北宗黃酒麥曲微生物的分離鑒定

任 清，侯 昌

（北京工商大學食品學院，食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 100048）

北宗黃酒麥曲微生物的分離鑒定

任 清，侯 昌

（北京工商大學食品學院，食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 100048）

利用梯度稀釋法和劃線純化法對麥曲中的微生物進行分離純化，得到7 株細菌和5 株真菌。通過形態(tài)學特征觀察和分子生物學方法進行菌種鑒定，細菌分別為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）、萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）、克勞氏芽孢桿菌（Bacillus clausii）、根際芽孢桿菌（Bacillus rhizosphaerae）、索諾拉沙漠芽孢桿菌（Bacillus sonorensis）。真菌分別為米曲霉（Aspergillus oryzae）、黑曲霉（Aspergillus niger）、根菌屬（Talaromyces radicus）、粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）、傘狀犁頭霉（Absidia corymbifera）。

北宗黃酒；麥曲；微生物；鑒定；分離

黃酒產(chǎn)自中國，是世界上最古老的酒類之一，黃酒酒體柔和、香氣優(yōu)雅、營養(yǎng)豐富，并且具有獨特的保健功能[1]。以谷物為原料，“以麥制曲、用曲發(fā)酵”的傳統(tǒng)釀造工藝成就了我國黃酒獨有的品質(zhì)特征。麥曲是將小麥經(jīng)軋碎后加水拌勻踏成曲坯，經(jīng)自然培養(yǎng)而成的一種含多種微生物和酶系的復合糖化發(fā)酵劑。釀造過程中，麥曲微生物不僅發(fā)揮了糖化發(fā)酵作用，而且具有重要的生香增味作用，麥曲微生物的種類和密度對黃酒的出酒率和風味品質(zhì)有極大的影響[2]。因此，從麥曲中分離鑒定微生物并對其進行生物學研究，對于黃酒生產(chǎn)和品質(zhì)調(diào)控具有重要的意義。

黃酒分南方黃酒和北方黃酒兩大系列，南方黃酒以稻米為原料，北方黃酒以粟或黍為原料，所用麥曲也完全不同。近年來，我國黃酒領域的科技工作者已經(jīng)對南方黃酒麥曲微生物進行了分離鑒定，并對其進行了初步研究分析[3-6]，而對北方黃酒麥曲微生物的研究甚少報道，北宗黃酒是我國北方黃酒的典型代表，本研究對北宗黃酒麥曲中的微生物進行分離、純化和鑒定，以期為北方黃酒生產(chǎn)和品質(zhì)調(diào)控提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

北宗黃酒麥曲由張家口北宗黃酒釀造有限公司提供；通用引物（27f和1492r、ITS-4和ITS-5）由華大基因公司合成。

2×Utaq PCR Mix、DNA Marker Ⅶ、6×DNA loading buffer 北京莊盟國際生物基因科技有限公司；植物基因組DNA提取試劑盒 天根生化試劑公司。

卵磷脂吐溫-80營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨20 g、牛肉膏粉3 g、氯化鈉5 g、卵磷脂1 g、吐溫-80 7 g、瓊脂15 g，加蒸餾水定容至1 L，加熱煮沸溶解，121 ℃高壓滅菌20 min。孟加拉紅固體（rose bengal agar，RBA）培養(yǎng)基：蛋白胨5 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、葡萄糖10 g、氯霉素0.1 g、孟加拉紅0.033 g、瓊脂18.5 g，加蒸餾水定容至1 L，加熱煮沸溶解，121 ℃高壓滅菌20 min。馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：200 g去皮土豆切成小塊放入鍋中，加水1 L，煮沸30 min，紗布過濾，加葡萄糖20 g，瓊脂粉18 g，加蒸餾水定容至1 L，煮沸溶解，121 ℃高壓滅菌20 min；其液體培養(yǎng)基配制時不加瓊脂粉。

