杏鮑菇與白靈菇紅斑病病原菌拮抗菌的篩選與鑒定*

榮成博，胡 杰，楊永利，趙 爽，王守現(xiàn)，馬 康，黃晨陽(yáng)，劉 宇

（1.北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所，北京市食用菌工程技術(shù)研究中心，北京100097；

2.農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)（北方）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100097；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京100081）

杏鮑菇與白靈菇紅斑病病原菌拮抗菌的篩選與鑒定*

榮成博1，2，胡 杰1，2，楊永利1，2，趙 爽1，2，王守現(xiàn)1，2，馬 康1，2，黃晨陽(yáng)3**，劉 宇1，2

（1.北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所，北京市食用菌工程技術(shù)研究中心，北京100097；

2.農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)（北方）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100097；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京100081）

篩選并鑒定杏鮑菇和白靈菇紅斑病病原菌的拮抗菌，為該病的生物防治提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。通過(guò)牛津杯法篩選拮抗菌，并通過(guò)16s rDNA分析進(jìn)行拮抗菌鑒定。結(jié)果表明，篩選到杏鮑菇紅斑病病原菌的拮抗菌1株，為GL110，白靈菇紅斑病病原菌的拮抗菌2株，分別為GL110和GL52。GL110鑒定為類芽孢桿菌屬細(xì)菌，GL52鑒定為貪銅屬細(xì)菌。

杏鮑菇；白靈菇；紅斑病；拮抗菌

杏鮑菇（Pleurotus eryngii）和白靈菇（Pleurotus nebrodensis）美味可口，營(yíng)養(yǎng)豐富，并具有一定的藥用價(jià)值，是我國(guó)的珍稀食用菌品種。隨著杏鮑菇和白靈菇工廠化、周年化生產(chǎn)的迅猛發(fā)展，其病害逐年增多并加重，嚴(yán)重制約食用菌產(chǎn)業(yè)的持續(xù)、健康、穩(wěn)定發(fā)展，近年來(lái)紅斑病成為杏鮑菇和白靈菇栽培的新興病害，目前并無(wú)防治手段。Xu等[1]2014年首次報(bào)道了北京房山工廠化車間的杏鮑菇紅斑病，鑒定其病原菌為對(duì)稱擲孢酵母（Sporobolomyces symmetricus）。Wang等[2]2015年首次報(bào)道了北京地區(qū)白靈菇紅斑病，其病原菌為粘紅酵母（Rhodotorula glutinis）。

近年來(lái)，生物防治在多種植物病害防治的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，該方法具有環(huán)境友好、無(wú)污染的優(yōu)點(diǎn)。如土壤或者植物根際引入生防微生物能防治馬鈴薯黑痣病等多種土傳病害[3]，利用拮抗菌來(lái)控制小麥赤霉病具有很好的防治效果。目前，在食用菌病害防治方面上并無(wú)任何生物防治的研究。本研究篩選并鑒定了杏鮑菇和白靈菇紅斑病病原菌的拮抗菌，以其為紅斑病的生物防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

供試病原菌和供試拮抗菌由北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所保存。

1.1.2 試劑

pMD19-T Vector購(gòu)于Takara公司，PCR試劑（2×Taq PCR MasterMix） 購(gòu)于北京艾德萊生物科技有限公司，蛋白胨、酵母粉購(gòu)于Oxoid公司。氯化鈉、磷酸二氫鉀等其他試劑為分析純，購(gòu)于北京化工廠。

1.1.3 儀器與設(shè)備

HYG-A全溫?fù)u瓶柜，太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；YXQ-LS-30SLL立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；生物安全柜，Thermo公司。1.1.4 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g·L-1、酵母粉5 g·L-1、氯化鈉10 g·L-1，pH7.2～7.4。

綜合PDB液體培養(yǎng)基：將去皮片狀的馬鈴薯200 g在1 L水中煮沸30 min，16層紗布過(guò)濾，收集濾液并與葡萄糖20 g、蛋白胨5 g、磷酸二氫鉀3 g、硫酸鎂1.5 g、維生素B110 mg混勻后加水定容至1 L，錐形瓶分裝后115℃滅菌30 min。

