氫核磁共振結(jié)合正交偏最小二乘法對(duì)油菜蜜中果葡糖漿摻假的判別分析

陳 雷，劉紅兵，羅立廷

（中國(guó)科學(xué)院武漢物理與數(shù)學(xué)研究所，波譜與原子分子物理國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢磁共振中心，湖北 武漢 430071）

氫核磁共振結(jié)合正交偏最小二乘法對(duì)油菜蜜中果葡糖漿摻假的判別分析

陳 雷，劉紅兵，羅立廷

（中國(guó)科學(xué)院武漢物理與數(shù)學(xué)研究所，波譜與原子分子物理國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢磁共振中心，湖北 武漢 430071）

利用氫核磁共振（1H nuclear magnetic resonance，1H NMR）譜圖結(jié)合正交偏最小二乘（orthogonal partial least squares，OPLS）法對(duì)油菜蜂蜜和果葡糖漿摻假蜂蜜進(jìn)行判別分析。采集了303 個(gè)油菜蜜樣品和180 個(gè)按照不同比例配制的果葡糖漿摻假蜂蜜樣品的1H NMR譜圖，并對(duì)油菜蜜主要糖類成分和部分低含量化合物進(jìn)行了信號(hào)歸屬。采用OPLS對(duì)訓(xùn)練集數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，建立蜂蜜果葡糖漿摻假判別模型。通過排列實(shí)驗(yàn)法對(duì)模型進(jìn)行可靠性檢驗(yàn)。結(jié)果顯示，油菜蜜和果葡糖漿摻假蜂蜜樣品在OPLS得分圖中能明顯區(qū)分。訓(xùn)練集和測(cè)試集樣品的總體判別正確率分別為98.40%和98.24%。因此，1H NMR與OPLS相結(jié)合可以實(shí)現(xiàn)油菜蜜中果葡糖漿摻假的快速鑒別。該方法是基于對(duì)蜂蜜成分的整體分析，避免了僅僅分析個(gè)別成分指標(biāo)的檢驗(yàn)方法中存在的缺陷，為蜂蜜質(zhì)量監(jiān)控提供了一種新思路。

蜂蜜；核磁共振；正交偏最小二乘法；摻假

蜂蜜是一種蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或者蜜露，與自身分泌物混合后，經(jīng)充分釀造而成的天然甜物質(zhì)[1]。作為一種天然保健品和營(yíng)養(yǎng)品，深受廣大消費(fèi)者的青睞。盡管國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中明確規(guī)定蜂蜜是天然物質(zhì)，不允許人為添加和去除任何物質(zhì)，但目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上蜂蜜摻假現(xiàn)象屢禁不止，嚴(yán)重?fù)p害了廣大消費(fèi)者的利益，影響了蜂蜜產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。蜂蜜市場(chǎng)摻假嚴(yán)重的原因主要有4點(diǎn)：1）蜂蜜中主要糖類物質(zhì)是葡萄糖、果糖，結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單，同時(shí)受蜜源植物種類、花期長(zhǎng)短、氣候以及蜂蜜的加工、儲(chǔ)存、結(jié)晶等多種因素影響，造成蜂蜜各成分的含量波動(dòng)范圍較大，這些客觀原因，使得蜂蜜摻假簡(jiǎn)單、方便；2）目前摻假的主要手段是在蜂蜜中加入外源植物糖漿，例如玉米糖漿、甜菜糖漿、大米糖漿等[2-3]，市場(chǎng)上糖漿的價(jià)格遠(yuǎn)低于蜂蜜的價(jià)格，不法生產(chǎn)廠商從摻假蜂蜜中能獲得更多的經(jīng)濟(jì)利益；3）摻假蜂蜜本身對(duì)人體危害程度不及其他一些摻假食品，沒有引起消費(fèi)者的高度警惕；4）缺乏有效檢測(cè)手段，導(dǎo)致打擊蜂蜜摻假面臨困難。

蜂蜜品質(zhì)的傳統(tǒng)檢測(cè)方法包括感官鑒別、花粉分析以及理化指標(biāo)測(cè)試[4-6]。感官鑒別帶有一定的主觀性、經(jīng)驗(yàn)性；花粉分析受到的外界影響因素較多，存在較大的不確定性；僅依靠理化指標(biāo)測(cè)試已不能區(qū)分蜂蜜的真假。近年來，利用先進(jìn)的現(xiàn)代儀器設(shè)備，針對(duì)蜂蜜摻假發(fā)展了多種檢測(cè)分析技術(shù)和方法，主要包括穩(wěn)定碳同位素比率法[7-9]、色譜分析（氣相色譜、高效液相色譜、薄層色譜、離子色譜）及其聯(lián)用技術(shù)[10-15]、光譜分析（近紅外、熒光、拉曼、紫外-可見吸收光譜）[16-22]、淀粉酶檢測(cè)法[23-24]、差示掃描量熱法[25]、電子鼻[26]等。這些方法都存在缺點(diǎn)，并只在一定范圍內(nèi)適用[2,27]。因此，糖漿摻假蜂蜜的識(shí)別問題還沒有得到完全解決。檢測(cè)技術(shù)的滯后影響到蜂蜜產(chǎn)品的質(zhì)量保證和食用安全，必須進(jìn)一步開展蜂蜜摻假的鑒別研究，建立一套靈敏、準(zhǔn)確、高效、普適的蜂蜜摻假鑒定方法，以保護(hù)消費(fèi)者利益和保證蜂蜜產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