1.2 儀器與設備

XP基因擴增儀 杭州博日科技有限公司；Axio Image A1顯微鏡 德國Zeiss公司；DYY-6C型電泳儀北京六一儀器廠；Imager 2200凝膠成像系統(tǒng) 美國Alpha公司；高壓滅菌鍋 日本三洋公司；恒溫培養(yǎng)箱北京天林恒泰科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的分離純化

稱取10 g粉碎的麥曲，加入裝有90 mL無菌水和若干玻璃珠的250 mL三角瓶中，然后置于恒溫搖床中，27 ℃條件下200 r/min振蕩30 min，至搖散混勻，使麥曲中微生物均勻分散在無菌水中，此樣品稀釋度為10-1。然后將此樣品進行10 倍梯度稀釋，并稀釋至10-6。取10-3、10-4、10-5的稀釋液，分別涂布于卵磷脂吐溫-80營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、RBA培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基平板，涂布量為100 μL，每種培養(yǎng)基每個稀釋倍數(shù)各涂布3 個平行，待菌液完全吸收后，倒置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中需氧培養(yǎng)1～5 d。根據(jù)菌落生長形態(tài)，大小及顏色的不同，分別挑取不同的單菌落接種于相應的固體培養(yǎng)基中進行純化，直至得到單一微生物。之后進行鏡檢，確定是單一菌后進行保菌，并放入4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 菌落及菌體形態(tài)觀察

將分離得到的細菌在卵磷脂吐溫-80營養(yǎng)瓊脂上進行劃線，于37 ℃條件下需氧培養(yǎng)24 h后觀察菌落生長情況及菌落形態(tài)。通過革蘭氏染色、顯微鏡觀察菌體形態(tài)。將分離得到的真菌同時在RBA和PDA固體培養(yǎng)基上需氧培養(yǎng)，25 ℃條件下培養(yǎng)5～7 d后觀察菌落生長情況及菌落形態(tài)。

1.3.3 細菌的分子生物學鑒定

細菌基因組DNA的提取：將單一菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。12 000 r/min離心2 min收集菌體，洗滌，十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium ammonium bromide，CTAB）法提取基因組DNA作為PCR的模板[7]。

采用通用引物27f（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492r（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）擴增細菌的16S rDNA序列[8]。反應體系（50 μL）為：25 μL 2×Taq PCR MasterMix（含染料）、21 μL ddH2O、2 μL菌懸液、1 μL 27f（10 μmol/L）、1 μL 1492r（10 μmol/L）。PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30 個循環(huán)；然后72 ℃延伸10 min，4 ℃暫時保存，-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩Ｈ? μL的PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

電泳檢測后的PCR產(chǎn)物由華大基因完成純化和測序，獲得16S rRNA基因序列。測序結果在NCBI的GenBank中進行BLAST分析比對，進行同源序列搜索，根據(jù)同源序列搜索結果，導找相關模式菌株的16S rRNA基因序列區(qū)，與實驗菌株一起用MEGA6構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.3.4 真菌的分子生物學鑒定

挑取真菌平板上的菌絲于20 mL的PDA液體培養(yǎng)基，在25 ℃恒溫搖床中200 r/min振蕩培養(yǎng)3 d。菌體收集采用2 層無菌紗布過濾菌體，然后用0.85%的無菌生理鹽水沖洗2～3 次，最后用無菌濾紙將水分吸盡。將菌體放入無菌研缽中，加入液氮充分碾磨至粉狀。然后用植物基因組DNA提取試劑盒提取真菌的全基因組DNA。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用I T S區(qū)擴增通用引物I T S-4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）和ITS-5（5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’）進行PCR擴增[9]。反應體系（50 μL）：25 μL 2×Taq PCR MasterMix（含染料）、20 μL ddH2O、3 μL 模板、1 μL ITS-4（10 μmol/L）、1 μL ITS-5（10 μmol/L）。PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，51 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30 個循環(huán)；然后72 ℃延伸10 min，4 ℃條件下暫時保存，-20 ℃條件下保存?zhèn)溆?。? μL的PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

