乳香沒藥揮發(fā)油對川芎體外透皮吸收的影響及其皮膚血流促透機(jī)制研究

朱小芳+羅晶+管詠梅+余雅婷+金晨+朱衛(wèi)豐+劉紅寧

[摘要] 該文擬探索乳香、沒藥揮發(fā)油對川芎體外透皮吸收的影響，并從皮膚血流變化角度探討乳香、沒藥揮發(fā)油可能的促透機(jī)制。通過改良的Franz擴(kuò)散池和離體的小鼠皮進(jìn)行體外透皮實(shí)驗(yàn)，HPLC測定川芎阿魏酸的累積透過量，考察乳香、沒藥揮發(fā)油對川芎透皮特性的影響，同時，采用激光多普勒法測定皮膚血流量。研究結(jié)果顯示，川芎阿魏酸24 h的累積透皮量為（8.13±0.76） μg·cm-2，氮酮組、乳香組、沒藥組、乳沒單提混合組、乳沒混合提取組分別為（48.91±4.87），（57.80±2.86），（63.34±4.56），（54.17±4.40），（62.52±7.79） μg·cm-2，各組揮發(fā)油的增透倍數(shù)分別為7.68，8.26，7.26，8.28，均大于氮酮組的6.55。而且，乳香組、沒藥組、乳沒單提混合組及乳沒混合提取組大鼠分別在涂藥10，20，30，10 min時，血流量相比涂藥前有顯著性差異，有明顯的增加趨勢，表明乳香、沒藥揮發(fā)油可在一定程度上增加皮膚血流量?？芍?，乳香、沒藥揮發(fā)油配伍前后對川芎均有一定的促透作用，且可能通過增加皮膚血流量，促進(jìn)藥物從皮膚表皮到真皮層毛細(xì)血管的消除，從而實(shí)現(xiàn)促透。

[關(guān)鍵詞] 川芎； 乳香沒藥； 揮發(fā)油； 透皮吸收； 皮膚血流； 促透機(jī)制

[Abstract] The aim of this paper was to explore the effects of Frankincense and Myrrh essential oil on transdermal absorption in vitro of Chuanxiong， and to investigate the possible penetration mechanism of their essential oil from the perspective of skin blood perfusion changes. Transdermal tests were performed in vitro with excised mice skin by improved Franz diffusion cells. The cumulative penetration amounts of ferulic acid in Chuanxiong were determined by HPLC to investigate the effects of Frankincense and Myrrh essential oil on transdermal permeation properties of Chuanxiong. Simultaneously， the skin blood flows were determined by laser flow doppler. The results showed that the cumulative penetration amount of ferulic acid in Chuanxiong was （8.13±0.76） μg·cm-2 in 24 h， and was （48.91±4.87）， （57.80±2.86）， （63.34±4.56）， （54.17±4.40）， （62.52±7.79） μg·cm-2 respectively in Azone group， Frankincense essential oil group， Myrrh essential oil， frankincense and myrrh singly extracted essential oil mixture group， and frankincense and myrrh mixed extraction essential oil group. The enhancement ratios of each essential oil groups were 7.68， 8.26， 7.26， 8.28， which were slightly greater than 6.55 in Azone group. In addition， as compared with the conditions before treatment， there were significant differences and obvious increasing trend in blood flow of rats in Frankincense essential oil group， Myrrh essential oil group， frankincense and myrrh singly extracted essential oil mixture group， and frankincense and myrrh mixed extraction essential oil group when were dosed at 10， 20， 30， 10 min respectively， indicating that the skin blood flows were increased under the effects of Frankincense and Myrrh essential oil to a certain extent. Thus， Frankincense and Myrrh essential oil had certain effect on promoting permeability of Chuanxiong both before and after drug combination， and may promote the elimination of drugs from epidermis to dermal capillaries through increase of skin blood flow， thus enhancing the transdermal permeation amounts of drugs.

