納豆芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌融合子的多重PCR鑒定

張 琳，龐豐平，霍乃蕊

（1.山西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山西 太谷 030801）

納豆芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌融合子的多重PCR鑒定

張 琳1，龐豐平1，霍乃蕊2,*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山西 太谷 030801）

為建立納豆芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌融合子快速鑒定的多重聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）方法，根據(jù)芽孢桿菌的芽孢形成早期因子基因spo0A和13 株乳酸菌β-半乳糖苷酶基因的保守序列分別設(shè)計引物對P1/P2和P3/P4，以親本菌株DNA為模板，優(yōu)化每對引物在適宜退火溫度條件下的PCR體系，在最優(yōu)體系下的特異性分析結(jié)果表明P1/P2能特異性擴增出spo0A基因片段（308 bp），而7 株乳酸菌全部呈陰性；P3/P4可擴增出所有受試乳酸菌和經(jīng)表型鑒定確定的陽性融合子中的目標基因片段（576 bp），而對芽孢桿菌無擴增。多重PCR結(jié)果表明在P1/P2的最優(yōu)體系中只有308 bp片段的擴增，而在P3/P4的最優(yōu)體系中可實現(xiàn)2 個片段的共擴增，對融合后獲得的50 個菌株的鑒定結(jié)果與單重PCR和表型鑒定結(jié)果100%吻合。該體系中模板DNA 1 ng/μL，每條引物0.4 μmol/L，脫氧核糖核苷三磷酸0.25 mmol/L，Taq酶0.06 U/μL；PCR時94 ℃預(yù)變性5 min；每個循環(huán)（共30 個）94 ℃ 30 s、53 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s，產(chǎn)物末端 72 ℃延伸7 min。該方法簡便、快速、特異性好，適用于芽孢桿菌、乳酸菌以及二者融合子的快速鑒定。

芽孢形成早期因子基因；β-半乳糖苷酶基因；融合子；多重PCR

納豆芽孢桿菌發(fā)酵過程中，伴隨著大分子物質(zhì)的降解，還會產(chǎn)生許多維生素和生理活性物質(zhì)[1]，因此由納豆菌發(fā)酵而成的納豆具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤、降血壓、提高蛋白質(zhì)消化率、預(yù)防骨質(zhì)疏松等多種作用[2]。納豆菌為枯草芽孢桿菌的一個亞種[3]，其芽孢形式抗逆性強，具有耐熱、耐酸堿、耐干燥、抗紫外線和抗有機溶劑等特性[4]，并且產(chǎn)生的納豆激酶可改善血液流通循環(huán)，減少血栓形成，安全有效[5]，可用于開發(fā)相關(guān)抗血栓藥物[6-7]。嗜酸乳桿菌是人體腸道的益生菌，具有酸和膽汁耐性、黏附人體上皮細胞、定殖腸道產(chǎn)生細菌素[8]、抗癌[9]、刺激免疫應(yīng)答等特點。實驗室前期研究結(jié)果表明，嗜酸乳桿菌雖然比其他乳酸菌具有更強的耐酸耐膽鹽能力，但其通過胃液時大部分菌體仍然會失活，所以產(chǎn)芽孢乳酸菌育種一直為研究熱點?，F(xiàn)如今微生物育種技術(shù)已從常規(guī)的突變篩選發(fā)展到基因誘變、基因重組和基因工程，與轉(zhuǎn)基因技術(shù)相比，細胞融合技術(shù)更安全、更高效，且已廣泛應(yīng)用于很多領(lǐng)域[10-11]。因此，以納豆芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌為親本進行細胞融合，獲得具有雙親優(yōu)良性狀的融合菌株，其益生功能將進一步增強，且過胃能力進一步加強，如應(yīng)用于納豆發(fā)酵，可改善其風味，為開發(fā)符合中國人群消費的納豆提供依據(jù)。

