UPLC同時測定雙黃連粉針劑中黃芩苷、綠原酸、連翹苷成分的含量

張丹丹，馮程，顧媛媛，譚福柱，陳大忠*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，黑龍江 哈爾濱 150040; 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

UPLC同時測定雙黃連粉針劑中黃芩苷、綠原酸、連翹苷成分的含量

張丹丹1，馮程1，顧媛媛1，譚福柱2，陳大忠1*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，黑龍江 哈爾濱 150040; 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的:建立超高效液相色譜法同時檢測雙黃連粉針劑中黃芩苷、連翹苷、綠原酸三種成分含量的測定方法。方法:采用Acquity UPLC TM BEH C18柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，乙腈-0.1%甲酸為流動相進行梯度洗脫，柱溫為40℃，流速為0.3 ml/min。結(jié)果:黃芩苷、連翹苷、綠原酸分別在1.021 6～10.216、0.611 8～6.118、0.402 4～4.024 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)分別為0.999 6、0.999 3、0.999 5，3種成分平均回收率均符合含量測定要求。結(jié)論:本法高速、準(zhǔn)確、簡單易行，已成功用于實際樣品的分析，可為雙黃連粉針劑的質(zhì)量控制提供參考方法。

雙黃連粉針劑;超高效液相色譜法;黃芩苷;連翹苷;綠原酸;含量測定

雙黃連粉針劑(凍干)是由黃芩、金銀花、連翹等中藥提取純化經(jīng)噴霧干燥制成的粉針劑，具有清熱解毒，輕宣透邪的功效，在臨床上經(jīng)常加入適當(dāng)溶媒供靜脈注射使用，現(xiàn)已廣泛用于肺炎、扁桃體炎、上呼吸道感染、急性腎盂腎炎、急性膽囊炎、小兒腸炎、嬰幼兒肺炎、流感病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒三型感染等多種疾?。?-2］。然而雙黃連粉針劑是個復(fù)雜組群，還有很多化合物存在同系物或同分異構(gòu)體的形式，普通的分析方法不足以有效控制其質(zhì)量?！吨袊幍洹吠ㄟ^3種獨立的HPLC-UV法分別測定雙黃連粉針劑中黃芩苷、連翹苷、綠原酸的含量，但連翹苷則必須需要經(jīng)氧化柱等處理，整個過程很麻煩。制劑現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了測定綠原酸、黃芩苷的含量，但是沒有連翹的含量指標(biāo)顯示。想要測定的這兩種成分卻必須要采用不同的流動相系統(tǒng)分別進行檢測，實際操作也比較麻煩，工作效率較低。我們采用UPLC法進行梯度洗脫同時聯(lián)合多波長檢測同時對其中含量相對較高的三種成分進行含量測定，為高效控制和評價雙黃連粉針劑的質(zhì)量提供有效的方法。

高效液相色譜法［3-5］具有易操作、靈敏度和穩(wěn)定性高等特點，但存在溶劑用量大，耗時長等缺點。UPLC是近幾年推出的一種新的液相色譜技術(shù)，作為中藥成分分析中定性和定量的有力工具，具有分析速度和分辨率高，專屬性強，定性能力強等優(yōu)點，較常規(guī)HPLC有了較大的提升，較好地分離效率、峰容量及靈敏度，顯著縮短分析時間并減少溶劑損耗，使其更適合于藥物復(fù)方制劑及復(fù)雜樣品的分析研究。

1 儀器與試藥

美國Waters Acquity UPLCTM超高效液相色譜儀(包括在線真空脫氣機、自動進樣器、四元梯度泵、二極管陣列檢測器和柱溫箱);MassLynx V4.1色譜工作站;JA-2003精密電子天平(上海市良平儀器廠); KH-300E型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)。

連翹苷對照品(批號110821-201213，供含量測定用)、黃芩苷對照品(批號110715-201314，供含量測定用)、綠原酸對照品(批號110753-201314，供含量測定用)均購自中國食品藥品檢定研究院;雙黃連粉針劑(哈藥集團中藥二廠，規(guī)格:600 mg/支，批號1409419、1409418、1409417、1409416、1409415、1409414、1409413、1409410、1409407、1409406);甲酸(色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司);乙腈(色譜純，美國Fisher公司);水為屈臣氏蒸餾水;其他化學(xué)試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜 柱為 ACQUITY UPLCTMBEH C18柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm);流動相A為乙腈，流動相B為0.1%甲酸水，流速為0.3 mL/min;柱溫為40℃;進樣量:3 μL;進行梯度洗脫(見表1)。