氫核磁共振（1H nuclear magnetic resonance，1H NMR）是一種非常重要的研究和分析測(cè)試工具，在化學(xué)、生物、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用，對(duì)有機(jī)小分子和生物大分子的結(jié)構(gòu)解析具有重要作用。NMR技術(shù)有如下特點(diǎn)：1）樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單，無需預(yù)篩選，可以避免由于分離所造成的微小成分的丟失；2）無損傷性，不會(huì)破壞樣品的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，可以進(jìn)行實(shí)時(shí)和動(dòng)態(tài)的檢測(cè)；3）譜圖中信號(hào)的相對(duì)強(qiáng)弱直接反映了樣品中各組分的相對(duì)含量；4）可設(shè)計(jì)多種編輯手段，實(shí)驗(yàn)方法靈活多樣。

采用1H NMR技術(shù)測(cè)試食品等復(fù)雜混合體系可以得到樣品中多種化學(xué)成分的信息[28-29]，但是各種成分信號(hào)的重疊也使得圖譜變得十分復(fù)雜。通常，僅靠肉眼觀察只能從NMR圖譜中獲得很有限的信息。而多元統(tǒng)計(jì)分析可以有效而全面地分析譜圖數(shù)據(jù)，從復(fù)雜的數(shù)據(jù)中最大限度地提取信息，建立數(shù)學(xué)模型。通常采用的多元統(tǒng)計(jì)分析方法包括主成分分析、聚類分析、偏最小二乘（partial least squares，PLS）法、正交偏最小二乘（orthogonal partial least squares，OPLS）法、支持向量機(jī)等。其中OPLS法是在PLS法的基礎(chǔ)上提出的一種新型的多元統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析方法[30]，其最大的特點(diǎn)是可以去除自變量X中與分類變量Y無關(guān)的變化，使分類信息主要集中在一個(gè)主成分中，模型變得簡(jiǎn)單和易于解釋，其判別效果及主成分得分圖的可視化效果更加明顯[31]。

1H NMR技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析在食品研究中已得到比較廣泛的使用，在食品成分分析、真?zhèn)舞b別、品質(zhì)評(píng)價(jià)和產(chǎn)地、年份區(qū)分等領(lǐng)域有很多應(yīng)用成果[32-35]。Godelmann等[32]報(bào)道了1H NMR結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用于葡萄酒種類、產(chǎn)地和釀造年份的區(qū)分；Schievano等[33]采集了118 份蜂蜜氯仿提取物的1H NMR譜圖，結(jié)合主成分分析和PLS進(jìn)行蜂蜜溯源分析；李愛平等[34]對(duì)食醋的1H NMR數(shù)據(jù)利用判別-PLS法進(jìn)行分析，建立了食醋品種分類模型，比較了不同食醋的差異化學(xué)成分；蔡波太等[35]結(jié)合聚類和判別分析建立了鑒別地溝油的模型，盲測(cè)的正確率達(dá)93.8%。

本實(shí)驗(yàn)利用1H NMR技術(shù)結(jié)合OPLS法對(duì)蜂蜜摻假進(jìn)行鑒別研究。首先采集油菜蜜樣品和糖漿摻假蜂蜜樣品的1H NMR譜圖，對(duì)譜圖進(jìn)行分析，歸屬特征信號(hào)。然后利用OPLS對(duì)譜圖的分段積分?jǐn)?shù)據(jù)矩陣進(jìn)行分析，建立真假蜂蜜鑒別模型。最后對(duì)訓(xùn)練集和測(cè)試集樣品進(jìn)行鑒別，驗(yàn)證模型的可靠性。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用的蜂蜜來至湖北省仙桃、松滋、漢川以及湖南省澧縣等地區(qū)的養(yǎng)蜂場(chǎng)，品種為油菜花蜜。為保證樣品的真實(shí)性，直接從蜂箱中的巢脾取樣，選取自然釀造成熟的封蓋蜂蜜采集。共收集了303 個(gè)樣品，貯藏在4～8 ℃冰箱中備用。

