5-氮雜-2-脫氧胞苷對(duì)里氏木霉產(chǎn)纖維素酶的影響

周嬌嬌，佘煒怡，王浩入，謝 寧，田生禮

深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院，深圳市微生物基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳 518060

【生物工程 / Bioengineering】

5-氮雜-2-脫氧胞苷對(duì)里氏木霉產(chǎn)纖維素酶的影響

周嬌嬌，佘煒怡，王浩入，謝 寧，田生禮

深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院，深圳市微生物基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳 518060

為探究脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA) 甲基化修飾對(duì)絲狀真菌里氏木霉 (Trichodermareesei，T.reesei) 產(chǎn)纖維素酶基因表達(dá)的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制，利用不同濃度(0～1.0mmol/L)的化學(xué)修飾劑5-氮雜-2-脫氧胞苷(5-Aza-2′-deoxycytidine, 5′-Aza)培養(yǎng)T.reeseiQM9414．通過測(cè)定濾紙酶活性(filterpaperenzymaticactivities，F(xiàn)PA)和羧甲基纖維素鈉酶活性(carboxymethylcellulose-Naenzymaticactivities,CMCA)確定纖維素酶活性的變化；利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-timefluorescentquantitativepolymerasechainreaction，RT-qPCR)檢測(cè)0.1mmol/L5′-Aza培養(yǎng)的T.reeseiQM9414中纖維素酶基因cbh1、egl1、 酶激活因子xyr1基因以及分解代謝阻遏因子cre1與ace1基因的表達(dá)水平；通過甲基化特異性PCR(methylationspecificPCR，MS-PCR)分析cre1、ace1、cbh1、egl1和xyr1基因上游序列的甲基化狀態(tài)；利用Westernblot和DNA甲基化定量測(cè)定分析了DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和DNA的甲基化水平．結(jié)果顯示，0.1mmol/L5′-Aza處理后的T.reeseiQM9414菌株的FPA和CMCA最高，比出發(fā)菌株T.reeseiQM9414分別高30%和53%；RT-qPCR結(jié)果顯示，處理后的T.reeseiQM9414菌株中纖維素酶基因cbh1、egl1與酶激活因子xyr1基因的相對(duì)表達(dá)量均高于出發(fā)菌株，而分解代謝阻遏因子cre1和ace1基因的相對(duì)表達(dá)量與出發(fā)菌株無明顯差異；MS-PCR結(jié)果顯示，cbh1、egl1和xyr1基因的非甲基化狀態(tài)高于出發(fā)菌株，而分解代謝阻遏因子cre1與ace1基因的非甲基化狀態(tài)也無明顯差異；Westernblot和DNA甲基化定量測(cè)定結(jié)果分別顯示，5′-Aza處理后菌株的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)比出發(fā)菌株明顯降低，全基因組DNA甲基化程度也有下降．研究結(jié)果表明，5′-Aza處理T.reeseiQM9414菌株后，纖維素酶活性明顯增加，纖維素酶基因cbh1、egl1和激活因子xyr1基因表達(dá)水平的增加可能是通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶影響DNA甲基化水平，最終調(diào)控基因的表達(dá)．

絲狀真菌；里氏木霉；5-氮雜-2-脫氧胞苷；DNA甲基化；DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶；甲基化特異性PCR

表觀遺傳的現(xiàn)象包括脫氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid,DNA)甲基化(methylation)、基因組印記(genomicimprinting)、母體效應(yīng)(maternaleffects)、基因沉默(genesilencing)、核仁顯性、休眠轉(zhuǎn)座子激活和RNA編輯(RNAediting)等．與高等動(dòng)植物相比，大多數(shù)真菌基因組DNA中胞嘧啶甲基化程度很低或不存在甲基化[1]，多頭絨泡菌的甲基化程度為1%[2]．真菌基因組甲基化存在的機(jī)制尚不清楚[3]．粗糙脈孢菌的基因組中的重復(fù)DNA序列相對(duì)較少，約占 8%，其中81%編碼序列常發(fā)生甲基化[4]．

文獻(xiàn)[5]研究表明，在被美國食品和藥物管理局(FoodandDrugAdministration,FDA)認(rèn)證的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑中，5-氮雜胞苷(5-Azacytidine)和5-氮雜-2-脫氧胞苷(5-Aza-2′-deoxycytidine, 5′-Aza)兩者的應(yīng)用最為廣泛．其中，因5′-Aza只與DNA相結(jié)合，對(duì)RNA及蛋白質(zhì)合成的影響較5-氮雜胞苷小，同時(shí)它的脫甲基化作用大約是5-氮雜胞苷的10倍，因此，已成為目前普遍使用的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑[6]．