2.2 溶液的制備

表1 梯度洗脫表

2.2.1 對照品溶液的制備

分別精密稱取黃芩苷、連翹苷、綠原酸對照品適量，用50%的甲醇溶解定容于10 mL的棕色容量瓶中，制得對照品溶液(貯備溶液);精密量取綠原酸、連翹苷、黃芩苷對照品，加入50%甲醇溶液分別制成每1 mL含綠原酸40 μg、連翹苷60 μg、黃芩苷100 μg的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

從每批藥品中隨機取本品5支，混勻，量取本品50 mg，精密稱定，加入50%的甲醇溶液20 ml，置于25 mL的具塞錐形瓶中超聲處理20 min，補足重量，用50%的甲醇定容于 25 mL容量瓶中，搖勻，再過0.22 μm的微孔濾膜，即得。

2.3 系統(tǒng)性試驗

在“2.1“項下色譜條件，黃芩苷，綠原酸，連翹苷的理論塔板數(shù)均大于2 500，各個指標(biāo)的成分也分離的較好。色譜圖見圖1～2。

圖1 混合對照品溶液的UPLC色譜圖

圖2 供試品溶液的UPLC色譜圖

2.4 線性考察

分別精密量取上述混合對照品貯備溶液1、2、4、6、8、10 mL分別置于10 mL容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件，分別進樣10 μL。記錄色譜圖，分別以峰面積(Y)作為縱坐標(biāo)，對照品進樣量(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算相應(yīng)的回歸方程，見表2。

表2 各組分線性回歸方程

2.5 精密度試驗

取同一批次供試品溶液(批號1409407)，按“2.1”項下色譜條件，“2.2.2”項下制備供試品溶液的方法，連續(xù)進樣6次，每次5 μL，記錄各峰面積，分別計算其RSD值，結(jié)果黃芩苷、連翹苷和綠原酸峰面積的RSD值分別為1.72%、2.02%、2.34%，表明儀器具有良好的精密度。

2.6 重復(fù)性試驗

取供試品雙黃連粉針劑(批號1409407)，精密稱定6份，每份約 20 mg，按“2.1”項下色譜條件，“2.2.2”項制備供試品溶液的方法，分別進樣5 μL，連續(xù)進樣6次，計算各成分含量，黃芩苷、連翹苷和綠原酸含量的RSD值分別為1.45%、1.98%、2.26%，表明該方法具有良好的的重復(fù)性。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液(批號1409407)，分別于0、2、4、6、8、12、24 h內(nèi)進樣，按“2.1”項下色譜條件，“2.3”項制備供試品溶液的方法，分別進樣5 μL，記錄各峰面積，黃芩苷、連翹苷和綠原酸峰面積的RSD值分別為1.33%、1.81%、2.12%，表明該方法具有較好的穩(wěn)定性。

2.8 回收率試驗

取雙黃連粉針劑(批號1409407)粉末10 mg，精密稱定，分別置于10 mL容量瓶中，加入適量的對照品溶液，按“2.2.2”項下制備供試品溶液的方法，平行制備6份供試品溶液，每次進樣5 μL，計算回收率，見表3。

表3 加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)

2.9 樣品測定方法

分別精密吸取供試品溶液與對照品溶液各10 μL按“2.1”項下色譜條件，“2.2.2”項下制備供試品溶液的方法，注入超高效液相色譜儀進行檢測，根據(jù)色譜圖按外標(biāo)兩點法計算其含量，結(jié)果見表4。

表4 樣品含量測定結(jié)果(mg/支，n=3)