摻假用的果葡糖漿從市場(chǎng)上采購(gòu)。共購(gòu)買了8 家生產(chǎn)商的18 種不同規(guī)格的果葡糖漿。將果葡糖漿按質(zhì)量比（m糖漿/m蜂蜜）5%、10%、30%、50%以及70%加入到油菜蜜中。每種果葡糖漿分別摻入任選的2 個(gè)油菜蜜樣品，共配制糖漿摻假蜂蜜樣品180 份。

1.2 試劑

K2HPO4·3H2O、NaH2PO4·2H2O（均為分析純）上海國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司；NaN3（分析純） 天津福晨化學(xué)試劑廠；重水（D2O，99.9%氘代，含0.05 g/100 mL 2,2,3,3-氘代三甲基硅烷丙酸鈉（2,2,3,3,-d(4)-3-(trimethylsilyl)propionic acid sodium salt，TSP）） 美國(guó)Cambridge Isotope Laboratories公司；用于樣品制備的磷酸鹽緩沖溶液（0.15 mol/L K2HPO4/NaH2PO4，pH 7.40）使用含10% D2O的雙蒸水配制而成。其中緩沖溶液包含的TSP和NaN3（0.01 g/100 mL）分別用作化學(xué)位移內(nèi)標(biāo)物和防腐劑。

1.3 儀器與設(shè)備

AVANCE 500MHz液體NMR儀（配有寬帶反相檢測(cè)探頭、自動(dòng)進(jìn)樣器） 瑞士布魯克公司；AL104電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；移液槍德國(guó)艾本德公司；Micro 17R微量臺(tái)式離心機(jī) 美國(guó)賽默飛世爾科技公司；5 mm核磁管 美國(guó)諾雷爾公司。

1.4 方法

1.4.1 NMR樣品的制備

先將油菜蜜從冰箱取出，放置至室溫。對(duì)于已結(jié)晶的樣品，在60 ℃水浴中加熱，待樣品完全溶解，再進(jìn)行取樣。稱取蜂蜜樣品50.00 mg，置于離心管中，加入600 μL磷酸鹽緩沖溶液。在渦旋混合器上振蕩10 min，實(shí)現(xiàn)均勻混合?；旌衔镫x心10 min，取550 μL上清液轉(zhuǎn)移到5 mm NMR管中。共配制303 個(gè)油菜蜜的NMR樣品待檢。

對(duì)于糖漿摻假蜂蜜，按上面所述方法，共配制成180 個(gè)NMR待測(cè)樣品。

對(duì)于果葡糖漿，按上面所述方法，共配制成18 個(gè)NMR待測(cè)樣品。

1.4.2 NMR測(cè)試及數(shù)據(jù)處理

油菜蜜樣品、糖漿摻假樣品以及果葡糖漿樣品的NMR測(cè)試在500 MHz液體NMR儀上進(jìn)行，使用寬帶反檢測(cè)探頭，溫度298 K。采用noesypr1d脈沖序列（90°-t1-90°-tm-90°-采樣）采集1D1H NMR譜。序列中90°脈沖的脈寬為10.2 μs，t1和tm（混合時(shí)間）分別設(shè)為4 μs和100 ms，延遲等待時(shí)間為2.0 s。采用預(yù)飽和方法進(jìn)行水峰抑制，即施加強(qiáng)度約為50 Hz的低功率連續(xù)波脈沖照射水峰，持續(xù)時(shí)間2.0 s。1H NMR的譜寬設(shè)為δ 20，采樣點(diǎn)數(shù)為32 768，信號(hào)累加次數(shù)為64 次。

使用Topspin軟件（3.2, Bruker Biospin）對(duì)采集到1D1H NMR數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。變換點(diǎn)數(shù)設(shè)為65 536，指數(shù)線寬因子為0.3 Hz，手動(dòng)調(diào)相位和基線校正。內(nèi)標(biāo)TSP的共振峰設(shè)為δ 0.00，進(jìn)行化學(xué)位移定標(biāo)。將處理好的1H NMR譜圖導(dǎo)入AMIX軟件（3.9.11，Bruker Biospin）中進(jìn)行分段積分。為消除殘余水信號(hào)的影響，剔除δ 4.73～δ 4.93區(qū)間的信號(hào)。采用峰面積歸一化，即各分段積分值除以積分區(qū)域總的峰面積，得到歸一化的強(qiáng)度積分?jǐn)?shù)據(jù)。

1.4.3 多元統(tǒng)計(jì)分析

1.4.3.1 訓(xùn)練集和測(cè)試集的構(gòu)建

從303 個(gè)油菜蜜樣品中隨機(jī)選出213 個(gè)樣品，從180 個(gè)糖漿摻假蜂蜜樣品中選出100 個(gè)樣品（5 種糖漿摻入量，每種各20 個(gè)），構(gòu)成訓(xùn)練集，共313 組強(qiáng)度積分值數(shù)據(jù)；余下的90 個(gè)油菜蜜樣品和80 個(gè)糖漿摻假蜂蜜樣品（5 種糖漿摻入量，每種各16 個(gè)）組成測(cè)試集，共170 組強(qiáng)度積分值數(shù)據(jù)。