目前，對(duì)里氏木霉(Trichodermareesei，T.reesei)纖維素酶基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究機(jī)制己經(jīng)取得較大進(jìn)展．已鑒定出纖維素酶基因相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子有CRE1、XYR1、ACE1和ACE2，但它們與表觀遺傳之間的作用還未見詳細(xì)闡釋[7]．DNA甲基化也是調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的重要機(jī)制之一．近年來，國內(nèi)外對(duì)真菌甲基化的研究主要是利用化學(xué)修飾試劑來提高次級(jí)代謝產(chǎn)物的含量及新物質(zhì)的合成．張偉[8]研究表明，5-氮雜胞苷不僅能提高源于?？脑聽钚咔痪写蟓h(huán)內(nèi)脂化合物的表達(dá)量達(dá)3倍多，且還從月狀旋孢腔菌中分離了11種新的鄰苯化合物；孫鑒昕[9]利用5-氮雜胞苷處理刺松藻內(nèi)生真菌，分離出5種新的抗鹵蟲活性化合物；劉云鳳[10]利用5-氮雜胞苷從來源于蕾二岐燈芯柳珊瑚的真菌曲霉中分離出12種新的萜類抗菌化合物．Vasanthakumari等[11]利用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑處理青脆枝內(nèi)生真菌，提高了喜樹堿的含量．此外，還利用5-氮雜胞苷研究黃曲霉的表型以及黃曲霉素的合成．林劍青等[12]基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究黃曲霉對(duì)5-氮雜胞苷應(yīng)答機(jī)制，發(fā)現(xiàn)5-氮雜胞苷誘導(dǎo)其產(chǎn)生白色絨毛狀表型，并抑制黃曲霉素的生物合成；Yang等[13-14]研究發(fā)現(xiàn)，黃曲霉基因組缺乏甲基化，但5-氮雜胞苷能夠影響基因表達(dá)調(diào)控，使其生產(chǎn)發(fā)育紊亂，菌株表型發(fā)生突變，不再合成黃曲霉素．但5-氮雜胞苷對(duì)里氏木霉的影響研究目前尚未見報(bào)道．

本研究采用含5′-Aza的培養(yǎng)基培養(yǎng)里氏木霉T.reeseiQM9414，研究DNA去甲基化對(duì)里氏木霉菌絲的生長以及纖維素酶表達(dá)的影響，為里氏木霉纖維素酶表達(dá)的調(diào)控機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 株

里氏木霉QM9414購自美國模式菌種收藏中心(AmericanTypeCultureCollection,ATCC)．

1.1.2 試 劑

DNA分子質(zhì)量標(biāo)記(DNAmarker)、EPiTaqHS酶 (用于重硫酸鹽處理后的DNA)和SYBR?PrimeScriptTMmiRNART-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒均為日本Takara公司生產(chǎn)；DNMT1抗體與二抗、DNA甲基化定量檢測(cè)試劑盒購自美國Epigentek公司；5′-Aza購自美國Sigma公司；真菌總核糖核苷酸(ribonucleicacid,RNA)提取試劑Trizol購自美國Invitrogen公司；牛血清蛋白(bovineserumalbumin,BSA)、(bicinchoninicacid，BCA)蛋白質(zhì)定量試劑盒以及超敏(enhancedchemiluminescence,ECL)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購自美國ThermoScientific公司；DNA甲基化修飾試劑盒購自美國ZymoResearch公司；真菌基因組快速抽提試劑盒和其他試劑均購自上海生工生物工程股份有限公司．本實(shí)驗(yàn)所需的其余試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純?cè)噭?/p>

1.1.3 實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基配制

土豆葡萄糖培養(yǎng)基(potatodextroseagar,PDA)：按照常規(guī)方法配置．

T.reesei液體基本培養(yǎng)基[7]：Mandels營養(yǎng)液濃縮液20mL、Mandels微量元素濃縮液1mL、CaCl2溶液20mL、無水葡萄糖20.0g、蛋白胨2.0g、1.0mol/L的檸檬酸緩沖液50mL、吐溫80 1.0g，雙蒸水(ddH2O)定容至1L，121 ℃高壓滅菌30min．

50×Mandels營養(yǎng)鹽濃縮液：(NH4)2SO470.0g、尿素15.0g、KH2PO4100.0g、KH2PO4100.0g、MgSO4·7H2O15.0g，ddH2O定容至1L．

100×Mandels微量元素濃縮液：FeSO4·7H2O5.0g、ZnSO4·7H2O1.7g、CoCl2·6H2O3.7g、MnSO4·H2O1.6g，ddH2O定容至1L．

產(chǎn)酶培養(yǎng)基：產(chǎn)酶培養(yǎng)基組分與基本培養(yǎng)基一致，用微晶纖維素(Sigma，PH101) 20.0g/L代替葡萄糖作為碳源．