細胞融合過程中，染色體經(jīng)交換、重組而達到雜交目的[12]，親本內(nèi)和親本間的融合均可發(fā)生，因而雜合融合子的快速篩選和鑒定是細胞融合的關(guān)鍵技術(shù)之一，目前，尚缺乏系統(tǒng)的鑒定標準[13]。已報道的融合子篩選方法有營養(yǎng)缺陷型互補選擇、滅活原生質(zhì)體標記選擇、熒光染色法篩選[14]、免疫學方法篩選[15]等。上述方法主要從培養(yǎng)特性、個體形態(tài)、生化特性、同工酶、G+C含量等指標入手，依賴對多種測定結(jié)果的綜合評判得出結(jié)論[13]?？梢妭鹘y(tǒng)鑒定方法復(fù)雜、成本高、工作量大、耗時長，因而融合子快速鑒定十分必要。多重PCR技術(shù)在同一反應(yīng)體系中加入多對引物，同時擴增多條目的DNA[16]，已應(yīng)用到了生命科學的各個領(lǐng)域[17]。設(shè)計特異性引物，利用多重PCR技術(shù)對納豆芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌的融合子進行鑒定，將是一種簡單、快速的鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

納豆芽孢桿菌購于日本高橋保藏研究所；嗜酸乳桿菌（CMCC6075）購于中國菌種保藏中心；其他菌株為山西農(nóng)業(yè)大學微生物實驗室保存。

細菌基因組DNA小量提取試劑盒 北京莊盟國際生物基因科技有限公司；Taq DNA聚合酶（5 U/μL）、BL2000 DNA Marker 北京博雅宏興科技有限公司；鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷（o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，ONPG） 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電泳儀 北京君煮東方電泳設(shè)備有限公司；凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；NanoDrop 2000C核酸儀 美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞融合

用已建立的融合方法[18]將納豆芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌進行融合，高滲培養(yǎng)基涂布再生后，隨機挑取50 個彼此分離的菌落，平板劃線進一步進行純化，獲得菌落純菌株，用于鑒定和保藏。

1.3.2 模板制備和引物設(shè)計

使用細菌DNA提取試劑盒提取親本菌株和融合菌株DNA，用核酸儀測定DNA質(zhì)量濃度，調(diào)整終質(zhì)量濃度為5 ng/μL，-20 ℃保存。

表1 用于序列比對分析的13 株乳桿菌β-半乳糖苷酶基因列表Table1 β-Galactosidase genes of 13Lactobacillus for sequence alignment

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中提供的枯草芽孢桿菌芽孢形成早期因子（stage 0 sporulation protein A，spo0A）基因序列（ID：938655，全長804 bp），用軟件Primer Premier 5設(shè)計芽孢桿菌特異性引物。在NCBI數(shù)據(jù)庫中查找β-半乳糖苷酶基因的序列（表1），用軟件MEGA 6比對分析尋找保守序列，設(shè)計乳酸菌特異性引物[19]并由生工生物工程有限公司合成。

1.3.3 溫度梯度PCR退火溫度的確定

以親本菌株DNA為模板，設(shè)置8 個退火溫度進行梯度PCR擴增：模板DNA（5 ng/μL）5 μL、引物（10 μmol/L）各1 μL、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）（2.5 mmol/L）2.5 μL、Taq酶（5 U/μL）0.3 μL，雙蒸水補至25 μL。PCR擴增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，溫度梯度退火30 s，72 ℃延伸60 s，30 個循環(huán)；產(chǎn)物末端72 ℃延伸7 min，本研究所有PCR產(chǎn)物進行1.0%的瓊脂糖凝膠電泳（100 V，40 min），并使用凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照[20]。

1.3.4 單重PCR體系優(yōu)化

以1.3.3節(jié)所篩選的退火溫度及PCR條件，設(shè)計試驗對2 對引物的PCR體系進行優(yōu)化[21]，各因素與水平設(shè)計如表2所示。

表2 PCR體系設(shè)計的因素與水平Table2 Factors and levels used in the experimental design for optimization of PCR system

1.3.5 引物特異性分析

用建立的單重PCR方法對實驗室現(xiàn)有的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌以及清酒乳桿菌、彎曲乳桿菌等7 株乳酸菌進行PCR，驗證引物對P1/P2的特異性；選取經(jīng)表型鑒定已獲得的5 株融合子、清酒乳桿菌、植物乳桿菌、肉葡萄球菌DNA進行PCR，分析P3/P4的特異性[22]。