1.4.3.2 OPLS法

油菜蜜樣品和糖漿摻假蜂蜜樣品的類別變量值分別設(shè)為1和2，作為因變量（Y變量）。歸一化的強(qiáng)度積分值作為自變量（X變量）。將訓(xùn)練集數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P+ 14.0（Umetrics, Ume?, Sweden）軟件中，采用自適換算進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。隨后進(jìn)行OPLS計(jì)算，得到判別模型。采用排列實(shí)驗(yàn)法對(duì)模型的可靠性進(jìn)行檢驗(yàn)。將測(cè)試集樣品的數(shù)據(jù)代入經(jīng)過檢驗(yàn)的模型，計(jì)算得到各樣品的類別變量值。當(dāng)類別變量Y在1±0.5之間時(shí)，樣品判斷為油菜蜜；當(dāng)類別變量Y在2±0.5之間時(shí)，樣品判斷為糖漿摻假蜂蜜。

2 結(jié)果與分析

2.1 油菜蜜1H NMR譜圖分析

圖1 油菜蜜樣品的1H NMR譜圖Fig.1 Complete1H NMR spectrum with local enlargement of a rape honey

圖1a顯示了油菜蜜樣品的1H NMR譜圖，大致可以分成3 個(gè)區(qū)域，包括脂肪區(qū)（δ 0.00～δ 3.00）、糖類化合物區(qū)（δ 3.00～δ 6.00）和芳香區(qū)（δ 6.00～δ 9.50）。通過化學(xué)位移、J偶合常數(shù)、文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)照[36-40]以及13C NMR譜、1H-1H化學(xué)位移相關(guān)譜、1H-13C異核單量子相干譜可以對(duì)其中大部分信號(hào)進(jìn)行歸屬，鑒定出多個(gè)化合物。比較強(qiáng)的共振峰都集中在δ 3.00～δ 6.00之間，主要是蜂蜜中葡萄糖和果糖的信號(hào)。蜂蜜中存在α-吡喃葡萄糖（α-glucopyranose，α-Glu）和β-吡喃葡萄糖（β-glucopyranose，β-Glu）兩種葡萄糖構(gòu)型。δ 5.243的雙峰信號(hào)歸屬為來自α-吡喃葡萄糖的C（1）H，受到C（2）H的偶合而裂分，J偶合常數(shù)為3.75 Hz；β-吡喃葡萄糖C（1）H的化學(xué)位移為δ 4.654，受C（2）H的偶合而裂分成雙峰，J偶合常數(shù)為7.95 Hz。β-吡喃葡萄糖C（2）H的化學(xué)位移為δ 3.252，分別受到C（1）H和C（3）H的偶合，為雙二重峰形。果糖在蜂蜜中主要以β-吡喃果糖（β-fructopyranose，β-FP）、α-呋喃果糖（α-fructofuranose，α-FF）和β-呋喃果糖（β-fructofuranose，β-FF）3 種構(gòu)型存在。β-FP的含量最高，β-FF次之，α-FF最少。果糖的信號(hào)主要集中在δ 3.5～δ 4.2之間（圖1b），可以觀察到β-FP的C（6）H?為dd峰形，其中一個(gè)雙重峰的化學(xué)位移為δ 4.041，另一個(gè)雙重峰與α -FF 4（C）H、β-FPC（5）H的信號(hào)重疊（δ 4.028～δ 3.983）；δ 4.088～δ 4.15的信號(hào)來至α-FF C（4）H和β-FF C（3）H、C（4）H。葡萄糖、果糖的詳細(xì)1H NMR數(shù)據(jù)見表1。

表1 油菜蜜中主要糖類化合物的1H NMR數(shù)據(jù)Table1 1H NMR data for carbohydrates present in rape honey

續(xù)表1

表2 油菜蜜中低含量化合物的1H NMR數(shù)據(jù)Table2 1H NMR data for minor compounds present in rape honey