綜合PDA培養(yǎng)基：PDB培養(yǎng)基中加入20 g·L-1瓊脂粉。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌的篩選

菌液的制備：將病原菌接種于20 mL綜合PDB液體培養(yǎng)基中，28℃、200 r·min-1培養(yǎng)3 d；供試拮抗菌共40個(gè)，接于3mL LB液體培養(yǎng)基中，28℃、200 r·min-1搖床培養(yǎng)2 d。

拮抗菌的初篩：將病原菌菌液分別加到融化的綜合PDA培養(yǎng)基（45℃～50℃）中混勻，接菌量為培養(yǎng)基的1%～2%；將混勻的培養(yǎng)基分別倒入平皿中；待培養(yǎng)基完全冷卻后用打孔器在培養(yǎng)基邊緣均勻打10個(gè)孔并編號(hào)，將培養(yǎng)好的拮抗菌菌液400 μL分別加入打好的孔中。將培養(yǎng)基置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d觀察透明圈。

拮抗菌的復(fù)篩：采用牛津杯法，將20 mL滅菌的培養(yǎng)基加熱溶解倒入平皿中，待其完全冷卻，在邊緣中等距離均勻放置牛津杯；再加熱溶解20 mL培養(yǎng)基，待其冷卻至45℃～50℃，加入40 μL培養(yǎng)好的菌液混勻后倒入平皿。待培養(yǎng)基完全冷卻，在牛津杯中分別加入待篩的拮抗菌，25℃恒溫培養(yǎng)3 d～4 d觀察。

1.2.2 拮抗菌的鑒定

取1 μL菌液做為模版，以16s8F（5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’）和16s1492R（5’-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’） 為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，連接到pMD19-TVector后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白篩選后挑陽(yáng)性克隆送北京中美泰和公司測(cè)序。將菌株16s基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知相關(guān)序列進(jìn)行比對(duì) (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi），采用MEGA5構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。采用Kimura2-parameter算法計(jì)算遺傳距離，用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，重復(fù)抽樣1 000次分析系統(tǒng)數(shù)各分枝的信任度。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌的篩選

GL52、GL110菌株對(duì)粘紅酵母、對(duì)稱擲孢酵母的抑制作用見(jiàn)圖1。

圖1 GL52、GL110菌株對(duì)粘紅酵母、對(duì)稱擲孢酵母的抑制作用Fig.1 The antagonism of strain GL52、GL110 against Rhodotorula glutinis and Sporobolomyces symmetricus

經(jīng)過(guò)初篩和復(fù)篩的兩輪篩選，產(chǎn)生透明圈的為能夠抑制病原菌生長(zhǎng)的拮抗菌，對(duì)白靈菇病原菌（粘紅酵母） 有明顯抑制作用的菌株為 GL52、GL110；能夠明顯抑制杏鮑菇病原菌-對(duì)稱擲孢酵母的菌株為GL110。拮抗菌復(fù)篩結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知GL52和GL110對(duì)粘紅酵母的抑菌圈直徑分別為32.30 mm和31.17 mm；GL110對(duì)對(duì)稱擲孢酵母的抑菌圈直徑為17.36 mm。

表1 拮抗菌復(fù)篩結(jié)果Tab.1 The results of antagonistic screening

2.2 拮抗菌株的鑒定結(jié)果

2.2.1 拮抗菌株GL110的鑒定

以16S rDNA序列為基礎(chǔ)的GL110菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖2。

PCR擴(kuò)增GL110菌株的16S rDNA序列，連接到pMD19-T vector上并測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上用BLAST程序進(jìn)行比對(duì)，選取相似性較高的菌株，用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果表明，該菌株與Paenibacillus屬菌株的遺傳關(guān)系最近。

圖2 以16S rDNA序列為基礎(chǔ)的GL110菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of the strain GL110 based on 16S rDNA sequence

2.2.2 拮抗菌株GL52的鑒定

以16S rDNA序列為基礎(chǔ)的GL52菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖3。

