柚皮素對破骨細(xì)胞特異性基因及OPG/RANKL/RANK表達(dá)的影響

吳新濤 石晶 高樂才 吳文元 龐石磊

·論著·

柚皮素對破骨細(xì)胞特異性基因及OPG/RANKL/RANK表達(dá)的影響

吳新濤 石晶 高樂才 吳文元 龐石磊

目的 觀察柚皮素對破骨細(xì)胞特異性基因組織蛋白酶-K(CATK)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)及骨保護(hù)素/核因子-κB 受體活化因子配體/核因子-κB 受體活化因子(OPG/RANKL/RANK)表達(dá)的影響。方法 采用全骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)法培養(yǎng)破骨細(xì)胞，細(xì)胞分5組：空白對照組、HG-DMEM誘導(dǎo)組、HG-DMEM+0.1 μmol/L柚皮素組、HG-DMEM+1 μmol/L柚皮素組、HG-DMEM+10 μmol/L柚皮素組。HE染色、TRAP染色觀察破骨細(xì)胞形態(tài)；分光光度計(jì)檢測TRAP陽性細(xì)胞數(shù)；Real time-PCR和Western-blot檢測CATK、MMP-9、TRAP及OPG/RANKL/RANK mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果 與空白對照組比較，HG-DMEM誘導(dǎo)組TRAP陽性細(xì)胞數(shù)、TRAP、MMP-9、CATK、RANKL、RANK mRNA和蛋白表達(dá)明顯增加，OPG mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。 與HG-DMEM誘導(dǎo)組比較，柚皮素預(yù)處理24h能夠明顯降低TRAP陽性細(xì)胞數(shù)、CATK、MMP-9、TRAP、RANKL、RANKmRNA和蛋白表達(dá)，增加OPGmRNA和蛋白表達(dá)(P<0.05)，呈劑量依賴性。結(jié)論 柚皮素能夠抑制破骨細(xì)胞的生成和分化，該作用可能是通過OPG/RANKL/RANK信號通路抑制TRAP、MMP-9、CATK表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

柚皮素；破骨細(xì)胞；OPG/RANKL/RANK信號通路

近年來，骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率逐漸升高，已經(jīng)成為影響人們生活質(zhì)量的主要疾病之一[1]。其病理機(jī)制是成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨生成和破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收過程失衡，導(dǎo)致骨吸收速率超過骨生成，最終引起骨量丟失。破骨細(xì)胞是唯一具有骨吸收作用的細(xì)胞，其來源于骨髓造血干細(xì)胞，在RANKL、M-CSF誘導(dǎo)下形成，對于維持骨量至關(guān)重要[2]。中草藥柚皮苷屬黃酮類物質(zhì)，具有抗氧化、保護(hù)神經(jīng)、治療骨質(zhì)疏松癥等藥理作用。柚皮素是柚皮苷的主要代謝產(chǎn)物，體外實(shí)驗(yàn)表明柚皮素對大鼠成骨細(xì)胞促骨形成活性優(yōu)于柚皮苷[3,4]。然而，柚皮素是否影響破骨細(xì)胞的分化、成熟目前尚不清楚。本研究利用體外培養(yǎng)的破骨細(xì)胞，通過觀察柚皮素對破骨細(xì)胞特異性基因CATK、MMP-9、TRAP及OPG/RANKL/RANK表達(dá)的影響，旨在闡明柚皮素防治骨質(zhì)疏松癥的具體分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 高糖-DMEM(HG-DMEM)培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；兔抗鼠CATK、MMP-9、TRAP、OPG、RANKL、RANK、β-actin多克隆抗體購自美國Santa Cruz 公司；細(xì)胞裂解液、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體、BCA蛋白濃度測定試劑盒、高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；Prime Script TM RT Master Mix(Perfect Real Time)反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takara公司；Trizol、實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒購自美國Promega公司。抗TRAP檢測試劑盒購自南京建成生物研究所。

1.2 動(dòng)物 雌性SD大鼠，胸自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[動(dòng)物合格證號：SCXK-(京)2012-0001]體重180～215 g，清潔級，恒溫、恒濕條件下飼養(yǎng)。

