的繪制 精密吸取蘆丁對照品溶液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL，置于25 mL的容量瓶中，加水6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，放置6 min，加氫氧化鈉溶液10 mL，再加水至刻度，放置15 min，以相應試劑作為空白，在510 nm處測定吸收度。以對照品的濃度(C，mg/mL)作為橫坐標、吸收度(A)作為縱坐標，繪制標準曲線，回歸方程：A=12.494 C-0.017 5(r=0.999 8)，結(jié)果顯示，以蘆丁為對照的總黃酮濃度在0.008 96～0.053 76 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.1.5 精密度試驗 精密吸取同一蘆丁對照品溶液，按“2.1.3”項下同法操作連續(xù)測定吸光度6次，結(jié)果RSD為0.22%，表明儀器的精密度良好。

2.1.6 重復性試驗 取同一樣品，各1.0 g，精密稱定，按“2.1.2”項下制備方法，制備樣品溶液，精密吸取供試品溶液5 mL，置于25 mL容量瓶中，按標準曲線繪制項下的方法，自“加水6 mL”起，依法測定吸光度，結(jié)果RSD為1.60%，表明方法重復性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，精密吸取供試品溶液5 mL，置于25 mL容量瓶中，按標準曲線繪制項下的方法，自“加水6 mL”起，按0、10、20、30、40、50、60 min時間間隔依法測定吸光度，結(jié)果RSD為0.37%，表明總黃酮性質(zhì)較穩(wěn)定，樣品液在60 min內(nèi)測定，結(jié)果可靠。

2.1.8 加樣回收試驗 精密稱取已知含量的樣品0.5 g，精密加入蘆丁對照品適量，按“2.1.2”項下供試品溶液的制備方法操作，精密吸取供試品溶液5 mL，置于25 mL容量瓶中，按標準曲線繪制項下的方法，自“加水6 mL”起依法測定吸光度，計算含量及回收率。

2.2 常見提取方法的比較(見表1)

2.2.1 超聲提取 稱取側(cè)柏葉粉1.0 g置于錐形瓶中，加甲醇溶液10 mL，于超聲波清洗儀中常溫超聲提取30 min，超聲頻率100 Hz，過濾，濾餅再重復提取2次，合并3次提取液，減壓濃縮至干，按“2.1.3”項測定法，按“2.1.4”項標準曲線測定樣品含量。

2.2.2 微波提取 稱取側(cè)柏葉粉1.0 g置于錐形瓶中，甲醇水溶液10 mL，于高火下加熱至剛沸騰即停止加熱約1 min后再加熱，反復多次，直至累計加熱10 min，濾過，濾餅再重復提取2次，合并濾液，合并3次提取液，減壓濃縮至干，按“2.1.3”項測定法，按“2.1.4”項標準曲線測定樣品含量。

2.2.3 回流提取 稱取側(cè)柏葉粉1.0 g置于圓底燒瓶中，加甲醇溶液10 mL，水浴中70 ℃加熱回流提取，回流提取2 h后過濾，濾餅再重復提取2次，合并濾液，合并3次提取液，減壓濃縮至干，按“2.1.3”項測定法，按“2.1.4”項標準曲線測定樣品含量。

2.2.4 均質(zhì)提取 稱取側(cè)柏葉粉1.0 g置于錐形瓶中，加甲醇溶液10 mL，均質(zhì)提取5 min，過濾，濾餅再重復提取2次，合并3次提取液，減壓濃縮至干，按“2.1.3”項測定法，按“2.1.4”項標準曲線測定樣品含量。

2.3 正交試驗優(yōu)選 以均質(zhì)時間、甲醇濃度、料液比和次數(shù)4個因素進行考察，每個因素3個水平，采用L9(34)正交試驗優(yōu)選提取工藝。因素水平見表2。以蘆丁為對照的總黃酮含量進行評價，進行提取工藝條件優(yōu)選。正交試驗結(jié)果見表3，方差分析見表4。因素指標相關(guān)圖見圖2。

表1 常見提取方法的比較

表2 正交試驗因素水平

表3 正交試驗表及含量測定結(jié)果

圖2 因素指標相關(guān)圖

變異來源離均差平方和自由度(n)均方(MS)F值P值均質(zhì)時間(min)0.0544020.0271824.54<0.05甲醇濃度(%)0.0754320.0377134.05<0.05料液比0.0022120.001111.00—次數(shù)0.0299520.0149713.52>0.05合計0.16200

注：F0.05(2.2)=19.00

由R值可知，各因素對總黃酮類成分提取的影響大小順序為B>A>D>C；方差分析結(jié)果B因素(甲醇濃度)具有顯著影響。最后確定提取工藝為A3B2C1D1，即均質(zhì)時間15 min，甲醇濃度為70%，料液比1∶10，提取1次。