脂肪區(qū)的共振峰主要來自氨基酸、有機(jī)酸以及乙醇等化合物?？梢杂^察到纈氨酸、乙醇、乳酸、丙氨酸和乙酸的CH3基團(tuán)信號(hào)以及脯氨酸、谷氨酰胺、琥珀酸的CH2基團(tuán)信號(hào)（圖1c），例如δ 1.188的三重峰信號(hào)來自乙醇的CH3基團(tuán)；δ 1.483的雙峰信號(hào)歸屬為丙氨酸的CH3基團(tuán)，J偶合常數(shù)為7.34 Hz；δ 2.408的單峰信號(hào)歸屬為琥珀酸的CH2基團(tuán)。芳香區(qū)處于譜圖的低場(chǎng)區(qū)，可以鑒定出5-羥甲基糠醛、酪氨酸、苯丙氨酸以及甲酸（圖1d）。例如，可以觀測(cè)到酪氨酸苯環(huán)上的C（3）H、C（5）H和C（2）H、C（6）H兩組質(zhì)子的雙重峰信號(hào)，化學(xué)位移分別為δ 6.906、δ 7.197。以上化合物的共振峰都較弱，反映出其在蜂蜜中的含量較少。各化合物在油菜蜜1H NMR中出現(xiàn)的特征峰歸屬見表2。

2.2 果葡糖漿和果葡糖漿摻假蜂蜜的1H NMR譜

果葡糖漿也稱高果糖漿或異構(gòu)糖漿。工業(yè)上主要采用淀粉為原料，經(jīng)過液化、糖化轉(zhuǎn)化成葡萄糖，再經(jīng)葡萄糖異構(gòu)酶將其中的一部分葡萄糖異構(gòu)成果糖，形成果糖和葡萄糖的混合糖漿。按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[41]，果糖和葡萄糖的含量應(yīng)占糖漿干物質(zhì)的92%以上。本實(shí)驗(yàn)共收集了18 種果葡糖漿，每種糖漿都采集了1H NMR譜。圖2顯示了其中一個(gè)果葡糖漿的1H NMR譜。與油菜蜜的1H NMR譜一致，強(qiáng)的共振峰都出現(xiàn)在δ 3.00～δ 6.00之間，主要是葡萄糖和果糖的信號(hào)。而在脂肪區(qū)與芳香區(qū)，分別可以觀察到乳酸、乙酸以及甲酸的共振峰，其他信號(hào)較少。油菜蜜1H NMR譜中出現(xiàn)的丙氨酸、脯氨酸等5 種氨基酸的特征峰并未在該果葡糖漿樣品的1H NMR譜中觀察到。同時(shí)，也沒有發(fā)現(xiàn)果葡糖漿自身獨(dú)有的共振峰。其余17 個(gè)果葡糖漿的1H NMR譜與之類似，限于篇幅未列出。

果葡糖漿成分單一，油菜蜜成分復(fù)雜。對(duì)于油菜蜜含有而果葡糖漿不含有的化合物，糖漿的摻入起著一種“稀釋”作用。隨著糖漿摻入量的增加，這些化合物的含量在降低。在1H NMR譜上可以觀察到其相應(yīng)的共振峰亦隨之下降。圖2顯示了果葡糖漿摻假蜂蜜的1H NMR譜，糖漿配制比例分別為5%和50%。對(duì)于果葡糖漿摻入量樣品（5%），稀釋效應(yīng)不明顯，其1H NMR譜與油菜蜜樣品的1H NMR譜極為相似，很難區(qū)分。而果葡糖漿摻入量樣品（50%），稀釋效應(yīng)較明顯，觀察到丙氨酸、脯氨酸等5 種氨基酸，其特征峰的強(qiáng)度都有下降。

圖2 果葡糖和果葡糖漿摻假蜂蜜的1H NMR譜Fig.2 1H NMR spectra of high fructose syrup and adulterated honey samples

2.3 正交成分個(gè)數(shù)的確定

OPLS的最大特點(diǎn)是可以去除自變量X中與因變量Y無關(guān)的數(shù)據(jù)變異（即與Y正交的成分）。通過反復(fù)迭代，逐次增加去除的正交成分，可以有效地消除數(shù)據(jù)中的結(jié)構(gòu)噪聲和信息冗余。正交成分?jǐn)?shù)的多少對(duì)模型的預(yù)測(cè)性能有一定影響。對(duì)于1.4.3節(jié)構(gòu)建的訓(xùn)練集和測(cè)試集數(shù)據(jù)（積分區(qū)間為δ 0.1～δ 9.5，積分間隔為δ 0.004），依次增加去除的正交成分?jǐn)?shù)，分別建立OPLS模型。利用這些模型對(duì)訓(xùn)練集和測(cè)試集樣品進(jìn)行判別，將發(fā)生誤判的樣品個(gè)數(shù)作為衡量模型優(yōu)劣的一個(gè)指標(biāo)，誤判數(shù)越少，模型性能越好。正交成分?jǐn)?shù)對(duì)模型的影響如圖3所示。

圖3 正交成分?jǐn)?shù)對(duì)樣品誤判數(shù)的影響Fig.3 Effect of orthogonal components on misclassif i cation