[Key words] Chuanxiong； Frankincense and Myrrh； essential oil； transdermal absorption； skin blood flow； penetration mechanism

中藥經(jīng)皮給藥可發(fā)揮局部或全身治療作用，早在漢代《五十二病方》中，就有“藥浴法”治療小兒“子癲”的記載，清代外治專著《理瀹駢文》幾乎把一切見聞的病都用膏藥治療，表明中藥經(jīng)皮給藥運(yùn)用的悠久歷史與重要地位[1]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用透皮吸收促進(jìn)劑可改善藥物透皮吸收，且中藥揮發(fā)油大多具有良好的透皮吸收促進(jìn)效果。改變皮膚角質(zhì)層結(jié)構(gòu)組成是目前公認(rèn)的中藥揮發(fā)油皮膚促透機(jī)制[2-3]，也有研究者認(rèn)為可通過促進(jìn)皮膚血流來實(shí)現(xiàn)促透效果[4]。

川芎味辛、性溫，具“活血行氣，祛風(fēng)止痛”功效，阿魏酸是其中一個主要有效成分，具抗氧化、抗菌消炎、抗血栓、抗腫瘤等多種藥理活性，其pH穩(wěn)定性好、相對分子質(zhì)量小、親脂性強(qiáng)、透皮滲透性能好，醫(yī)藥、保健品、化妝品等行業(yè)有較高的應(yīng)用價值[5]。川芎以經(jīng)皮給藥系統(tǒng)給藥可避免口服的肝臟“首過效應(yīng)”，并可維持穩(wěn)定而持久的血藥濃度。在中醫(yī)外治處方中川芎常與乳香、沒藥配伍，廣泛應(yīng)用于心血管疾病、風(fēng)濕痹痛、月經(jīng)不調(diào)、跌撲腫痛等治療中[6]。乳香、沒藥以揮發(fā)油類成分為主，因此研究乳香、沒藥揮發(fā)油對川芎的促透作用及其機(jī)制或可闡述其配伍意義。

本研究從經(jīng)皮滲透的角度，研究川芎提取物阿魏酸的經(jīng)皮滲透特性，比較川芎與乳香、沒藥配伍前后阿魏酸的透皮量變化，探索乳香、沒藥對川芎透皮吸收的影響，并從皮膚血流變化角度闡述其促透機(jī)制，為外用復(fù)方制劑配伍研究提供新思路。

1 材料

TT-6D 型藥物透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀（天津市正通科技有限公司，配套改良Franz擴(kuò)散池）；Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Moor VMS型激光多普勒血流與溫度檢測儀（英國Moor Instruments 公司）；ESJ182-4型電子分析天平（1/10萬沈陽龍騰電子有限公司）；XW-80A渦旋混合器（上海青浦滬西儀器廠）；KQ3200E型超聲波清洗器（昆明市超聲儀器有限公司）。

乳香飲片（批號150914，產(chǎn)地云南）、沒藥飲片（批號151227，產(chǎn)地云南）、川芎飲片（批號150805，產(chǎn)地四川），均購自江西樟樹藥材市場，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室鄧可眾教授鑒定為正品；乳香、沒藥揮發(fā)油采用2010年版《中國藥典》附錄揮發(fā)油提取甲法提取，得淡黃油狀溶液，無水硫酸鈉脫水后密封避光保存。

阿魏酸（純度>98%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號151103）；1，2-丙二醇（西隴化工股份有限公司，批號151123）；冰醋酸（西隴科學(xué)股份有限公司，批號160517），甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

健康雄性KM小鼠，體重（20±2） g，健康雄性SD大鼠，體重（200±20） g，均購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，許可證號SCXK（湘）2013-0004。

2 方法

2.1 樣品的制備

2.1.1 川芎溶液制備 取川芎藥材適量，加8倍量80%乙醇，提取3次，每次2 h，合并濾液，減壓回收乙醇，濃縮，減壓干燥；精密稱取川芎提取物適量，加1，2-丙二醇-蒸餾水（80∶20）溶劑系統(tǒng)超聲溶解完全，即得。

2.1.2 實(shí)驗(yàn)用藥制備 分別取適量乳香揮發(fā)油、沒藥揮發(fā)油、乳沒單提等體積混合揮發(fā)油、乳沒等重混合提取揮發(fā)油、氮酮于10 mL量瓶中，加川芎溶液溶解定量至刻度線，超聲并渦旋使揮發(fā)油充分分散，即得。