1.3 儀器 Chemi DocTM XRS+化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(Biorad公司)；7300 型Real time-PCR擴(kuò)增儀(美國ABI公司)；倒置顯微鏡(日本 Olympus 公司)。

1.4 破骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng) 參照相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道采用全骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)法培養(yǎng)破骨細(xì)胞[5]。大鼠無水乙醚處死后，75%乙醇浸泡10 min，無菌手術(shù)切取雙側(cè)股骨，去除表面附著的肌肉和筋膜，75%乙醇浸泡1 min，于超凈工作臺上剪掉兩端干骺端，充分暴露骨髓腔，PBS反復(fù)沖洗。骨髓細(xì)胞1 000 r/min離心5 min，棄上清，接種于培養(yǎng)瓶中，加入HG-DMEM培養(yǎng)基(含10%FBS，青、鏈霉素各100 U/ml)，在37℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)30 min。收集細(xì)胞懸液，接種于6孔板中，加入含40 ng/ml RANKL和40 ng/ml M-CSF的HG-DMEM培養(yǎng)基液誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d，調(diào)整細(xì)胞密度為1×107/ml，每3天換液1次。待細(xì)胞生長至80%融合時(shí)根據(jù)需要進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測。

1.5 分組及給藥 細(xì)胞分5組：空白對照組(只加HG-DMEM培養(yǎng)基)；HG-DMEM誘導(dǎo)組(加入含RANKL、M-CSF各40 ng/ml的HG-DMEM誘導(dǎo)液)；HG-DMEM+柚皮素組，在HG-DMEM誘導(dǎo)液存在的情況下，分別加入0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L柚皮素。

1.6 觀察指標(biāo)及方法

1.6.1 HE染色觀察破骨細(xì)胞形態(tài):細(xì)胞消化后接種于24孔板中，調(diào)整細(xì)胞密度為1×107/ml，進(jìn)行HE染色，在(×200)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.6.2 破骨細(xì)胞計(jì)數(shù):細(xì)胞接種于24孔板中，進(jìn)行TRAP染色，鏡下可見胞漿中紅色顆粒樣沉淀，即為TRAP陽性染色，細(xì)胞核呈陰性，計(jì)數(shù)有3個(gè)及3個(gè)以上細(xì)胞核的細(xì)胞為破骨細(xì)胞。每孔隨機(jī)選取3個(gè)視野(×200)，計(jì)算均值。

1.6.3 分光光度計(jì)檢測TRAP活性:收集細(xì)胞上清液，于530 nm波長處檢測吸光度值，嚴(yán)格按照試劑盒說明書計(jì)算TRAP活性。

1.6.4 Real time-PCR:Trizol提取細(xì)胞總RNA，按照試劑盒說明書加樣進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，ABI 7300型熒光定量PCR儀擴(kuò)增。由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。用儀器自帶的分析軟件得到各樣本、各基因擴(kuò)增的Ct值，以β-actin為內(nèi)參照基因，目的基因表達(dá)相對值RQ=2ΔΔCt。見表1。

表1 Real time-PCR引物序列

1.6.5 Western-blot:提取細(xì)胞總蛋白，半干法電泳轉(zhuǎn)移至PVDF膜，10%脫脂奶粉封閉2 h。依次加入特異性一抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，化學(xué)發(fā)光法顯色、定影。用UVP軟件掃描測定蛋白條帶IOD值，β-actin作為內(nèi)參照，以目的蛋白與β-actin吸光度值的比值表示目的蛋白相對表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 大鼠破骨細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定HE染色結(jié)果顯示，最初采集的骨髓造血干細(xì)胞呈大小一致的圓形，懸浮生長。3d后可見單核細(xì)胞數(shù)目逐漸增多，細(xì)胞突起互相連接，細(xì)胞逐漸融合；培養(yǎng)5d時(shí)單核細(xì)胞融合匯聚現(xiàn)象更明顯，逐漸形成多核的破骨細(xì)胞； 7d時(shí)多核的破骨細(xì)胞數(shù)量達(dá)峰值，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，胞體較大，胞核約3～20個(gè)，細(xì)胞邊緣不整，周邊可有偽足伸出。破骨細(xì)胞TRAP染色可見鏡下具有大量空泡和偽足的多核細(xì)胞，胞漿呈紫紅色陽性反應(yīng)，細(xì)胞呈圓形，數(shù)量不等，胞體呈煎蛋狀、漏斗狀、索條狀，形態(tài)不規(guī)則。