1.3.6 融合子的單重PCR鑒定

用建立的針對兩親本菌株及其引物對的單重PCR體系分別對融合后隨機挑取的50 個菌株進行擴增，兩個目的基因片段都被擴增者為陽性融合子。

1.3.7 融合子多重PCR鑒定

在建立的兩個單重PCR體系中同時加入P1/P2和P3/P4 2 對引物，進行PCR擴增，若2 個目的條帶同時出現(xiàn)，則為陽性融合子，相應(yīng)體系也被確定為融合子鑒定的多重PCR體系。

1.3.8 融合子的表型篩選

對上述50 個菌株進行表型篩選，判斷雙重PCR對融合子進行快速鑒定的準確性。對菌落菌體進行革蘭氏染色，觀察芽孢。β-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)[23]時取1 mL培養(yǎng)液于1.5 mL EP管中，12 000 r/min離心2 min，棄上清液，生理鹽水重懸菌體，加1 滴甲苯充分搖勻使酶釋放，37 ℃水浴5 min，加入0.25 mL ONPG溶液，37 ℃水浴20～30 min，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物設(shè)計與分析

針對spo0A基因設(shè)計的引物為P1和P2。對表1中的13株乳酸菌的β-半乳糖苷酶基因序列比對，獲得如下保守序列：

1 TGGCTTACAC AAATAATTTA CAAATCATCT ATGGTGATGC CACTTTAGGA ATCACTGGTA

61 AAAACTTCCA TTATCTTTTC AGCTACGAAC GAGGTGGGTT AGAATCACTC AACATCAATA

121 ACAAAGAATG GTTATATCGT GTGCCGACCC CTACTTTCTG GCGAGCTACT ACCGATAATG

181 ATCGAGGTAA TGGCTTTAAT TTAAAGGCAT CTCAATGGCT CGGTGCTGAT ATGTTTACTA

241 AATGCACTAA AATCGAATTA AAGGTAGATG ACCGACAATT CGACGAACTT CCAATTGCTC

301 CAATTAATAA TCAATTCAGT AATCATGAAT ATGCTGACCA TGTTCAAATT GCGTTTTGGT

361 ATCAAACTCT AACTAATCCA GCAACTGACG TTAAAATCAT TTATAATATT GATAATACTG

421 GTTGTATTAA TATAGTCATG CATTATTTTG GTAAAAAAGG ATTGCCACCA TTACCAGTGA

481 TTGGAATGCG TTTCATCATG CCAACTGCTG CAACTGGCTT TGACTACGAA GGACTTTCGG

541 GGGAAACTTA TCCTGACCGA ATGGCTGGTG CAAAAGAAGG AAAATTCCAT GTTGATGGCT

601 TACCAGTAAC TAAATATTTA GTACCACAAG AAAACGGGAT GCATATGCAA ACTAAGGCAC

661 TCAAAATCAC TCGTTCTTCT ACTTTAAATA ATGCTGATCA AGAAAGTGAA TTTAGTCTAA

721 AGCTTAAGCA AGATAAACAA CCGTTTAATT TTAGTTGTTT ACCCTACACT GCTGAAGAAT

781 TAGAAAATGC TACTCATCTC GAGGAATTAC CACTTGCTCG CAGAACTGTG TTAGTTATTG

841 CTGGAGCTGT GCGCGGCGTT GGTGGTATCG ACAGCTGGGG TGCTGATGTT GAAAAGCAAT

901 ATCACATTAA TCCTGAAAAA GACTACGAAT TTT

該序列長度為933 bp，據(jù)此設(shè)計引物P3和P4（下劃線部分），各引物的序列、DNA熔解溫度（Tm值）及目的片段長度見表3。

表3 引物序列與產(chǎn)物長度Table3 Primer sequences,Tmand the lengths of the corresponding PCR products

圖1 引物對P1/P4（b）在不同退火溫度條件下的PCR產(chǎn)物Fig.1 Amplification by P1/P2 (a) and P3/P4 (b) at different annealing temperatures /P2（a）和P3