電泳檢測后的PCR產(chǎn)物由華大基因完成純化和測序。測序結果在NCBI的GenBank中進行BLAST分析比對，進行同源序列搜索，根據(jù)同源序列搜索結果，尋找相關模式菌株的ITS區(qū)基因序列，與實驗菌株序列一起用MEGA6構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

2 結果與分析

2.1 細菌的菌落形態(tài)觀察結果

從麥曲中分離，純化后得到7 株細菌，依次編號為B1、B2、B3、B4、B5、B6和B7（圖1）。7 株細菌在卵磷脂吐溫-80營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上需氧培養(yǎng)24 h后，菌落形態(tài)上存在一定的差異。B1菌落呈現(xiàn)圓鋸齒狀，表面濕潤有光澤且有大量的黏液，菌落大，直徑4～5 mm；B2菌落為淺黃色，較薄，表面黏濕，邊緣不整齊，有很多樹葉邊緣狀的突起；B3菌落顏色較淡，菌落邊緣不整齊，且不透明；B4菌落表面粗糙不透明，微黃色；B5菌落小，菌落邊緣不整齊，微透明；B6菌落微黃色，邊緣不整齊，表面黏濕，不凸起，不透明；B7菌落較小，且菌落中心有一白色小點。7 株細菌經(jīng)革蘭氏染色，均為革蘭氏陽性菌。

圖1 麥曲中7 株細菌在卵磷脂吐溫-80營養(yǎng)瓊脂及37 ℃條件下的菌落特征Fig.1 Colony morphologies of seven isolated bacterial strains on lecithin Tween 80 nutrient agar (37 ℃)

2.2 細菌16S rRNA基因序列PCR擴增結果

如圖2所示，以CTAB提取的7 株細菌的DNA為模板，27f和1492r為引物，PCR擴增后得到的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析和紫外檢測后，所擴增的目的片段電泳條帶清晰且特異性強，大小約為1 500 bp，與實驗設計吻合。

2.3 細菌16S rRNA基因序列同源性比對與系統(tǒng)發(fā)育分析

圖3 以16S rRNA基因序列為分子標記的7 株細菌系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.3 Phylogentic tree of seven isolated bacterial strains based on their 16S rRNA sequences

將菌株B1～B7的16S rRNA基因序列與GenBank內(nèi)已知菌株的相應序列進行比對，通過同源性比對結果構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。如圖3所示，菌株B1～B7與多株Bacillus sp.的同源性達99%以上，菌株B1與Bacillus licheniformis NBRC 12200（AB680255.1）在同一分枝上，且通過Bootstrap的驗證表明它們具有較高的置信度，支持率可達到100%（圖3a），因此可將分離菌株B1確定為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。菌株B2與Bacillus pumilus ATCC 7061（JQ424887.1）在同一分枝上，且通過Bootstrap的驗證表明它們具有較高的置信度，支持率可達到100%（圖3b），因此可將分離菌株B2確定為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）。菌株B3與Bacillus atrophaeus NBRC 15539（AB363731.1）在同一分枝上，且通過Bootstrap的驗證表明它們具有較高的置信度，支持率達到99%（圖3c），因此可將分離菌株B3確定為萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）。菌株B4與Bacillus subtilis DSM10 （JQ424889.1）在同一分枝上，且通過Bootstrap的驗證表明它們具有較高的置信度，支持率達到100%（圖3d），因此可將分離菌株B4確定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。菌株B5與Bacillus clausii DTM1（KR632489.1）在同一分枝上，且通過Bootstrap的驗證表明它們具有較高的置信度，支持率達到100%（圖3e），因此可將分離菌株B5確定為克勞氏芽孢桿菌（Bacillus clausii）。菌株B6與Bacillus rhizosphaerae SC-N012（FJ233848.1）在同一分枝上，且通過Bootstrap的驗證表明它們具有較高的置信度，支持率達到100%（圖3f），因此可將分離菌株B6確定為根際芽孢桿菌（Bacillus rhizosphaerae）。菌株B7與Bacillus sonorensis LG-2（KT725252.1）在同一分枝上，且通過Bootstrap的驗證表明它們具有較高的置信度，支持率達到98%（圖3g），因此可將分離菌株B7確定為索諾拉沙漠芽孢桿菌（Bacillus sonorensis）。