2.2 柚皮素對破骨細(xì)胞形成數(shù)量、TRAP活性的影響 與空白對照組比較，HG-DMEM誘導(dǎo)組破骨細(xì)胞數(shù)量、TRAP活性明顯增加，給予不同劑量柚皮素能夠明顯降低破骨細(xì)胞數(shù)量、TRAP活性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，呈劑量依賴性。見表2。

組別TRAP陽性細(xì)胞數(shù)TRAP活性(U/L)空白對照組67.23±6.142.78±0.35HG-DMEM誘導(dǎo)組206.35±13.67*10.14±1.56*HG-DMEM+0.1μmol/L柚皮素組166.21±10.64*#8.42±1.12*#HG-DMEM+1μmol/L柚皮素組132.53±10.42*△6.20±0.88*△HG-DMEM+10μmol/L柚皮素組91.56±7.44*☆4.01±0.57*☆

注：與空白對照組比較,*P<0.05；與HG-DMEM誘導(dǎo)組比較,#P<0.05；與HG-DMEM+0.1μmol/L柚皮素組比較，△P<0.05；與HG-DMEM+1μmol/L柚皮素組比較,☆P<0.05

2.3 柚皮素對破骨細(xì)胞TRAP、MMP-9、CATK表達(dá)的影響 與空白對照組比較，HG-DMEM誘導(dǎo)組破骨細(xì)胞TRAP、MMP-9、CATKmRNA和蛋白表達(dá)水平明顯增加，給予不同劑量柚皮素能夠明顯降低RANKL促進(jìn)破骨細(xì)胞特異性基因TRAP、MMP-9、CATKmRNA和蛋白表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，呈劑量依賴性。見表3、4。

組別CATKmRNAMMP-9mRNATRAPmRNA空白對照組0.56±0.080.37±0.060.42±0.05HG-DMEM誘導(dǎo)組1.89±0.27*1.77±0.24*1.80±0.23*HG-DMEM+0.1μmol/L柚皮素組1.50±0.22*#1.40±0.21*#1.46±0.23*#HG-DMEM+1μmol/L柚皮素組1.23±0.18*△1.13±0.15*△1.18±0.16*△HG-DMEM+10μmol/L柚皮素組0.89±0.11*☆0.69±0.10*☆0.70±0.11*☆

注：與空白對照組比較,*P<0.05；與HG-DMEM誘導(dǎo)組比較,#P<0.05；與HG-DMEM+0.1μmol/L柚皮素組比較，△P<0.05；與HG-DMEM+1μmol/L柚皮素組比較,☆P<0.05

組別CATK蛋白MMP-9蛋白TRAP蛋白空白對照組0.43±0.060.28±0.040.36±0.04HG-DMEM誘導(dǎo)組1.70±0.24*1.64±0.22*1.68±0.21*HG-DMEM+0.1μmol/L柚皮素組1.42±0.21*#1.30±0.17*#1.35±0.20*#HG-DMEM+1μmol/L柚皮素組1.08±0.16*△1.01±0.14*△1.04±0.13*△HG-DMEM+10μmol/L柚皮素組0.69±0.10*☆0.56±0.07*☆0.60±0.08*☆

注：與空白對照組比較,*P<0.05；與HG-DMEM誘導(dǎo)組比較,#P<0.05；與HG-DMEM+0.1μmol/L柚皮素組比較，△P<0.05；與HG-DMEM+1μmol/L柚皮素組比較,☆P<0.05

2.4 柚皮素對破骨細(xì)胞OPG、RANKL、RANK表達(dá)的影響 與空白對照組比較，HG-DMEM誘導(dǎo)組破骨細(xì)胞OPGmRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低，RANKL、RANKmRNA和蛋白表達(dá)水平明顯增加，給予不同劑量柚皮素能夠明顯增加OPGmRNA和蛋白表達(dá)水平，降低RANKL、RANKmRNA和蛋白表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，呈劑量依賴性。見表5、6。