2.2 退火溫度的確定溫度梯度PCR結(jié)果如圖1所示，靶片段都得到了特異性擴增。由于51.4 ℃接近P1/P2的Tm（52.7/50.5 ℃），53 ℃接近P3/P4的Tm值（55/52.7 ℃），且這兩個溫度也很接近，方便進行多重PCR，因此分別選擇51.4 ℃和53 ℃作為退火溫度對反應(yīng)體系進行優(yōu)化。

2.3 單重PCR體系優(yōu)化

表 4β-半乳糖苷酶基因片段和芽孢基因片段的PCR體系設(shè)計Table4 Experimental design and results for PCR of β-galactosidase and sporulation genes

設(shè)計17 個反應(yīng)體系[21]，以PCR產(chǎn)物質(zhì)量濃度為指標，考察模板DNA用量（A）、引物用量（B）、dNTP用量（C）、Taq酶用量（D）對擴增產(chǎn)物質(zhì)量濃度的影響，篩選每對引物的最優(yōu)反應(yīng)體系。

圖2 17 個體系P1/P2（a）和P3/P4（b）的PCR結(jié)果Fig.2 PCR results of P1/P2 (a) and P3/P4 (b) in 17 systems

由表4和圖2可知，組合16為P1/P2擴增納豆芽孢桿菌spo0A基因片段的最優(yōu)擴增體系。組合8為P3/P4擴增嗜酸乳桿菌β-半乳糖苷酶基因片段的最優(yōu)擴增體系，這2 個組合擴增產(chǎn)物質(zhì)量濃度最大，條帶最亮。經(jīng)換算組合16的PCR體系為：模板DNA 1 ng/μL、引物0.3 μmol/L、dNTP 0.25 mmol/L、Taq酶0.08 U/μL；組合8的PCR體系為：模板DNA 1 ng/μL、引物0.4 μmol/L、dNTP 0.25 mmol/L、Taq酶0.06 U/μL。

2.4 引物特異性檢驗結(jié)果

圖3 引物P1/P2對spo0A特異性擴增電泳圖Fig.3 Electrophoretogram of specific amplif i cation products with primer P1/P2

如圖3所示，3 株芽孢桿菌即納豆芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌均出現(xiàn)了目標條帶；而所有7株乳酸菌擴增結(jié)果呈陰性，說明引物P1、P2具有特異性。

圖4 引物P3/P4特異性擴增電泳圖Fig.4 Electrophoretogram of specific amplifi cation products with primer P3/P4

同理對通過表型鑒定篩選出的5 株融合子、DNA進行擴增，結(jié)果如圖4所示，引物P3/P4對嗜酸乳桿菌、其他乳酸菌及5 株陽性融合子和其他乳酸菌均呈陽性擴增，而納豆芽孢桿菌呈陰性，說明引物P3/P4具有特異性，可以用于融合子鑒定。

2.5 融合子的單重PCR鑒定

P2對50 個菌株的PCR擴增結(jié)果Fig.5 Results of PCR with P1/P2 for 50 infusant strains圖5 引物P1/

用已建立的PCR方法，利用引物對P1/P2從再生平板上挑取的50 個菌株進行鑒定，結(jié)果如圖5，親本納豆芽孢桿菌呈擴增陽性，嗜酸乳桿菌呈陰性，所有50 個樣品均呈陽性結(jié)果，但不一定都是陽性融合子，因為沒有發(fā)生融合的以及自身融合的納豆芽孢桿菌也會呈現(xiàn)陽性結(jié)果，因此需要進行β-半乳糖苷酶基因片段的檢測，二者均呈陽性者方可鑒定為融合子。

圖6 引物P3/P4對50 個樣品菌株的PCR結(jié)果Fig.6 Results of PCR with P3/P4 for 50 infusant strains

由圖6可知，P3/P4引物在其優(yōu)化的PCR體系下，對納豆芽孢桿菌和待檢菌株33、43、45均未擴增出目標條帶，說明不含β-半乳糖苷酶基因。其他47 個待檢菌株既能擴增出芽孢桿菌的特異性基因，又能擴增出乳酸菌的特異性基因，因此為陽性融合子。

2.6 多重PCR方法的建立

圖7 在引物對P1/P2優(yōu)化體系下50 株菌的多重PCR結(jié)果Fig.7 Results of multiplex PCR of 50 strains under the optimized system with the primer pair P1/P2