質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的CMC-Na：羧甲基纖維素鈉10.0g，ddH2O定容至1L，加熱并攪拌至完全溶解．

5′-Aza母液：取0.022 8g5′-Aza溶于100μL二甲基亞砜(dimethylsulfoxide,DMSO)中，配制成濃度為1.0mol/L的母液．

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不同濃度5′-Aza培養(yǎng)基培養(yǎng)里氏木霉

將T.reeseiQM9414接種于PDA平板上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)7d后，制備適量孢子懸液，計(jì)數(shù)并將其稀釋至為1×108mL-1，取1μL孢子懸液于30mL液體基本培養(yǎng)基中，5′-Aza的終濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.5和1.0mmol/L，于28 ℃ 250r/min條件下培養(yǎng)2d；按5%(體積分?jǐn)?shù))接種到含有不同濃度(0.1、0.2、0.3、0.5和1.0mmol/L)5′-Aza的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，于28 ℃ 250r/min條件下培養(yǎng)，收集不同時(shí)間培養(yǎng)的菌體，并將收集到菌體分組：第Ⅰ組為出發(fā)菌株T.reeseiQM9414；第Ⅱ組為0.1mmol/L5′-Aza培養(yǎng)的T.reeseiQM9414；第Ⅲ組為0.2mmol/L5′-Aza培養(yǎng)的T.reeseiQM9414；第Ⅳ組為0.3mmol/L5′-Aza培養(yǎng)的T.reeseiQM9414；第Ⅴ組為0.5mmol/L5′-Aza培養(yǎng)的T.reeseiQM9414；第Ⅵ組為1.0mmol/L5′-Aza培養(yǎng)的T.reeseiQM9414．

1.2.2T.reesei總RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄PCR以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR

使用Trizol試劑 (Invitrogen公司生產(chǎn))提取T.reeseiQM9414總RNA，使用PrimeScriptRTreagentkitwithgDNAeraser試劑盒(Takara公司生產(chǎn))去除基因組DNA(genomicDNA,gDNA)．使用反轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscription，RT-PCR)試劑盒(Takara公司生產(chǎn))合成cDNA第1鏈．根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-timefluorescentquantitativepolymerasechainreaction,RT-qPCR) 試劑盒 (Takara公司生產(chǎn))說明，采用20μL反應(yīng)體系，95 ℃ 預(yù)變性 2min；95 ℃ 10s，60 ℃ 30s，72 ℃ 30s，40個(gè)循環(huán)．各基因的引物序列見表1．

表1 RT-qPCR使用的引物

1.2.3 FPA和CMCA的測(cè)定

濾紙酶活力和羧甲基纖維素酶活力的測(cè)定參照文獻(xiàn)[15]的方法．由于在反應(yīng)過程中纖維素酶含量與釋放的葡萄糖含量并非線性關(guān)系，根據(jù)國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)公布的方法[15]，以1 h內(nèi)水解50 mg濾紙釋放出2.0 mg葡萄糖或30 min內(nèi)水解1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))羧甲基纖維素釋放出0.5 mg葡萄糖的酶液稀釋倍數(shù)來計(jì)算FPA和CMCA活性，單位為U．按照1.2.1節(jié)取T.reeseiQM9414孢子懸液1mL培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)7d，從第2 天開始，每天固定時(shí)間取1mL培養(yǎng)液，于4 ℃ 12 000r/min離心5min，測(cè)定上清液酶活性．

1.2.4SDS-PAGE電泳檢測(cè)

將T.reeseiQM9414接種于PDA平板上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)7d后，按照1.2.1節(jié)取T.reeseiQM9414孢子懸液1mL培養(yǎng)，按5%(體積分?jǐn)?shù))接種量轉(zhuǎn)接至30mL含有微晶纖維素(20g/L)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于28 ℃ 250r/min培養(yǎng)72h．收集菌體細(xì)胞提取蛋白質(zhì)，并定量，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(體積分?jǐn)?shù)為12%)，然后將蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride,PVDF) 膜，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶粉封閉液室溫封閉2h，然后與鼠抗兔DNA甲基化酶(DNAmethylase,DNMT1)多克隆抗體(體積比為1∶500) 4 ℃ 孵育過夜，三羥甲基氨基甲烷緩沖液(tris-bufferedsalineTween,TBST) 清洗3次，每次5min，然后再與辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠抗體(體積比為1∶1 000) 室溫孵育2h，TBST液再清洗6次，每次5min．在暗室中，按照ECL免疫試劑盒的說明書操作．

1.2.5DNA甲基化定量檢測(cè)