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是由于遺傳、環(huán)境、雌激素缺乏等因素導(dǎo)致成骨細(xì)胞合成新骨不足或破骨細(xì)胞吸收舊骨過多的骨平衡過程失衡，最終導(dǎo)致骨骼完整性破壞、骨量減少、骨密度降低[6]。而破骨細(xì)胞生成是骨重建過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[7]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，OPG/RANKL/RANK是成骨細(xì)胞/骨髓間質(zhì)細(xì)胞與破骨細(xì)胞之間的橋梁，在破骨細(xì)胞分化、成熟和骨重建過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其具體機(jī)制為成骨細(xì)胞分泌的RANKL與破骨細(xì)胞表面的RANK結(jié)合能夠誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化、成熟，并抑制破骨細(xì)胞凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)和骨吸收過程。而成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分泌的OPG能夠競爭性拮抗RANKL與RANK結(jié)合，阻斷RANKL/RANK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而導(dǎo)致破骨細(xì)胞分化、成熟障礙。此外，OPG還能阻斷破骨細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞間的相互作用促使破骨細(xì)胞凋亡[8,9]。OPG/RANKL比值升高是破骨細(xì)胞分化、成熟的重要指標(biāo)，也是骨吸收和骨形成保持平衡狀態(tài)的關(guān)鍵。TRAP、MMP-9、CATK是成熟破骨細(xì)胞特異性表達(dá)的基因[10]。TRAP是成熟破骨細(xì)胞和融合前單核細(xì)胞表達(dá)的一種含鐵糖蛋白，其結(jié)構(gòu)高度保守，能夠水解無機(jī)磷酸鹽類和磷酸醋酶，并破壞胞轉(zhuǎn)時(shí)內(nèi)吞噬的基質(zhì)退化物。MMP-9能夠降低細(xì)胞外基質(zhì)成分，參與破骨細(xì)胞向骨表面遷移及骨吸收過程。CATK是破骨細(xì)胞分泌的一種半甘氨酸蛋白酶，具有很強(qiáng)的溶骨活性，在骨吸收過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

組別OPGmRNARANKLmRNARANKmRNA空白對照組1.37±0.220.56±0.080.49±0.06HG-DMEM誘導(dǎo)組0.40±0.06*1.99±0.23*1.78±0.22*HG-DMEM+0.1μmol/L柚皮素組0.59±0.08*#1.67±0.20*#1.37±0.21*#HG-DMEM+1μmol/L柚皮素組0.85±0.12*△1.20±0.18*△1.00±0.15*△HG-DMEM+10μmol/L柚皮素組1.09±0.15*☆0.93±0.12*☆0.68±0.10*☆

注：與空白對照組比較,*P<0.05；與HG-DMEM誘導(dǎo)組比較,#P<0.05；與HG-DMEM+0.1μmol/L柚皮素組比較，△P<0.05；與HG-DMEM+1μmol/L柚皮素組比較,☆P<0.05

組別OPG蛋白RANKL蛋白RANK蛋白空白對照組1.29±0.200.47±0.060.38±0.05HG-DMEM誘導(dǎo)組0.30±0.05*1.81±0.20*1.67±0.21*HG-DMEM+0.1μmol/L柚皮素組0.48±0.05*#1.56±0.18*#1.20±0.18*#HG-DMEM+1μmol/L柚皮素組0.71±0.10*△1.09±0.14*△0.89±0.11*△HG-DMEM+10μmol/L柚皮素組0.93±0.12*☆0.79±0.11*☆0.57±0.07*☆

注：與空白對照組比較,*P<0.05；與HG-DMEM誘導(dǎo)組比較,#P<0.05；與HG-DMEM+0.1μmol/L柚皮素組比較，△P<0.05；與HG-DMEM+1μmol/L柚皮素組比較,☆P<0.05