從圖3可以看出，對(duì)訓(xùn)練集樣品的誤判數(shù)隨著正交成分?jǐn)?shù)的增加而減少，例如正交成分?jǐn)?shù)為1，誤判個(gè)數(shù)為29；正交成分?jǐn)?shù)增加到11，則只有1例誤判。對(duì)于測(cè)試集樣品，誤判數(shù)隨著正交成分?jǐn)?shù)的增加先減少后增加。正交成分?jǐn)?shù)等于7時(shí)，誤判數(shù)最少（9 例）；正交成分?jǐn)?shù)為11，誤判個(gè)數(shù)增加到17。這說明模型中去除的正交成分?jǐn)?shù)過多會(huì)導(dǎo)致過擬合現(xiàn)象，即訓(xùn)練集判別正確率很高而測(cè)試集判別正確率較低。因此確定最佳的正交成分?jǐn)?shù)不能僅僅依靠訓(xùn)練集的結(jié)果，還應(yīng)參考測(cè)試集的計(jì)算結(jié)果。在后面的計(jì)算中，正交成分?jǐn)?shù)都確定為7。

2.41H NMR譜積分區(qū)間的選擇

在利用1H NMR譜建模過程中，需要選擇合適的化學(xué)位移區(qū)域，進(jìn)行分段積分。如果選取的積分區(qū)間過小，將會(huì)因不能完整反映樣品的信息而導(dǎo)致模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度降低；如果選取的積分區(qū)間過大，引入的噪聲信號(hào)會(huì)增加，降低建模和預(yù)測(cè)效率。如有研究者在對(duì)啤酒1H NMR數(shù)據(jù)的主成分分析中，經(jīng)過比較只選擇了碳水化合物區(qū)間（δ 3.0～δ 5.5）的積分?jǐn)?shù)據(jù)[38]。根據(jù)2.1節(jié)的分析，油菜蜜樣品的1H NMR譜圖可以分成3 個(gè)區(qū)域，因此建立了5 種積分區(qū)間。積分區(qū)間1（δ 0.1～δ 9.5）包括了脂肪區(qū)、糖類化合物區(qū)和芳香區(qū)，相當(dāng)于全譜；積分區(qū)間2（δ 0.1～δ 6.0）由脂肪區(qū)、糖類化合物區(qū)組成；積分區(qū)間3（δ 3.0～δ 9.5）由糖類化合物區(qū)和芳香區(qū)組成。積分區(qū)間4去除了信號(hào)最強(qiáng)的糖類化合物區(qū)，只含脂肪區(qū)（δ 0.1～δ 3.0）和芳香區(qū)（δ 6.0～δ 9.5）。積分區(qū)間5 只包含糖類化合物區(qū)（δ 3.0～δ 6.0）。表3列出了采用不同積分區(qū)間建立的OPLS模型對(duì)訓(xùn)練集和測(cè)試集樣品進(jìn)行判別的結(jié)果，包括訓(xùn)練集的交叉驗(yàn)證均方根誤差（root mean square error of cross validation，RMSECV）和測(cè)試集的預(yù)測(cè)均方根誤差（root mean square error of predication，RMSEP）。從表3可以看出，選擇不同的積分區(qū)間確實(shí)會(huì)對(duì)模型的預(yù)測(cè)性造成一定影響?？疾煊?xùn)練集的交叉驗(yàn)證誤判數(shù)，積分區(qū)間1和2的結(jié)果相接近，明顯低于其他3種積分區(qū)間。對(duì)測(cè)試集樣品進(jìn)行判別，采用積分區(qū)間2建立的OPLS模型的誤判數(shù)為3，RMSEP為0.264 1，小于積分區(qū)間1的結(jié)果（誤判數(shù)為9，RMSEP為0.302 1）。因此積分區(qū)間2是最佳的選擇。這也可以從譜圖分析中得到解釋。芳香區(qū)的信號(hào)較少，并且強(qiáng)度比較弱。積分區(qū)間包含芳香區(qū)后反而增加了噪聲信號(hào)，導(dǎo)致模型性能下降。在以下的計(jì)算中均選擇積分區(qū)間2（δ 0.1～δ 6.0）進(jìn)行分段積分。

表3 基于不同積分區(qū)間建立的模型對(duì)訓(xùn)練集和測(cè)試集的判別結(jié)果Table3 Results of discrimination of training and testing sets based on models with various integral regions