將T.reeseiQM9414接種于PDA平板上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)7d后，制備適量孢子懸液接種于含5′-Aza的液體基本培養(yǎng)基中，于28 ℃ 250r/min條件下培養(yǎng)2d，真空抽濾，獲取木霉菌絲體，置于研缽中加入液氮，將菌絲體研磨成粉狀后轉(zhuǎn)至2.0mL離心管中，使用生工生物工程公司的真菌基因組快速抽提試劑盒提取，具體步驟參見說明書．測(cè)定上述提取的各樣品基因組DNA質(zhì)量濃度，并稀釋至同一質(zhì)量濃度100ng/μL，取各樣品基因組、陰性對(duì)照ME3和陽性對(duì)照ME4各1μL，定量檢測(cè)DNA甲基化，具體方法參考Epigentek公司DNA甲基化定量檢測(cè)試劑盒的說明書．

1.2.6MS-PCR

參照EZDNAMethylation-Gold試劑盒(ZymoResearch公司生產(chǎn))說明書，將上述提取的各基因組樣品進(jìn)行重亞硫酸鹽(bisulfite)修飾．修飾后，進(jìn)行PCR驗(yàn)證．采用50μLPCR體系：DNA模板 100ng，PCR緩沖液 (10×) 5μL，Mg2+5μL，4×dNTP6μL，上下游引物各2μL，HSTaq0.25μL．94 ℃ 預(yù)變性 5min; 94 ℃ 30s，55 ℃ 30s，72 ℃ 30s，40 個(gè)循環(huán)，72 ℃ 7min最后延伸．引物見表2．

表2 甲基化特異性PCR使用的引物

(續(xù)表2)

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同濃度5′-Aza培養(yǎng)基培養(yǎng)氏木霉菌絲的形態(tài)變化

在顯微鏡下觀察菌絲結(jié)果見圖1，在相同的40倍物鏡下觀察，與出發(fā)菌株T.reeseiQM9414相比較，經(jīng)5′-Aza培養(yǎng)過T.reeseiQM941菌絲較長．其中，第Ⅴ組和第Ⅵ組的T.reeseiQM9414相對(duì)第Ⅱ組、第Ⅲ組和第Ⅳ組的分支多且較短．而第Ⅱ組、第Ⅲ組和第Ⅳ組的T.reeseiQM9414相對(duì)出發(fā)菌株菌絲較長且分支也較多，其中，第Ⅱ組的菌絲最長，形態(tài)最好．

圖1 里氏木霉經(jīng)不同濃度 5′-Aza(0～1.0 mmol/L)培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后菌絲形態(tài)變化Fig.1 Morphology variation of hypha of T.reesei incubated with different concentration(0-1.0 mmol/L) of 5′-Aza medium for 48 h

2.2 不同濃度5′-Aza培養(yǎng)里氏木霉后對(duì)FPA和CMCA的影響

根據(jù)上述結(jié)果，用不同濃度的5′-Aza培養(yǎng)里氏木霉并在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，檢測(cè)各菌液的FPA和CMCA，結(jié)果見圖2．所有濃度5′-Aza培養(yǎng)的T.reeseiQM9414的FPA和CMCA在7d中都呈先升后降的趨勢(shì)，且在第4天酶活性達(dá)到最高．其中，第Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組的菌株，兩種酶活性均高于出發(fā)菌株；而第Ⅴ和第Ⅵ組的菌株，兩種酶活性無明顯升高并且低于出發(fā)菌株，所以在后面實(shí)驗(yàn)中第Ⅴ組和第Ⅵ組不作為實(shí)驗(yàn)組．第Ⅰ至第Ⅳ組的里氏木霉在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中FPA的趨勢(shì)線見圖2(a)．其中，第Ⅱ組的各個(gè)時(shí)段的酶活性比出發(fā)菌T.reeseiQM9414顯著升高(P<0.001)， 平均高出3.5U，在酶活性峰值96h時(shí)，第Ⅱ組的FPA比出發(fā)菌高出30%．第Ⅰ至第 Ⅳ組的里氏木霉在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中CMCA的趨勢(shì)線見圖2(b)．其中，第Ⅱ組的菌株的各個(gè)時(shí)段的酶活性相比出發(fā)菌顯非常著升高(P<0.001)， 平均高出約5.3U．在酶活性峰值96h時(shí)，第Ⅱ組的CMCA比出發(fā)菌高出 53%，表明去甲基化對(duì)纖維素酶合成有一定影響．

**表示P<0.01；***表示P<0.001圖2 里氏木霉經(jīng)不同濃度(0～1.0 mmol/L)的5′-Aza培養(yǎng)后FPA與CMCA隨時(shí)間變化情況(±s，n=3)Fig.2 Time course of FPUase and CMCase activity in T.reesei incubated with different concentrations (0-1.0 mmol/L) of 5′-Aza (±s，n=3)