2.4 重復性實驗 按優(yōu)選的提取工藝提取3批側(cè)柏葉總黃酮，測定其含量，結(jié)果為0.483%±0.10% (n=3)。

3 討論

3.1 預試驗中首先對提取溶劑進行選擇，經(jīng)查閱文獻，發(fā)現(xiàn)黃酮類成分一般采用甲醇和乙醇提取，經(jīng)比較，甲醇和乙醇的提取中兩者并無著差異，與乙醇相比，甲醇的黏度較低，在過濾時阻力相對較小，易操作，最后確定甲醇為提取溶劑，在對比不同濃度甲醇提取時發(fā)現(xiàn)，30%甲醇和甲醇(即低濃度甲醇和高濃度甲醇提取，含量均低)，最后確定50%、70%、90%甲醇作為提取濃度水平。預試驗中發(fā)現(xiàn)，均質(zhì)提取時間長，提取完全，但超過10 min后，沒有太大的變化。料液比對于提取有很大影響，預試驗發(fā)現(xiàn)，料液比為1∶40時，含量不再增加。預試驗發(fā)現(xiàn)，溫度對于均質(zhì)提取并沒有太大影響，因此本次實驗不作考察。最后確定均質(zhì)時間、甲醇濃度、料液比和次數(shù)4個因素，每個因素3個水平進行考察。

3.2 由表2的R值可知，各因素對總黃酮類成分提取的影響大小順序為B>A>D>C；以R值最小的D提取次數(shù)為誤差項進行方差分析，結(jié)果A因素均質(zhì)時間和B因素甲醇濃度對總黃酮提取具有顯著影響，因此選擇其相應的最高水平。由方差分析結(jié)果表明，料液比和次數(shù)均不是影響實驗的主要因素，因此可選擇利于生產(chǎn)的相關(guān)水平，在生產(chǎn)中料液比高、提取次數(shù)多會增加溶劑量，給后續(xù)的濃縮等操作帶來很大的負擔，也會使工藝更加繁瑣。故確定提取工藝為A3B2C1D1，即均質(zhì)時間15 min，70%甲醇，料液比1 ∶10，提取1次。

3.3 由表1常見提取方法的比較結(jié)果可知，微波提取、回流提取和均質(zhì)提取法含量較高，超聲提取法提取成分的含量較低?；亓魈崛≥^為傳統(tǒng)、可靠，但操作繁瑣是其主要的問題。微波提取和均質(zhì)提取是新興提取方法，具有優(yōu)勢，主要表現(xiàn)在操作簡單。與回流比較，不需要長時間加熱，熱敏性成分會受到破壞，同時能源消耗量大。與微波提取法相比，均質(zhì)提取法更具有優(yōu)勢，減少了粉碎的環(huán)節(jié)，提取率較高，因此，本研究主要針對均質(zhì)提取法對側(cè)柏葉進行研究，以利其在實驗和生產(chǎn)中廣泛應用。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京:化學工業(yè)出版社,2005:32.

[2] 馬彥芳.金銀花中總黃酮的含量測定[J].青?？萍?2007,14(4):29-30.

[3] 徐軍,李瑞海.用HPLC法測定心通片中葛根素的含量[J].實用藥物與臨床,2008,11(2):120-121.

[4] 李宇馨,李瑞海.小檗堿抗炎活性研究[J].實用藥物與臨床,2013,16(1):43-44.

[5] 譚曉亮,李瑞海,賈天柱.側(cè)柏葉炮制前后成分的對比[J].實用藥物與臨床,2015,18(11):1359-1362.

Extraction of flavonoid compounds fromCacumenplatycladiby homogeneous method

YANG Zhen-yu1,LI Rui-hai2*,JIA Tian-zhu2

(1.Shenyang Traditional Chinese Medicine,Shenyang 100020,China;2.College of Pharmacy,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Dalian 116600,China)

Objective To extract the flavonoids fromCacumenplatycladiby homogeneous method.Methods The content determination method was established by colorimetric method with rutin as the reference substance.The ultrasound,microwave,reflux and homogeneous extraction method were compared using the single factor experiment method,and the orthogonal test was used with homogeneous time,methanol concentration,solid-liquid ratio and times as four factors were.Results Total flavonoids had good linear relationship in the range of 0.008 96～0.053 76 mg/mL,the average recovery rate was 102.07 andRSDwas 2.77%.Orthogonal test results were as follows:the homogeneous time was 15 min,methanol concentration was 70%,and the material-liquid ratio was 1∶10,extraction for 1 time.Conclusion The established method for content determination is simple and feasible,in which the homogeneous method is simpler,and it can save the procedure of material crush.The established orthogonal test has stable and reliable results,which can be used in industry production.

Cacumenplatycladi;Total flavonoids;Rutin;Orthogonal test;Homogeneous method

2016-07-18

1.沈陽市中醫(yī)院，沈陽 100020；2.遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，大連 116600

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201703020