2.5 基于OPLS的蜂蜜摻假判別

構(gòu)建的訓(xùn)練集中包含313 個(gè)樣品（油菜蜜樣品213 個(gè)，糖漿摻假蜂蜜樣品100 個(gè)），選擇的積分區(qū)間為δ 0.1～δ 6.0，積分間隔為δ 0.004。剔除殘余的水信號(hào)，共獲得1 426 個(gè)強(qiáng)度積分變量，構(gòu)成313×1 426的數(shù)據(jù)矩陣。利用OPLS對(duì)其進(jìn)行分析，建立模型。當(dāng)去除7個(gè)正交成分后，模型的和Q2分別達(dá)到了0.852、0.783，其中和Q2分別表示模型對(duì)因變量Y的擬合能力以及模型的預(yù)測(cè)能力。以預(yù)測(cè)成分的得分值（tp[1]）和第1個(gè)正交成分的得分值（to[2]）分別作為橫縱坐標(biāo)繪制得分散點(diǎn)圖。如圖4所示，油菜蜜樣品和糖漿摻假蜂蜜樣品可以在得分散點(diǎn)圖上明顯區(qū)分，即組內(nèi)聚集、組間分開，可視化效果明顯。

圖4 訓(xùn)練集樣品OPLS得分圖Fig.4 OPLS score plot of training set

為驗(yàn)證模型的可靠性，采用排列實(shí)驗(yàn)法。該方法保持X變量不變，通過隨機(jī)變化Y變量的順序，觀察多個(gè)Y變量的順序隨機(jī)排列的模型與原始Y變量模型之間的差異。然后對(duì)Y變量順序隨機(jī)排列模型的R2值、Q2值與原始鑒別模型的R2值、Q2值之間做回歸線?；貧w線的斜率越大，與縱軸的截距越小，提示有越多的數(shù)據(jù)用來解釋模型，因而模型的預(yù)測(cè)能力也比較好。若原始模型的預(yù)測(cè)能力（Q2值）大于任何一個(gè)Y變量隨機(jī)排列模型的預(yù)測(cè)能力，則模型質(zhì)量較好，反之此模型較差。判別模型可靠性的驗(yàn)證如圖5所示，共進(jìn)行160 次隨機(jī)排列，R2回歸線、Q2回歸線與縱軸的截距分別為0.301、-0.429。最右端原始鑒別模型的Q2值大于左邊任何一個(gè)Y變量隨機(jī)排列模型的Q2值。因此驗(yàn)證結(jié)果顯示模型有效可靠。

圖5 排列實(shí)驗(yàn)對(duì)OPLS模型的可靠性驗(yàn)證Fig.5 Validation of OPLS model by permutation test

利用OPLS鑒別模型對(duì)訓(xùn)練集和測(cè)試集樣品的類別變量值進(jìn)行計(jì)算。計(jì)算值在1±0.5之間的樣品為油菜蜜樣品，計(jì)算值在2±0.5之間的為糖漿摻假蜂蜜樣品。若計(jì)算值不在上述范圍內(nèi)，則判定樣品歸類不明確。圖6中以樣品類別變量的真實(shí)值為縱坐標(biāo)，計(jì)算值為橫坐標(biāo)，繪制散點(diǎn)圖，反映了訓(xùn)練集和測(cè)試集中樣品類別變量真實(shí)值與計(jì)算值之間的關(guān)系。從圖6a可以發(fā)現(xiàn)，訓(xùn)練集中共有5 個(gè)樣品發(fā)生了誤判，其中假陽(yáng)性2 個(gè)（油菜蜜樣品判別為糖漿摻假樣品），假陰性3 個(gè)（糖漿摻假樣品判別為油菜蜜樣品）?？傮w正確率為98.40%。將測(cè)試集數(shù)據(jù)帶入訓(xùn)練集創(chuàng)建的OPLS模型中進(jìn)行驗(yàn)證，根據(jù)計(jì)算得到的類別變量值判斷樣品的真假。類別變量計(jì)算值與真實(shí)值之間的差異由RMSEP表示。測(cè)試集的總體正確率為98.24%，只有3 個(gè)樣品的判別結(jié)果為假陰性，RMSEP為0.264 1。上述計(jì)算結(jié)果可以說明OPLS模型對(duì)判斷蜂蜜摻假具有較高的可靠性。

圖6 訓(xùn)練集（a）和測(cè)試集（b）中樣品類別變量真實(shí)值與計(jì)算值之間的關(guān)系圖Fig.6 Relationship between real value and calculated values of training (a) and testing sets (b)

在上述判別分析中，共出現(xiàn)6 例假陰性（訓(xùn)練集樣品3 個(gè)，測(cè)試集樣品3 個(gè)）。經(jīng)檢查，發(fā)生誤判的這些樣品的果葡糖漿摻入量都較低，其中5%糖漿摻入量的樣品有4 個(gè)，10%糖漿摻入量樣品有2個(gè)。而糖漿摻入量在30%以上的樣品都得到正確判斷。表4列出了不同糖漿摻入量樣品的均方根誤差及判別結(jié)果。均方根誤差越小，代表判別的可靠性越高。從表4可以看出，較高糖漿摻入量樣品（30%以上）的均方根誤差明顯比低糖漿摻入量樣品（5%、10%）的小。說明不同的糖漿摻入量確實(shí)會(huì)對(duì)樣品的判別造成一定影響。