引物P1/P2的優(yōu)化PCR體系中加入4 條引物各0.75 μL，雙蒸水補齊至25 μL，51.4 ℃退火。PCR結(jié)果（圖7）表明該體系只擴增出了引物P1/P2的目標條帶，可見該體系不可用。

圖8 在引物對P3/P4優(yōu)化體系下50 株菌的多重PCR結(jié)果Fig.8 Results of multiplex PCR of 50 strains under the optimized system with the primer pair P3/P4

在已建立的引物對P3/P4的PCR優(yōu)化體系中，加入4 條引物各1 μL，補雙蒸水至25 μL，53 ℃退火進行PCR，由圖8可知，經(jīng)單重PCR鑒定的陽性融合子均擴增出了預(yù)期大小的雙條帶，依然是33、43、45號菌株沒有擴增出乳酸菌的特異性片段，因此選擇該體系作為納豆芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌融合子鑒定PCR體系。

表5 50 個融合子的單重PCR和多重PCR鑒定結(jié)果Table5 Results of multiplex PCR and monoplex-PCR of 50 infusant strains

由表5可知，多重PCR鑒定結(jié)果與單重PCR鑒定結(jié)果一致，但更快捷和經(jīng)濟。

2.7 表型鑒定

圖9 菌體革蘭氏染色芽孢觀察Fig.9 Observation of the spores by Gram staining

50 株待檢測菌的菌落菌體經(jīng)革蘭氏染色，均可觀察到和待檢菌體5一樣的成熟芽孢（圖9），與PCR結(jié)果相符。

β-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)結(jié)果表明，嗜酸乳桿菌溶液變黃呈陽性，而納豆芽孢桿菌溶液不變色為陰性。待檢菌株只有33、43、45呈陰性，說明不產(chǎn)β-半乳糖苷酶，其余呈陽性，與PCR結(jié)果相符。因此，該多重PCR方法成立，結(jié)果可靠，可用于納豆芽孢桿菌和嗜酸乳酸菌融合子的快速鑒定。

3 討論與結(jié)論

多重PCR的原理、試劑和操作都與普通PCR相同，但其反應(yīng)過程復(fù)雜，許多因素會影響其結(jié)果[24]。在多重PCR中，引物設(shè)計是關(guān)鍵，目前尚缺乏簡單實用的多重PCR引物設(shè)計軟件，本研究設(shè)計的組合2 對引物P1/P2和P3/P4，靶片段相差268 bp，電泳時能夠完全區(qū)分，保證了結(jié)果的準確判定。多重PCR還要考慮組合2 對引物相近的Tm值，P1/P2和P3/P4的Tm值均在52 ℃左右，保證多重PCR在同一退火溫度條件下實現(xiàn)各自的特異性擴增。利用Primer Premier 5軟件對引物進行分析，最大可能地避免了引物之間二聚體、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、環(huán)狀結(jié)構(gòu)以及引物與非靶標模板之間的互補等影響擴增效率的問題[25-26]?？梢姀囊镌O(shè)計角度分析，P1/P2和P3/P4可以保證多重PCR的順利進行。

本研究結(jié)果表明，針對芽孢形成早期因子基因spo0A設(shè)計的引物P1/P2，特異性檢測結(jié)果表明對芽孢生成菌具有特異性。納豆芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌的一個亞種，而枯草芽孢桿菌是典型的產(chǎn)芽孢模式微生物，其芽孢生成過程中的關(guān)鍵蛋白在所有能形成芽孢且基因測序完成的細菌中都存在，所以研究枯草芽孢桿菌芽孢形成所得出的結(jié)論普遍適用于所有芽孢桿菌科。spo0A是細胞從營養(yǎng)生長期進入芽孢形成期的關(guān)鍵應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白，是芽孢階段重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，存在于所有芽孢桿菌[27]。針對乳酸菌β-半乳糖苷酶基因設(shè)計的引物P3/P4，對芽孢生成菌無擴增，而只對乳酸菌和陽性融合子有擴增，因而具有特異性；因此從特異性角度出發(fā)，P1/P2和P3/P4不僅可用于納豆芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌融合子的鑒定，還可用于地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等芽孢生成菌和保加利亞乳桿菌、清酒乳桿菌、植物乳桿菌、肉葡萄球菌等乳酸菌融合子的鑒定。因為根據(jù)乳酸菌的定義，所有乳酸菌均具有發(fā)酵乳糖生產(chǎn)乳酸的能力，而這種能力離不開β-半乳糖苷酶的作用。