2.4 真菌的菌落形態(tài)觀察結果

圖4 5 株真菌在PDA和RBA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)7 d的菌落特征Fig.4 Colony morphologies of fi ve isolated fungal strains on PDA and RBA media (25 ℃ for 7 d)

由圖4可知，5 株真菌在PDA培養(yǎng)基上生長均較RBA培養(yǎng)基上旺盛。F1在RBA培養(yǎng)基上初期呈現(xiàn)白色，后期呈暗黃色，致密絨毛狀，菌落邊緣清晰，在PDA培養(yǎng)基上則呈綠色，邊緣清晰，孢子密度高；F2在RBA和PDA培養(yǎng)基上菌落形態(tài)無太大差異，菌落呈黑褐色，平滑粗糙，菌落邊緣清晰，分生孢子頭褐黑色放射狀，分生孢子梗長短不一，且在PDA上菌落周圍有少量白色菌絲；F3在RBA和PDA培養(yǎng)基上菌落形態(tài)基本相同，呈灰色菌落，菌落邊緣較清晰，無菌絲；F4在RBA和PDA培養(yǎng)基上菌落形態(tài)基本相同，生長速率快，菌落邊緣不明顯，具有疏松的網(wǎng)狀長菌絲，有氣生菌絲，在顯微鏡下其菌絲透明，有分枝和分隔，分生孢子呈桔黃色；F5在RBA和PDA培養(yǎng)基上菌落形態(tài)基本相同，菌絲無隔，分枝狀，廣泛蔓延，匍匐菌絲，無定形菌落，邊緣不清晰，菌絲初期白色，后期呈淡淡的暗黃色，生長速率較快。

2.5 真菌基因組DNA的提取和PCR擴增驗證

圖5 5 株真菌菌株ITS區(qū)rDNA的電泳檢測圖Fig.5 PCR analysis of ITS rDNA sequences of fi ve isolated fungal strains

將菌體用液氮充分碾磨至粉狀，然后用植物基因組DNA提取試劑盒提取真菌的全基因組作為PCR模板，以ITS4和ITS5為引物，經(jīng)PCR擴增后得到的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析和紫外檢測后，所擴增的目的片段電泳條帶清晰、特異性強，F(xiàn)1～F4條帶大小約為600 bp，F(xiàn)5的條帶大小約為850 bp，與實驗設計吻合（圖5）。

2.6 rDNA ITS同源性比對與系統(tǒng)發(fā)育分析

將菌株F1～F5的ITS rDNA基因序列與GenBank內(nèi)已知菌株的相應序列進行比對，通過同源性比對結果構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。由圖6可知，菌株F1與Aspergillus oryzae IFO 5375（AB000533.1）在同一分枝上，且通過Bootstrap的驗證表明它們具有較高的置信度，支持率可達到99%（圖6A）。菌株F2與Aspergillus niger CBS 139.52（FJ629347.1）在同一分枝上，且通過Bootstrap的驗證表明它們具有較高的置信度，支持率達到99%（圖6B）。菌株F3與Talaromyces radicus KUC 1679（HM469413.1）在同一分枝上，且通過Bootstrap的驗證表明它們具有很高的置信度，支持率達到100%（圖6C）。菌株F4與Neurospora crassa（AY681193.1）在同一分枝上，且通過Bootstrap的驗證表明它們具有比較高的置信度，支持率達到97%（圖6D）。菌株F5與Absidia corymbifera IP 1129.75（DQ118982.1）在同一分枝上，且通過Bootstrap的驗證表明它們具有很高的置信度，支持率達到100%（圖6E）。

圖6 以ITS rDNA基因序列為分子標記的5 株真菌菌株系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.6 Phylogentic tree of fi ve isolated fungal strains based on ITS rDNA sequences