2.3 RT-qPCR分析5′-Aza培養(yǎng)后里氏木霉纖維素酶分解代謝阻遏因子cre1和ace1的變化

對(duì)第Ⅰ至第 Ⅳ組的樣品進(jìn)行RT-qPCR，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3．圖3(a)說明，在誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h后，第Ⅱ組菌株cre1的mRNA相對(duì)表達(dá)量與出發(fā)菌株T.reeseiQM9414相比明顯下降，而在誘導(dǎo)培養(yǎng)96h后，第Ⅰ至第 Ⅳ組菌株cre1的mRNA相對(duì)表達(dá)量變化不顯著(P>0.05)．a(chǎn)ce1在第Ⅰ至第Ⅳ組的樣品的菌株中表達(dá)量測(cè)定結(jié)果見圖3(b)．在誘導(dǎo)培養(yǎng)48h和96h后，與出發(fā)菌菌株中ace1的mRNA表達(dá)量相比，第Ⅱ組菌株ace1的mRNA相對(duì)表達(dá)量變化有顯著性(P>0.05)， 但變化量較小．綜上可見，真菌基因甲基化程度較低，可能cre1與ace1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度更低，以至于5′-Aza培養(yǎng)后對(duì)其影響不大，故去甲基化培養(yǎng)可能對(duì)cre1與ace1的表達(dá)影響不顯著．

*表示P<0.05; **表示P<0.01圖3 不同濃度(0～0.3 mmol/L) 5′-Aza培養(yǎng)的里氏木霉對(duì)阻遏因子基因cre1和ace1的相對(duì)表達(dá)量的變化(±s，n=3)Fig.3 Change of relative expression of cre1 and ace1 genes in T.reesei incubated with different concentrations (0-0.3 mmol/L) of 5′-Aza for 48 h and 96 h respectively (±s，n=3)

2.4 RT-qPCR分析5′-Aza培養(yǎng)后纖維素酶基因cbh1與egl1以及激活因子xyr1的變化

里氏木霉纖維素酶是由多種酶組分組成的復(fù)雜酶系，為驗(yàn)證去甲基化是否會(huì)有效激活纖維素酶基因的表達(dá)，使用RT-qPCR分析第Ⅰ至第 Ⅳ組的菌株中纖維素酶基因cbh1、egl1和激活因子xyr1基因的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果見圖4．

cbh1是主要編碼纖維二糖水解酶CBH1的基因，結(jié)果如圖4(a)．在誘導(dǎo)48h時(shí)，以出發(fā)菌株T.reeseiQM9414中cbh1的mRNA表達(dá)量為1，第Ⅱ至第Ⅳ組菌株中cbh1的表達(dá)量分別是同時(shí)段出發(fā)菌株的89%、75%和73%，但在誘導(dǎo)96h后，第Ⅱ至第Ⅳ組菌株cbh1的相對(duì)表達(dá)量分別為同時(shí)段出發(fā)菌株的149.91%、125.86%和120.64%．在誘導(dǎo)培養(yǎng)96h后，第Ⅱ組菌株cbh1的表達(dá)量非常顯著增加(P<0.01)．

*表示P<0.05， **表示P<0.01，***表示P<0.001圖4 不同濃度(0～0.3 mmol/L)5′-Aza培養(yǎng)里氏木霉對(duì)纖維素酶相關(guān)基因cbh1、egl1和xyr1相對(duì)表達(dá)量的變化(±s，n=3)Fig.4 Change of relative expression of cbh1, egl1 and xyr1 genes in T.reesei incubated with different concentrations (0-0.3 mmol/L) of 5′-Aza for 48 h and 96 h respectively (±s，n=3)

內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶EGL1的編碼基因是egl1， 結(jié)果見圖4(b)．培養(yǎng)48h，以出發(fā)菌T.reeseiQM9414中egl1的mRNA表達(dá)量為1，第Ⅱ至第Ⅳ組菌株中egl1的表達(dá)量分別是同時(shí)段的出發(fā)菌株的80.62%、75.97%和60.21%．在誘導(dǎo)96h時(shí)，第Ⅱ組菌株中egl1的表達(dá)量情況發(fā)生了非常顯著變化(P<0.01)，egl1的表達(dá)量是同時(shí)段出發(fā)菌株的230.43%．

調(diào)控木聚糖酶表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子XYR1的編碼基因是xyr1，結(jié)果見圖4(c)，在誘導(dǎo)培養(yǎng)48h時(shí)，以出發(fā)菌T.reeseiQM9414中xyr1的mRNA表達(dá)量為1，第Ⅱ至第 Ⅳ組的菌株中xyr1的表達(dá)量分別為出發(fā)菌株的8.5、7.5和6.2倍．而在誘導(dǎo)96h時(shí)，第Ⅱ組的菌株中xyr1的表達(dá)量情況發(fā)生了非常顯著變化(P<0.001)，xyr1的表達(dá)量是同時(shí)段出發(fā)菌株的23.5倍．