本研究對13 株乳酸菌β-半乳糖苷酶基因序列進行比對，根據(jù)保守序列設(shè)計得到了特異性強的P3/P4引物對。在此之前，根據(jù)β-半乳糖苷酶曾設(shè)計了若干對引物，但這些引物雖然可以高效擴增嗜酸乳桿菌的目標片段，但在有的乳酸菌中沒有擴增片段；有的雖然可對所有乳酸菌實現(xiàn)特異性擴增，但對已經(jīng)通過單重PCR以及表型鑒定篩選出的陽性融合子無擴增，也被棄用，這也就揭示了本研究為什么在P3/P4特異性檢測時分析其對4 個陽性融合子的擴增情況。

本研究建立的雙重PCR體系，對納豆芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌融合子的鑒定結(jié)果與表型鑒定和單重PCR鑒定結(jié)果100%吻合，說明所建立的雙重PCR體系和方法可靠準確、方便快捷，為芽孢生成菌和乳酸菌融合子的快速鑒定提供了技術(shù)保障。

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Identif i cation of Lactobacillus acidophilus-Bacillus natto Fusant by Multiplex PCR

ZHANG Lin1, PANG Fengping1, HUO Nairui2,*
(1. College of Food Science and Engineering, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China; 2. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China)

A multiplex polymerase chain reaction (mPCR) assay for the rapid identif i cation of Lactobacillus acidophilus-Bacillus natto fusant was developed in this paper. The primer pair P1/P2 was designed based on the spo0A gene encoding the stage 0 sporulation protein A of Bacillus subtilis, as well as the primer pair P3/P4 according to the conserved sequence of the β-galactosidase gene of 13 lactic acid bacterial (LAB) strains. Using the genomic DNA of the parental strains as template, PCR systems for each primer pair were optimized under the predetermined annealing temperature. The specif i city analysis showed that P1/P2 could amplify the spo0A fragment (308 bp) but all seven LAB strains gave negative results; P3/P4 could amplify the target fragment (576 bp) from all LAB and fi ve identif i ed positive fusants but not from Bacillus subtilis. Results of multiplex PCR demonstrated that the optimal PCR system for P1/P2 could only amplify its own 308 bp target DNA, while in the optimal system for P3/P4 both target DNA fragments could be obtained. The results of identif i cation of 50 fusant strains by multiplex PCR showed 100% consistency with that of traditional PCR and phenotype identif i cation. The mPCR system contained 1 ng/μL template DNA, 0.4 μmol/L primer (each), 0.25 mmol/L dNTP, 0.06 U/μL Taq polymerase, and the PCR conditions were as follows: 5 min predenaturation at 94 ℃, 30 cycles of denaturation at 94 ℃ 30 s, annealing at 53 ℃ for 30 s, and extension at 72 ℃ for 60 s. This method proved to be a rapid, convenient method with high specif i city for the eff i cient identif i cation of spore-forming bacteria, LAB and their fusant.

stage 0 sporulation protein A gene (spo0A); β-galactosidase gene; fusant; multiplex polymerase chain reaction

10.7506/spkx1002-6630-201704016

TS201.3

A

1002-6630（2017）04-0093-07

張琳, 龐豐平, 霍乃蕊. 納豆芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌融合子的多重PCR鑒定[J]. 食品科學, 2017, 38(4): 93-99.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704016. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Lin, PANG Fengping, HUO Nairui. Identif i cation of Lactobacillus acidophilus-Bacillus natto fusant by multiplex PCR[J]. Food Science, 2017, 38(4): 93-99. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704016. http://www.spkx.net.cn

2016-04-19

山西省人社廳2013年留學回國人員科技活動擇優(yōu)資助項目

張琳（1991—），女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：zhanglinmailbox@163.com

*通信作者：霍乃蕊（1972—），女，教授，博士，研究方向為生物技術(shù)與食品安全。E-mail：tgnrhuo@163.com