參照1.2.2方法進(jìn)行GL52菌株鑒定，圖3結(jié)果表明GL52菌株與Cupriavidus屬菌株遺傳關(guān)系最近。

3 討論和結(jié)論

紅斑病是杏鮑菇和白靈菇栽培中的新興病害，若不及時(shí)處理會(huì)形成更嚴(yán)重的污染和擴(kuò)散，影響食用菌的產(chǎn)量，給企業(yè)造成巨大的損失。2014年Xu等[1]首次對(duì)該病進(jìn)行了報(bào)道，目前并無(wú)該病的任何防治手段。拮抗菌為主的生物防治在植物病害防治方面研究較多，如解淀粉芽孢桿菌對(duì)小麥赤霉病的防治效果高達(dá)79%～88%[5]，放線菌FX-03對(duì)番茄早疫病的防治效果達(dá)到了75%以上[6]。

本研究首次對(duì)杏鮑菇和白靈菇的病原菌進(jìn)行了拮抗菌篩選，共篩選到了2株抑制白靈菇病原菌生長(zhǎng)的拮抗菌GL110和GL52，1株抑制杏鮑菇病原菌生長(zhǎng)的拮抗菌GL110。對(duì)GL110和GL52分別進(jìn)行了16SrDNA測(cè)序和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建，結(jié)果表明GL110與類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）同源關(guān)系最近，GL52與貪銅屬（Cupriavidus）具有較高同源性。已有報(bào)道多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）和貪銅屬（Cupriavidus） 具有抑制植物病原菌的活性[7-8]。

圖3 以16S rDNA序列為基礎(chǔ)的GL52菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of the strain GL52 based on 16S rDNA sequence

[1]Xu F,Wang S,Liu Y,et al.First report of Sporobolomyces symmetricus induced red spot disease of Pleurotus eryngii in China[J].Plant Disease,2014,98 (5):693.

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Isolation and Identification of Antagonistic Strains Against Red spot Disease of Pleurotus eryngii and Pleurotus nebrodensis

RONG Cheng-bo1,2,HU Jie1,2,YANG Yong-li1,2,ZHAO Shuang1,2,WANG Shou-xian1,2, MA Kang1,2,HUANG Chen-yang3,LIU Yu1,2
(1.Institute of Plant and Environment Protection,Beijing Academy of Agriculture and Forestry Science,Beijing Engineering Research Center for Edible Mushroom,Beijing 100097,China;2.Key Laboratory of Urban Agriculture(North),Ministry of Agriculture,Beijing 100097,China;3.Institute of Agricultural Resources and Regional Planning,CAAS,Beijing 100097,China)

Isolation and identification of antagonistic strains against red spot disease of Pleurotus eryngii and Pleurotus nebrodensis could provided the experimental evidence for biological control of the disease.The antagonistic strains against red spot disease of P.eryngii and P.nebrodensis were isolated and identified by oxford cup tests and the analysis on 16s rDNA.The results showed that a strain GL110 with inhibitory activity against P.eryngii pathogen,and the strains GL110 and GL52 displayed antagonistic activities against P.nebrodensis pathogen.GL110 and GL52 were identified as Cupriavidus respectively.

Pleurotus eryngii;Pleurotus nebrodensis;red spot disease;antagonistic strains

S646.9

A

1003-8310（2017）02-0056-04

10.13629/j.cnki.53-1054.2017.02.015

國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題食用菌生產(chǎn)質(zhì)量安全控制關(guān)鍵技術(shù)研究 （2013BAD16B03）；北京市優(yōu)秀人才培養(yǎng)資助計(jì)劃（2015000020060G138）；北京市農(nóng)林科學(xué)院青年基金項(xiàng)目 (QNJJ201524)。

榮成博（1981-），女，博士，助理研究員，主要從事食用菌病害和遺傳研究。E-mail:woshiboer@163.com

**通信作者：黃晨陽(yáng)（1977-），男，博士，副研究員，主要從事食用菌遺傳育種和菌種質(zhì)量檢測(cè)工作。E-mail:huangchenyang@caas.cn

2017-01-12