2.2 HPLC測定川芎阿魏酸含量

2.2.1 色譜條件 菲羅門C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈-l%醋酸溶液（20∶80），流速1.0 mL·min-1，檢測波長為321 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL，阿魏酸的相對保留時間約為12.00 min，理論塔板數(shù)阿魏酸峰計算不低于5 000。

2.2.2 方法學(xué)考察 配制阿魏酸對照品溶液、體外透皮試驗(yàn)空白接受液及川芎提取物體外透皮試驗(yàn)接受液，考察方法專屬性、線性關(guān)系、精密度及加樣回收率、穩(wěn)定性。專屬性見圖1，接受液中其他成分對川芎阿魏酸的測定無干擾，阿魏酸在0.123～12.3 mg·L-1線性關(guān)系良好（Y=63.524X-2.062 6，r=0.999 9），低、中、高3個質(zhì)量濃度（0.123，2.46，12.3 mg·L-1）的日內(nèi)精密度分別為0.96%，0.18%，0.37%，日間精密度分別為2.3%，0.51%，1.9%，加樣回收率分別為103.8%，99.35%，95.71%；川芎提取物體外透皮試驗(yàn)接受液的含量測定，2日內(nèi)RSD為0.81%。

2.3 體外透皮研究

2.3.1 離體小鼠腹皮的制備 小鼠頸椎脫臼處死，剝離取下腹部去毛后皮膚，小心除去皮下脂肪及粘連物，生理鹽水漂洗至無渾濁，濾紙吸干，置于錫箔紙上，-20 ℃保存，于實(shí)驗(yàn)前1 d取出，自然解凍。

2.3.2 川芎體外透皮研究 采用改良的 Franz擴(kuò)散池，容積為5.0 mL，有效擴(kuò)散面積為0.64 cm2，將處理好的皮膚置于擴(kuò)散池上，真皮層面向接受池，表皮層面向供給池，夾緊，置于（37±0.5） ℃水浴中，加入轉(zhuǎn)子（轉(zhuǎn)速100 r·min-1）。準(zhǔn)確移取2 mL供給液，注入供給池中，接受池中準(zhǔn)確加入30%無水乙醇的生理鹽水，在0.5，1，2，4，6，8，10，12，24 h時取樣1 mL，補(bǔ)加等體積新鮮接收液，所得樣品以0.22 μm微孔濾膜過濾，測定阿魏酸含量。

2.4 皮膚血流量

2.4.1 動物分組與給藥 將SD大鼠編號隨機(jī)分為5組，分別為溶劑基質(zhì)組、乳香組、沒藥組、乳沒單提混合組、乳沒混合提取組（每組為1，2-丙二醇-蒸餾水80∶20溶劑系統(tǒng)配制的3%乳香、沒藥揮發(fā)油樣品處理）。大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，電動剃毛器剔除耳局部毛發(fā)，并使大鼠適應(yīng)恒溫實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度30 min，使體表溫度與室溫平衡。恒溫實(shí)驗(yàn)室的溫度控制在29～30 ℃，實(shí)驗(yàn)前后溫度變化不超過1 ℃。實(shí)驗(yàn)時分別給各組大鼠耳內(nèi)側(cè)皮膚等面積均勻涂布等體積相應(yīng)揮發(fā)油樣品。

2.4.2 激光多普勒血流儀檢測 實(shí)驗(yàn)開始，受試大鼠取俯臥位，平伸并固定四肢，從表面尋找大鼠耳局部血管，固定激光多普勒血流檢測探頭于大鼠耳外側(cè)，給藥前后儀器示數(shù)均穩(wěn)定5 min后開始記錄數(shù)據(jù)，給藥前連續(xù)監(jiān)測30 min基礎(chǔ)血流值。給藥后每10 min記錄1次，取平均值，共監(jiān)測觀察至60 min處。保持給藥前后檢測位點(diǎn)不變。