表4 OPLS模型對(duì)不同糖漿摻入量樣品的判別結(jié)果Table4 Results of discrimination of adulterated samples with various syrup concentrations based on OPLS model

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用1H NMR技術(shù)和OPLS分析結(jié)合的方法進(jìn)行蜂蜜果葡糖漿摻假的判別分析，建立了數(shù)學(xué)模型，其結(jié)果能很好地區(qū)分油菜蜜樣品和果葡糖漿摻假蜂蜜樣品，并在譜圖分析、數(shù)據(jù)處理和模型驗(yàn)證等方面進(jìn)行了研究探討。對(duì)蜂蜜的主要成分葡萄糖、果糖的1H NMR信號(hào)進(jìn)行了全部歸屬，發(fā)現(xiàn)了蔗糖、丙氨酸、酪氨酸等10 個(gè)低含量化合物的特征峰。討論了在建立OPLS判別模型中正交成分?jǐn)?shù)以及1H NMR譜積分區(qū)間的選擇。經(jīng)過比較，最佳的正交成分?jǐn)?shù)確定為7，譜圖積分區(qū)間為δ 0.1～δ 6.0。包含313 個(gè)樣品的訓(xùn)練集建立的OPLS判別模型對(duì)訓(xùn)練集和測(cè)試集樣品的判別正確率分別達(dá)到了98.40%和98.24%，表明模型對(duì)蜂蜜果葡糖漿摻假具有較高的判別能力。總體來講，1H NMR技術(shù)具有制備樣品簡(jiǎn)單，采樣迅速，能夠獲得樣品全面的化學(xué)組成信息，與OPLS分析方法結(jié)合能夠方便、快捷、準(zhǔn)確地判別蜂蜜糖漿摻假，為蜂蜜質(zhì)量評(píng)估鑒定提供了一條新途徑。

今后研究將會(huì)進(jìn)一步收集各類蜂蜜樣品（包括摻假蜂蜜），不斷擴(kuò)充數(shù)據(jù)庫(kù)的樣本數(shù)量，對(duì)本實(shí)驗(yàn)建立的方法和模型進(jìn)行考察；同時(shí)充分利用NMR中的各種技術(shù)，并結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)手段，尋找真假蜂蜜之間的化學(xué)差異成分，為蜂蜜質(zhì)量監(jiān)控提供參考。

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Detection of Honey Adulteration with High Fructose Syrups Using1H Nuclear Magnetic Resonance and Orthogonal Partial Least Squares

CHEN Lei, LIU Hongbing, LUO Liting
(National Center for Magnetic Resonance in Wuhan, State Key Laboratory of Magnetic Resonance and Atomic and Molecular Physics, Wuhan Institute of Physics and Mathematics, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430071, China)

Combination of1H nuclear magnetic resonance (1H NMR) spectroscopy and orthogonal partial least squares (OPLS) was successfully employed to detect rape honey adulteration with high fructose syrups. Three hundred and three authentic and 180 adulterated honey samples were analyzed. Glucose, sucrose and 13 minor components in honey samples were detected and identif i ed from their1H NMR spectra. The OPLS model based on NMR data was applied to detect adulteration in honey falsif i ed by intentional addition of different concentrations of high fructose syrups. A distinct discrimination between authentic and adulterated honey samples was achieved in OPLS score plot. Overall classif i cation rates of training set and testing set were 98.40% and 98.24%, respectively. Hence,1H NMR spectroscopy coupled with OPLS offered a rapid and accurate tool for honey adulteration detection. The method avoided the disadvantage of monocomponent analysis and provided a potential standard for quality control of honey.

honey; nuclear magnetic resonance (NMR); orthogonal partial least squares (OPLS); adulteration

10.7506/spkx1002-6630-201704045

TS207.3

A

1002-6630（2017）04-0275-08

陳雷, 劉紅兵, 羅立廷. 氫核磁共振結(jié)合正交偏最小二乘法對(duì)油菜蜜中果葡糖漿摻假的判別分析[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(4): 275-282. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704045. http://www.spkx.net.cn

CHEN Lei, LIU Hongbing, LUO Liting. Detection of honey adulteration with high fructose syrups using1H nuclear magnetic resonance and orthogonal partial least squares[J]. Food Science, 2017, 38(4): 275-282. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201704045. http://www.spkx.net.cn

2016-06-15

中國(guó)科學(xué)院儀器設(shè)備功能開發(fā)技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目（YG2011095）

陳雷（1977—），男，高級(jí)工程師，博士，研究方向?yàn)榇殴舱窦夹g(shù)及應(yīng)用。E-mail：chenlei@wipm.ac.cn