2.5DNA甲基化的定量檢測(cè)

表3為通過DNA甲基化定量檢測(cè)試劑盒得到結(jié)果．由表3可見，第Ⅱ至第 Ⅳ組的菌株與出發(fā)菌株T.reeseiQM9414相比，甲基化程度明顯下降，約為0.54%．

表3 DNA甲基化定量檢測(cè)計(jì)算結(jié)果(±s, n=3)

1為第Ⅱ組菌株的蛋白樣品；2為第Ⅲ組菌株的樣品；3為第Ⅳ組菌株的樣品；4為對(duì)照組樣品圖5 Western blot 分析甲基化酶DNMT1的表達(dá)量Fig.5 Western blot analysis of DNMT1 expression

2.6Westernblot分析DNA的DMT變化

在NCBI中檢索到T.reeseiQM6a具有DNA甲基化酶1的蛋白(序列號(hào)：XP_006964860.1)與兔的DNMT1蛋白(序列號(hào)：XP_008248967.2)， 經(jīng)BLAST序列比對(duì)，得到兩蛋白同源性為39%．Westernblot分析結(jié)果見圖5．結(jié)果表明，相比對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組經(jīng) 5′-Aza培養(yǎng)基培養(yǎng)后DNMT1表達(dá)量相對(duì)對(duì)照組明顯減少．

2.7MS-PCR分析啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化情況

在真核生物體內(nèi)，DNA甲基化主要發(fā)生在啟動(dòng)子區(qū)．而基因的編碼區(qū)很少甚至沒有．綜上結(jié)果，MSP只采用了第Ⅰ和第Ⅱ組的菌株樣品.

從圖6MS-PCR顯示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，出發(fā)菌株T.reeseiQM9414和第Ⅱ組的菌株樣品中cre1、ace1、cbh1、egl1和xyr1基因的啟動(dòng)子區(qū)DNA都是部分甲基化，以非甲基化狀態(tài)居多．阻遏因子cre1基因的啟動(dòng)子區(qū)甲基化，在培養(yǎng)前后變化不明顯，該結(jié)果與RT-qPCR結(jié)果一致，而與纖維素酶表達(dá)的基因cbh1、egl1和xyr1的啟動(dòng)子區(qū)的非甲基化狀態(tài)增加顯著，但仍存在部分甲基化狀態(tài)．

M為DL500 marker; 1為甲基化的cre1; 2為非甲基化的cre1; 3為甲基化的ace1; 4為非甲基化的ace1; 5為甲基化的cbh1; 6為非甲基化的cbh1; 7為甲基化的egl1; 8為非甲基化的egl1; 9為甲基化的xyr1; 10為非甲基化的xyr1; 11為陽性對(duì)照; 12為陰性對(duì)照?qǐng)D6 MS-PCR分析纖維素表達(dá)相關(guān)基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的凝膠電泳圖Fig.6 Electrophoresis of the promoter methylation status of cellulase related genes by MS-PCR

3 分析與討論

與高等動(dòng)植物相似，真菌表觀遺傳作用主要表現(xiàn)在基因組防御功能與基因表達(dá)的調(diào)控功能，同時(shí)也為真菌表觀遺傳的研究提供了新途徑[16]．文獻(xiàn)[3]研究表明，突變不同的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶對(duì)真菌生長發(fā)育影響不同．糞盤菌DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶基因masc1突變同樣沒有明顯的性狀改變，但其甲基化誘導(dǎo)的前減數(shù)分裂(methylationinducedpremeiotically,MIP)的甲基化作用被阻斷后，純合的masc1雙核突變株不能生長，而敲除masc2基因的突變體則對(duì)MIP甲基化無明顯影響．本實(shí)驗(yàn)通過不同濃度5′-Aza(0～1.0mmol/L)培養(yǎng)后T.reeseiQM9414，發(fā)現(xiàn)DNA去甲基化可使菌體生長發(fā)生改變，菌絲變長且分支多而長．