根據(jù)中醫(yī)腎主骨理論，中醫(yī)藥治療骨質(zhì)疏松癥應(yīng)以補(bǔ)腎藥物為主。孫闖等[11,12]研究表明，淫羊藿苷能夠明顯上調(diào)小鼠骨溶解模型OPGmRNA和蛋白表達(dá)，下調(diào)RANKLmRNA和蛋白表達(dá)，使OPG/RANKL比值升高從而抑制骨吸收。萬雷等[13]研究發(fā)現(xiàn)，骨康含藥血清能夠提高成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞共育體系中OPG/RANKL比值，抑制過度的骨吸收。中草藥骨碎補(bǔ)具有補(bǔ)腎強(qiáng)骨的功效，藥效學(xué)研究表明骨碎補(bǔ)的主要成分柚皮苷對骨質(zhì)疏松癥有一定治療作用。柚皮素是柚皮苷的主要代謝產(chǎn)物，體外實(shí)驗(yàn)表明柚皮素對大鼠成骨細(xì)胞促骨形成活性要優(yōu)于柚皮苷[3,4]。本研究通過觀察柚皮素對破骨細(xì)胞特異性基因TRAP、MMP-9、CATK及OPG/RANKL/RANK表達(dá)的影響，旨在探討柚皮素治療骨質(zhì)疏松癥的具體分子機(jī)制。結(jié)果顯示，柚皮素在HG-DMEM誘導(dǎo)狀態(tài)下能夠明顯降低TRAP陽性細(xì)胞數(shù)、TRAP、MMP-9、CATK、RANKL、RANKmRNA和蛋白，增加OPGmRNA和蛋白表達(dá)(P<0.05)，呈劑量依賴性，提示柚皮素能夠明顯抑制破骨細(xì)胞分化、成熟，促使骨組織向成骨方向發(fā)展。

綜上所述，柚皮素對HG-DMEM誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化、成熟具有拮抗作用，其機(jī)制與上調(diào)OPG、下調(diào)RANKL、RANK表達(dá)有關(guān)。本研究闡明了柚皮素抑制破骨細(xì)胞分化、成熟的可能機(jī)制，這不僅有助于認(rèn)識骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制，還揭示了中藥柚皮素治療骨質(zhì)疏松癥的分子機(jī)制。以O(shè)PG/RANKL/RANK系統(tǒng)為靶點(diǎn)可能為骨質(zhì)疏松癥的臨床治療提供了新方向。

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Effects of naringenin on the expressions of osteoclast specific genes and OPG/RANKL/RANK in osteoclasts

WUXintao,SHIJing,GAOLecai,etal.

DepartmentofOsteology,IntegratedTCMandWesternMedicineHospitalofCangzhouCity,Hebei,Cangzhou061001,China

Objective To observe the effects of naringenin on the expressions osteoclast specific genes-CATK,MMP-9,TRAP and OPG/RANKL/RANK in osteoclasts.Methods The osteoclasts were cultured by whole bone marrow cells induction method.The experiment was divided into 5 groups:blank control group,HG-DMEM induction group,HG-DMEM+naringenin (0.1μmol/L) group,HG-DMEM+naringenin (1μmol/L) group and HG-DMEM+naringenin (10μmol/L) group. After HE and TRAP stainings, the cell morphous was observed under inverted microscope. The TRAP positive cell number was detected by spectrophotometer. The expression levels of CATK, MMP-9,TRAP as well as OPG/RANKL/RANK mRNA and protein were detected by Real time-PCR and Western Blot.Results As compared with those in blank control group, the TRAP positive cell number and the expression levels of TRAP,MMP-9,CATK,RANKL,RANK mRNA and protein were significantly increased in HG-DMEM induction group,however, the expression levels of OPG mRNA and protein were significantly decreased (P<0.05).AscomparedwithHG-DMEMinductiongroup,after24-hourpretreatment,naringenincouldobviouslydecreaseTRAPpositivecellnumberandtheexpressionlevelsofCATK,MMP-9,TRAP,RANKL,RANKmRNAandprotein,andcouldincreasetheexpressionlevelsofOPGmRNAandprotein,withadose-dependentway(P<0.05).Conclusion Naringenin can inhibit the generation and differentiation of osteoclasts,and the action may be realized by regulating OPG/RANKL/RANK signal transduction pathway to inhibit the expressions of TRAP, MMP-9,CATK.

naringenin; osteoclast; OPG/RANKL/RANK signal transduction pathway

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.02.001

項(xiàng)目來源：河北省中醫(yī)藥管理局科研計(jì)劃項(xiàng)目(編號:2016267)

061001 河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科

R

A

1002-7386(2017)02-0165-04

2015-11-11)