2.5 數(shù)據(jù)處理與分析

2.5.1 體外透皮數(shù)據(jù) 根據(jù)如下公式計算各個時間點(diǎn)的阿魏酸累計透過量。

Qn=VCn+∑n-1i=1CiViA

式中A為有效經(jīng)皮吸收面積，V為接受液體積，Vi為取樣體積，Cn為第n個取樣點(diǎn)測得的接受液中藥物質(zhì)量濃度，Ci為第i（i≤n-1）個取樣點(diǎn)測得的接受液中藥物質(zhì)量濃度。以不同時間的Q對t作圖，對作圖后直線部分的Q對t進(jìn)行線性回歸，所得斜率即為藥物的經(jīng)皮吸收速率（Jss），直線部分反向延長線與X軸的交點(diǎn)即為滯后時間（Tlag）。為進(jìn)一步比較促透劑的促滲效果，按下列公式計算其經(jīng)皮促滲倍數(shù)： ER（enhancement ratio）= Jss（含促透劑）/ Jss（不含促透劑）。

2.5.2 皮膚血流量數(shù)據(jù) 采用MoorVMS數(shù)據(jù)分析軟件，分析大鼠耳局部皮膚給藥前，給藥后10，20，30，40，50，60 min的血流平均值，最后結(jié)果以給藥后各時間點(diǎn)的血流值與給藥前基礎(chǔ)血流值之比即皮膚血流變化值表示。SPSS 17.0軟件統(tǒng)計處理，數(shù)據(jù)以±s表示，采用t檢驗(yàn)分析和單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 透皮實(shí)驗(yàn)

乳香、沒藥揮發(fā)油對川芎中阿魏酸體外滲透動力學(xué)曲線及相關(guān)經(jīng)皮滲透參數(shù)的影響，分別見表1，圖2。

由結(jié)果可知，氮酮對川芎中阿魏酸經(jīng)皮滲透的促進(jìn)作用倍數(shù)為6.55，乳香、沒藥及其混合配伍揮發(fā)油對川芎經(jīng)皮滲透的促進(jìn)作用倍數(shù)分別為7.68，8.26，8.28，表明乳香、沒藥揮發(fā)油配伍前后對川芎指標(biāo)成分阿魏酸均具有一定的促滲透作用，且配伍后促滲作用最強(qiáng)；而乳香、沒藥揮發(fā)油1∶1混合后促進(jìn)作用倍數(shù)為7.26，表明兩者揮發(fā)油簡單混合應(yīng)用會相互抑制對方的經(jīng)皮促進(jìn)作用，但仍大于氮酮。

因此，乳香、沒藥揮發(fā)油配伍前后對川芎均有一定的促透作用，且配伍后提取所得揮發(fā)油促透作用增強(qiáng)。

3.2 皮膚血流變化

基質(zhì)對大鼠耳局部皮膚血流量的影響，乳香、沒藥揮發(fā)油單用及其配伍對大鼠耳局部皮膚血流的影響，各組大鼠耳局部皮膚血流改變的比較見表2，3。

由表2可知，在溶劑基質(zhì)涂布于大鼠耳局部60 min內(nèi)，大鼠耳局部皮膚血流無明顯變化，說明本實(shí)驗(yàn)所用的的溶劑對大鼠耳局部皮膚血流量沒有影響。

由表3可知，實(shí)驗(yàn)中各組大鼠耳局部皮膚血流量相比涂藥前出現(xiàn)顯著性差異的時間點(diǎn)略有差異，分別為乳香組10 min、沒藥組20 min、乳沒單提混合組30 min及乳沒混合提取組10 min。在前30 min各組對大鼠耳局部皮膚血流改變值無差異；在40 min時乳香揮發(fā)油對大鼠耳局部皮膚血流改變值最大，且優(yōu)于沒藥揮發(fā)油；在50 min時乳香揮發(fā)油對大鼠耳局部皮膚血流改變值最大，其次是混合提取揮發(fā)油，沒藥揮發(fā)油效果最弱，且乳香揮發(fā)油效果優(yōu)于沒藥揮發(fā)油、單提混合揮發(fā)油，混合提取揮發(fā)油效果優(yōu)于沒藥揮發(fā)油。在50 min時乳香揮發(fā)油對大鼠耳局部皮膚血流改變中，乳香揮發(fā)油、混合提取揮發(fā)油效果優(yōu)于沒藥揮發(fā)油、單提混合揮發(fā)油。因此，乳香、沒藥揮發(fā)油均具有一定的促血流作用，且乳香、沒藥單獨(dú)及合提所得揮發(fā)油均具有起效快的特點(diǎn)，乳香揮發(fā)油促血流效果最優(yōu)，沒藥揮發(fā)油可能會影響乳香揮發(fā)油的促血流效果，但是兩者合提時該抑制效果減弱。