FPA代表的是內(nèi)切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶、β-葡聚糖苷酶協(xié)同作用后的總酶活，是菌株整個(gè)纖維素酶系酶活力水平的綜合體現(xiàn)．而CMCA主要代表內(nèi)切β-1,4-葡聚糖苷酶的活力．本實(shí)驗(yàn)通過不同濃度5′-Aza培養(yǎng)T.reeseiQM9414后，發(fā)現(xiàn)可以不同程度地提高纖維素酶酶活性，其中0.1mmol/L的影響最為顯著(P<0.001)． 說明DNA去甲基化可以提高其纖維素酶的表達(dá)．而高濃度的5′-Aza培養(yǎng)T.reeseiQM9414酶活性較原菌酶活性下降．有研究表明，高濃度5′-Aza可通過抑制DNA的合成來誘導(dǎo)細(xì)胞周期的阻滯，影響細(xì)胞的增值，從而加快細(xì)胞的凋亡[17]．而低濃度的5′-Aza可抑制甲基轉(zhuǎn)移酶．在細(xì)胞分裂復(fù)制的過程中，低濃度的5′-Aza使甲基不能轉(zhuǎn)移到胞嘧啶上．細(xì)胞在缺乏甲基轉(zhuǎn)移酶時(shí)，接受甲基的能力降低，從而使DNA去甲基化．不同濃度的化學(xué)修飾劑5′-Aza對(duì)T.reeseiQM9414的FPA和CMCA的影響呈先升后降趨勢(shì)，這可能與微生物生長狀態(tài)有關(guān)，96h前微生物正處于對(duì)數(shù)生長期，其數(shù)量逐漸增多，產(chǎn)酶也逐漸增加，96h微生物正處于穩(wěn)定生長期，其數(shù)量最多，產(chǎn)酶也最多，故96h酶活最高．而96h后微生物正處于衰亡期, 其數(shù)量逐漸增少，產(chǎn)酶也逐漸減少．5′-Aza作用后，DNA去甲基化，激活基因表達(dá)，故5′-Aza處理后的菌株酶活比出發(fā)菌高．

纖維素酶的表達(dá)是一個(gè)比較復(fù)雜的系統(tǒng)，具有正負(fù)調(diào)控，既有阻遏因子CRE1與ACE1的負(fù)調(diào)控，也有激活因子XYR1的正調(diào)控．根據(jù)RT-qPCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示激活因子基因xyr1參與的正調(diào)控起最主要的作用，阻遏因子基因cre1與ace1參與的負(fù)調(diào)控作用不顯著；MS-PCR的結(jié)果也進(jìn)一步說明，可能在DNA去甲基化的情況下，cre1與ace1表達(dá)調(diào)控作用相對(duì)較小，而激活因子基因xyr1的啟動(dòng)子區(qū)非甲基化狀態(tài)明顯增加，調(diào)控XYR表達(dá)增加可能會(huì)促進(jìn)纖維素酶的表達(dá)和酶活提高．RT-qPCR與MS-PCR的結(jié)果表明，纖維素酶表達(dá)的相關(guān)基因cbh1與egl1， 在5′-Aza的作用下，DNA啟動(dòng)子區(qū)去甲基化，激活基因轉(zhuǎn)錄，使其表達(dá)量提高，是纖維素酶表達(dá)量提高的最主要原因．

文獻(xiàn)[18]研究發(fā)現(xiàn)，5′-Aza是一種強(qiáng)效生長抑制劑及細(xì)胞毒素劑，能夠抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)、基因激活和沉默，故DNA甲基化定量檢測(cè)得出不同濃度的5′-Aza培養(yǎng)的菌株的DNA甲基化程度都下降了．

真核生物已知的DMT可分為 5 個(gè)群，分別以哺乳動(dòng)物的Dnmt1、Dnmt2、Dnmt3a與Dnmt3b、植物的染色質(zhì)甲基化酶(chromomethylase，CMT)和糞盤菌的Masc1 為代表[19]．真菌中已發(fā)現(xiàn)的 5 種DMT分別屬于Dnmt1與Masc1．Christman等[20]研究表明，5′-Aza能夠作為胞嘧啶的替代物與DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMT)的半胱氨酸殘基相連接，使其構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而使其酶活失活．Westernblot結(jié)果表明，5′-Aza能夠抑制DNMT1的表達(dá)量，可能有兩個(gè)原因：一是DNMT1的基因表達(dá)受到抑制； 二是5′-Aza能夠與酶蛋白的半胱氨酸殘基結(jié)合使其構(gòu)象發(fā)生改變，可能導(dǎo)致其抗原決定簇的位置以及疏水性發(fā)生改變，而不能與抗體結(jié)合．

真核生物DNA甲基化主要發(fā)生在啟動(dòng)子區(qū)．MS-PCR結(jié)果可能是由于DNMT1的表達(dá)部分被抑制所造成．在含0.1mmol/L5′-Aza培養(yǎng)基培養(yǎng)的T.reeseiQM9414菌株中，纖維素酶表達(dá)基因cbh1、egl1和xyr1的非甲基化與對(duì)照組均有明顯提高，說明5′-Aza可以抑制DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT1的表達(dá)，從而導(dǎo)致基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)下降，激活基因的表達(dá)．