結合圖4的形態(tài)特征與《真菌鑒定手冊》[10]中相應的霉菌的描述進行比較發(fā)現(xiàn)結果基本一致，因此可以將分離得到的5 株F1～F5菌株可依次確定為米曲霉（Aspergillus oryzae）、黑曲霉（Aspergillus niger）、Talaromyces radicus、粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）、傘狀犁頭霉（Absidia corymbifera）[11]。

3 結論與討論

通過對麥曲中微生物進行菌落形態(tài)觀察，鏡檢和分子生物學鑒定，最終分離純化得到7 株細菌和5 株霉菌。

紹興黃酒麥曲中的常見細菌有芽孢桿菌屬和葡萄球菌屬及少量泛菌屬、腸球菌屬等的細菌[12]。譚婷婷[13]從黃酒麥曲中分離得到的芽孢桿菌屬有：地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）和蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereuss）。本實驗從黃酒麥曲中除分離純化得到地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）外，還得到了短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）、萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）、克勞氏芽孢桿菌（Bacillus clausii）、根際芽孢桿菌（Bacillus rhizosphaerae）、索諾拉沙漠芽孢桿菌（Bacillus sonorensis）5 株芽孢桿菌。

實驗從黃酒麥曲中除分離純化得到米曲霉（Aspergillus oryzae）外，還分離純化得到了黑曲霉（Aspergillus niger）、根菌屬真菌（Talaromyces radicus）、粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）、傘狀犁頭霉（Absidia corymbifera）。根據(jù)文獻報道，粗糙脈孢菌產(chǎn)生的纖維素酶能降解纖維素生成纖維二糖和葡萄糖等小分子物質(zhì)，作為不能直接利用纖維素的釀酒酵母的碳源底物來進一步發(fā)酵生產(chǎn)酒精等[14-16]，粗糙脈孢菌還能夠發(fā)酵葡萄糖和木糖生產(chǎn)乙醇[17-18]；傘狀犁頭霉能產(chǎn)生淀粉分解酶，能夠將發(fā)酵過程中的糊化、液化、糖化等過程合并為一步直接進行糖化[19]；黑曲霉可產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、α-鼠李糖苷酶、淀粉降解酶、纖維素酶和半纖維素酶，在發(fā)酵糖化過程中能起到較好的作用[20-24]；米曲霉是麥曲中主要的霉菌之一，能產(chǎn)生糖化酶、α-淀粉酶、酸性蛋白酶等[25]；米曲霉和黑曲霉共同作用，能加快發(fā)酵速度，縮短主酵時間，提高黃酒釀造原料利用率，降低黃酒生產(chǎn)成本[26-27]。

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Isolation and Identif i cation of Microorganisms in Wheat Qu of Beizong Rice Wine

REN Qing, HOU Chang
(Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients, School of Food and Chemical Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

In this research, we used the gradient dilution and streak plate methods to isolate and purify microorganisms from wheat Qu for Beizong rice wine. A total of seven bacterial strains and fi ve fungal strains were obtained. Through observation of their morphological characteristics and molecular biological characterization, the bacterial strains were identified as Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Bacillus atrophaeus, Bacillus clausii, Bacillus rhizosphaerae, and Bacillus sonorensis, and the fungal strains were identif i ed as Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Talaromyces radicus, Neurospora crassa, and Absidia corymbifera.

Beizong rice wine; wheat Qu; microorganism; identif i cation; isolation

10.7506/spkx1002-6630-201704013

TS26；TS201.3

A

1002-6630（2017）04-0077-06

任清, 侯昌. 北宗黃酒麥曲微生物的分離鑒定[J]. 食品科學, 2017, 38(4): 77-82. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704013. http://www.spkx.net.cn

REN Qing, HOU Chang. Isolation and identif i cation of microorganisms in wheat Qu of Beizong rice wine[J]. Food Science, 2017, 38(4): 77-82. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201704013. http://www.spkx.net.cn

2016-04-28

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201303069-07）

任清（1969—），男，副教授，博士，研究方向為食品生物轉化和代謝過程中宏基因組學。E-mail：renqing@th.btbu.edu.cn