4 討論

近年來，中藥揮發(fā)油作為經(jīng)皮給藥促透劑的研究已成熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)中藥揮發(fā)油大多具有良好的透皮吸收促進(jìn)效果[7-8]，對其促透機(jī)制研究已為當(dāng)下一大熱點(diǎn)。擾亂高度有序排列的皮膚角質(zhì)層結(jié)構(gòu)[9]、拉動效應(yīng)[10]、增強(qiáng)皮膚角質(zhì)層的水合作用[4]，是目前普遍認(rèn)為的中藥揮發(fā)油促滲機(jī)制。

活血類中藥藥對乳香、沒藥，乳香味淡性溫，氣香而走竄，善理氣活血；沒藥氣薄味苦，重在化瘀理血，古今醫(yī)家每每將此二者相須為用[11]。揮發(fā)油類成分是乳香、沒藥的主要有效成分，乳香、沒藥含有烯類、醛類、酸類等揮發(fā)油，其主要揮發(fā)油成分乙酸辛酯具有顯著的促透作用[12-13]。從體外滲透動力學(xué)曲線及相關(guān)經(jīng)皮滲透參數(shù)可發(fā)現(xiàn)，乳香、沒藥揮發(fā)油配伍前后對川芎指標(biāo)成分阿魏酸均具有一定的促滲透作用，混合提取所得揮發(fā)油促滲作用最強(qiáng)；而單提混合所得揮發(fā)油促進(jìn)作用倍數(shù)小于兩者單用，表明兩者揮發(fā)油簡單混合應(yīng)用會抑制經(jīng)皮促進(jìn)作用。有文獻(xiàn)報道川芎揮發(fā)油也有促進(jìn)藥物經(jīng)皮滲透的作用[14]，文章以川芎作為模型藥，可能會干擾該文中乳香、沒藥揮發(fā)油促透作用的評價。但是，該文在設(shè)計體外透皮實(shí)驗(yàn)時就有考慮川芎揮發(fā)油的存在，采用平行對照，設(shè)置了川芎空白體外透皮組，可扣除川芎揮發(fā)油促透作用的干擾。因此，文章從體外透皮實(shí)驗(yàn)評價乳香、沒藥揮發(fā)油對川芎經(jīng)皮滲透的促進(jìn)作用是可行的。

近年研究表明，中藥揮發(fā)油可通過促進(jìn)皮膚血流以達(dá)到皮膚促透效果[4]。雖然表皮和真皮內(nèi)的血液脈管系統(tǒng)并非是影響藥物透皮的主要因素，但增加皮膚血流，可增加藥物在皮膚中的消除速率，出現(xiàn)漏槽效應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)藥物促透[14]。透皮吸收促進(jìn)劑在促進(jìn)皮膚微循環(huán)血流過程中具有其固有的起效時間、維持時間及透皮作用強(qiáng)度。本實(shí)驗(yàn)中，乳香、沒藥、混合提取所得揮發(fā)油均具有起效快的特點(diǎn)，乳香、沒藥揮發(fā)油均具有一定的促血流作用，乳香揮發(fā)油促血流效果優(yōu)于沒藥、乳沒藥對揮發(fā)油，沒藥揮發(fā)油可影響乳香揮發(fā)油的促血流效果，但是兩者合提時該抑制效果減弱。

通過研究發(fā)現(xiàn)，乳香、沒藥揮發(fā)油配伍前后對川芎均有一定的促透作用，尚可通過增加皮膚血流，促進(jìn)藥物從皮膚表皮到真皮層毛細(xì)血管的消除，從而實(shí)現(xiàn)促透。然乳香、沒藥揮發(fā)油促川芎透過皮膚角質(zhì)層的具體作用機(jī)制，乳香、沒藥混合提取所得揮發(fā)油與乳香、沒藥混合揮發(fā)油二者之間的作用差異機(jī)制，都尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

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