結(jié) 語

5′-Aza處理T.reeseiQM9414菌株后，纖維素酶活性明顯增加，纖維素酶基因cbh1和egl1與激活因子xyr1基因的表達(dá)水平增加可能是通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶影響DNA甲基化水平，最終調(diào)控基因表達(dá)．

目前對(duì)于纖維素酶的研究，主要是通過基因工程改造的方式來克隆纖維素酶基因到真菌高效的表達(dá)系統(tǒng)，從而增加纖維素酶表達(dá)[21]．本實(shí)驗(yàn)通過表觀遺傳的方法研究里氏木霉的纖維素酶表達(dá)，為真菌纖維素酶表達(dá)調(diào)控機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)．

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【中文責(zé)編：晨 兮；英文責(zé)編：艾 琳】

Effect of 5-Aza-2′-deoxycytidine on the expression of cellulases inTrichodermareesei

Zhou Jiaojiao, She Weiyi, Wang Haoru, Xie Ning, and Tian Shengli?

College of Life Science and Marine Science, Shenzhen University, Shenzhen Key Laboratory of Microbial Genetic Engineering,Shenzhen 518060, Guangdong Province, P.R.China

Filamentous fungusTrichodermareeseiQM9414weretreatedwithdifferentconcentrationsofchemicalreagent5-Aza-2′-deoxycytidineinordertoexploreepigeneticregulatorymechanismofDNAmethylationoncellulaseexpression.Thenthecellulaseactivitieswithfilterpaperandcarboxymethylcellulose-Naenzymaticactivitieswereexamined.Real-timefluorescentquantitativePCR(RT-qPCR)wasusedtoanalyzetheexpressionsofcellulasegenecbh1,egl1,activatorgenexyr1,andmetabolicrepressorgenecre1andace1inthetreatedT.reeseiQM9414strains.Methylationstatusofupstreamofgenecbh1,egl1,xyr1,cre1andace1wasdetecedbymethylationspecificPCR(MS-PCR)analysis.Theresultsillustratethatthe0.1mmol/LtreatedstainsmanifestthehighestenzymaticactivitiesincludingfilterpaperandCMC-Naenzymaticactivities, 30%and53%higherthanthoseofthestartingstrainrespectively.RT-qPCRrevealsthattheexpressionlevelsofthegenecbh1,egl1,xyr1arealsohigherthanthoseofstartingstrain,whiletheexpressionsofgenecre1andace1arenotsignificantlychanged.FurtheranalysisbyMS-PCRindicatesthatthenon-methylatedstatusesofupstreamofgenecbh1,egl1,xyr1arehigherthanthoseofthestartingstrain,aswellasthegenecre1andace1arenotobviouslyvary.Furthermore,DNAmethyltransferasebytheWesternblotanalysisandDNAmethylationquantificationshowthattheexpressionlevelsofmethyltransferasetreatedwith5-Aza-2′-deoxycytidinearelowerthanthatofthestartingstrain,andthemethylationlevelsofgenomicDNAalsodecrease.Inshort,thecellulaseactivitiesofT.reeseiQM9414significantlyincreaseaftertreatmentwith5′-Aza.Theexpressionofcbh1,egl1andxyr1genesmayberelatedtoDNAmethylationbyDNAmethyltransferaselevel,andfinallyregulatecellulasegenesexpression.

filamentous fungus;Trichodermareesei(T.reesei); 5-Aza-2′-deoxycytidine(5′-Aza);DNAmethylation;DNAmethyltransferase;methylationspecificPCR(MS-PCR)

：Zhou Jiaojiao, She Weiyi, Wang Haoru, et al．Effect of 5-Aza-2′-deoxycytidine on the expression of cellulases inTrichodermareesei[J]. Journal of Shenzhen University Science and Engineering, 2017, 34(2): 122-131.(in Chinese)

Q

A

10.3724/SP.J.1249.2017.02122

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31601014)；深圳市科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(JCYJ20150525092940997)

周嬌嬌(1988—)，女，深圳大學(xué)碩士研究生，研究方向：微生物學(xué)．E-mail：1021834020@qq.com

Received：2016-09-29；Accepted：2016-12-21

Foundation：National Natural Science Fundation of China (31601014)；Shenzhen Science and Technology Research Foundation(JCYJ20150525092940997)

? Corresponding author：Prefessor Tian Shengli．E-mail:sltian@szu.edu.cn

引 文：周嬌嬌，佘煒怡，王浩入，等．5-氮雜-2-脫氧胞苷對(duì)里氏木霉產(chǎn)纖維素酶的影響[J]. 深圳大學(xué)學(xué)報(bào)理工版，2017，34(2)：122-131.