3 結(jié)果與討論

在通過比較洗脫效果及酸度影響的考察中，發(fā)現(xiàn)乙腈具有良好的洗脫效果，而且當(dāng)甲酸的濃度為0.1%時色譜峰的峰型較滿意，故流動相選擇乙腈-0.1%甲酸進行試驗。在考察色譜條件時，選用了既能縮短分離時間，又能提高分離效果的梯度洗脫方法，進行試驗。在試驗中發(fā)現(xiàn)，由于水溶液的穩(wěn)定性差，存在含量衰減的現(xiàn)象，在換用50%甲醇［6］時，發(fā)現(xiàn)衰減現(xiàn)象消失，置于室溫下，可放置72 h符合檢測的要求。在對溶劑的考察中，發(fā)現(xiàn)對50%的甲醇通過超聲處理和加熱回流處理的提取效果基本無差異，考慮節(jié)約時間等因素，所以采用了50%的甲醇超聲處理20 min。

本文建立了快速、簡便的方法，用超高效液相色譜同時測定雙黃連粉針劑中黃芩苷，綠原酸、連翹苷三種藥效成分含量，有機溶劑消耗較少，分析時間縮短為普通高效液相色譜的1/3，既減少了環(huán)境污染，又降低了成本。本法適用于雙黃連粉針劑三種成分的高效快速測定，可以為雙黃連的質(zhì)量控制和藥物療效、化合物含量研究、藥代動力學(xué)等相關(guān)研究提供新的參考方法和科學(xué)依據(jù)。

［1］張潔，馬百平，趙陽，等.雙黃連粉針劑指紋圖譜中特征峰的組成藥味歸屬及定性［J］.中成藥，2005，27(12):1365-1369.

［2］曲敬來，高雪，陳生，等.雙黃連凍干粉劑鼻腔沖洗在上氣道咳嗽綜合征治療中的應(yīng)用［J］.中醫(yī)藥學(xué)報，2015，43(6):79-81.

［3］趙麗芬，韓省力.高效液相色譜法測定雙黃連粉針劑中黃芩苷的含量［J］.中醫(yī)藥信息，2015，32(6):31-33.

［4］筆雪艷，王憲平，張清波，等.HPLC-UV-ELSD聯(lián)用法測定雙黃連系列制劑中連翹含量并同時檢查山銀花［J］.藥物分析雜志，2014，34(1):104-107.

［5］梁軍，楊琦，夏永剛，等.雙黃連口服液的HPLC指紋圖譜研究［J］.中醫(yī)藥學(xué)報，2013，41(6):24-25.

［6］孫永慧，李文春.HPLC同時測定雙黃連粉針劑中5種成分的含量［J］.中成藥，2010，32(1):65-68.

Simultaneous Determination of Baicalin，Chlorogenic Acid，F(xiàn)orsythin in Shuanghuanglian Powder Injection by UPLC

ZHANG Dan-dan1，F(xiàn)ENG Cheng1，GU Yuan-yuan1，TAN Fu-zhu2，CHEN Da-zhong1*
(1.Research Institute of Chinese Medicine，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China; 2.The First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China)

Objective:To establish a rapid UPLC method for simultaneously determining baicalin，phillyrin，chlorogenic acid in Shuanghuanglian powder for injection.Methods:UPLC assay was carried out by using the Acquity UPLCTMBEH C18 column(2.1 mm×50 mm，1.7 μm).The mobile phase was acetonitrile-0.1% formic acid，solution for gradient elution.The column temperature was 40℃.The flow rate was 0.3 ml/min.Results:The linear ranges of baicalin，forsythin and chlorogenic acid in the range of 1.021 6～10.216，0.611 8～6.118，0.402 4～4.024 μg/mL respectively.The three components showed a good linear correlations(r=0.999 6，0.999 3，0.999 5).The average recoveries of three components are in line with the requirement of determination.Conclusion:The method is efficient，accurate and simple，and has been used for the analysis of real samples successfully，which can provide a reference for the quality control of Shuanghuanglian powder for injection.

Shuanghuanglian powder-injection;UPLC;Baicalin;Phillyrin;Chlorogenic acid;Content determination

R28

A

1002-2406(2017)02-0039-03

黑龍江省應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)計劃項目(No.GC13C109);“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項-雙黃連粉針劑技術(shù)改造(No.2011ZX09201-201-15)

張丹丹(1991-)，女，碩士，主要研究方向:中藥物質(zhì)基礎(chǔ)成分研究和新藥研究。

陳大忠*(1970-)，男，研究員，碩士研究生導(dǎo)師，主要研究方向:中藥物質(zhì)基礎(chǔ)成分研究和新藥研究。

2016-02-20

修回日期:2016-03-10