家蠶MBP-Bmlp7蛋白的克隆表達及免疫學鑒定

曹 會，蔡德豐，楊平常，劉志剛，夏立新

1)深圳大學醫(yī)學部，呼吸疾病國家重點實驗室深圳大學變態(tài)反應分室，廣東深圳518060；2)深圳市兒童醫(yī)院檢驗科，廣東深圳 518026

【生物工程 / Bioengineering】

家蠶MBP-Bmlp7蛋白的克隆表達及免疫學鑒定

曹 會1，蔡德豐2，楊平常1，劉志剛1，夏立新1

1)深圳大學醫(yī)學部，呼吸疾病國家重點實驗室深圳大學變態(tài)反應分室，廣東深圳518060；2)深圳市兒童醫(yī)院檢驗科，廣東深圳 518026

克隆表達家蠶蠶蛹30 kD(1 kD=1 u)脂蛋白家族成員Bmlp7(Bombyxmorilipoprotein7)的融合蛋白，鑒定其致敏原性．合成Bmlp7的基因后連接至載體質(zhì)粒pMAL-C5e上，在大腸桿菌BL21中誘導表達出麥芽糖結合蛋白(maltosebindingprotein,MBP)-Bmlp7，純化后，利用Westernblot鑒定MBP-Bmlp7融合蛋白與家蠶過敏患者血清中特異性免疫球蛋白E(immunoglobulinsE,IgE)的結合能力．結果顯示，純化得到了純度較高的MBP-Bmlp7融合蛋白，且該融合蛋白能夠與家蠶過敏患者血清特異性IgE結合，說明Bmlp7是家蠶中一種潛在的致敏原．

免疫學；家蠶；30kD脂蛋白；表達純化；免疫印跡；融合蛋白；免疫原性

家蠶作為一種重要的經(jīng)濟昆蟲在中國已有近五千年的養(yǎng)殖歷史，所產(chǎn)絲綢遠銷海內(nèi)外，又因其蛹富含蛋白等營養(yǎng)物質(zhì)[1]，所以在我國很多地區(qū)都有食用蠶蛹的習慣．因接觸蠶絲、絲綢和因食用蠶蛹引發(fā)的過敏反應的病例已有報道[2-3]．現(xiàn)在已知，大多數(shù)的家蠶過敏是由特異性免疫球蛋白E(immunoglobulinsE,IgE)介導的I型過敏反應[2]，臨床主要表現(xiàn)為過敏性皮炎、肺炎、哮喘及更為嚴重的過敏性休克．由于家蠶過敏的普遍性與嚴重性，及蠶蛹食品安全的重要性，所以對家蠶過敏原的研究具有重要意義．

家蠶30kD(1kD=1u)脂蛋白家族是5齡蠶新出現(xiàn)的特異性變應原[4-5]，包含18個成員[6]．至今，該蛋白家族中哪些成員是過敏原尚不清楚．本研究合成了該蛋白家族中高表達Bmlp7的基因，構建原核表達載體，表達純化重組蛋白，鑒定該蛋白與家蠶過敏患者血清中特異性IgE的結合能力．

1 材料與方法

1.1 標本與主要試劑

1.1.1 血清標本

家蠶過敏患者血清由深圳市兒童醫(yī)院提供．

1.1.2 主要試劑

Amylose親和柱(美國NEB公司)；電泳及轉膜裝置(美國Bio-Rad公司)；偶聯(lián)辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)的鼠抗人IgE(美國SouthernBiotech公司)；聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchoninicacid,BCA)蛋白定量試劑盒(北京索萊寶公司)．

1.2 研究方法

1.2.1 基因合成及克隆表達載體的構建

從GeneBank網(wǎng)站下載Bmlp7蛋白的基因序列(登陸號：XM_012694938.1)， 委托金斯瑞(南京)生物科技有限公司合成，并將其連接至pMAL-c5e質(zhì)粒上．將重組質(zhì)粒轉化進大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coil)BL21感受態(tài)細胞內(nèi)，堿裂解法提取質(zhì)粒，并用BamH I和HindⅢ進行雙酶切鑒定．

1.2.2MBP-Bmlp7融合蛋白的誘導表達

將pMAL-Bmlp7重組質(zhì)粒轉化進E.coilBL21感受態(tài)細胞內(nèi)，涂布至含氨芐青霉素的Luria-Bertani(LB)固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)16h．選取單個菌落接種于含氨芐青霉素(質(zhì)量濃度為50μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，150r/min，培養(yǎng)16h．取上述菌液2mL分別加入到兩瓶20mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基(含葡萄糖2g/L)中，37 ℃，200r/min，培養(yǎng)2h，加入終濃度為1mmol/L的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 (isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)，將一瓶置于37 ℃，200r/min，繼續(xù)培養(yǎng)4h；另一瓶置于16 ℃，150r/min，培養(yǎng)20h．進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 (sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE)，SDS-PAGE濃縮膠(丙烯酰胺質(zhì)量分數(shù)為5%)電壓設為60V，分離膠(丙烯酰胺質(zhì)量分數(shù)為10%)電壓設為140V，電泳結束后，凝膠用考馬斯亮藍染色15min，脫色液脫至蛋白條帶清晰，觀察MBP-Bmlp7融合蛋白在高溫(37 ℃)和低溫(16 ℃)兩種條件下的表達情況．

1.2.3Amylose親和柱純化MBP-Bmlp7融合蛋白

依照上述步驟，在37 ℃條件下大量表達目的蛋白．將大量表達的菌液離心收集沉淀，加入30mL的Column緩沖液(成分為20mmol/LTris-HCl、200mmol/LNaCl和1mmol/L的EDTA)，超聲破碎20min，于4 ℃、10 000r/min離心20min收集上清，并使用孔徑為0.4μm的濾膜過濾，待用．于4 ℃條件下，Amylose親和柱用10倍柱體積的column緩沖液平衡，上樣約30mL，使融合蛋白掛柱，用8倍體積的column緩沖液洗脫雜蛋白，最后用Elution緩沖液(column緩沖液+10mmol/Lmatlose)洗脫目的蛋白，收集分裝，于-80 ℃保存．使用BCA蛋白定量試劑盒定量蛋白，SDS-PAGE鑒定純化的效果．

1.2.4Western-blot鑒定MBP-Bmlp7融合蛋白的免疫原性

使用濕轉法(恒定電流300mA，60min)將聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)轉移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidenefluoride,PVDF膜)上，用含脫脂奶粉(質(zhì)量分數(shù)為50g/L)的Western雜交膜清洗液(TrisbufferedsalinewithTween-20，TBST；由20mmol/L的Tris、150mmol/L的NaCl和體積分數(shù)為0.1%的吐溫-20配制而成，調(diào)節(jié)pH=7.4)室溫下封閉1h，封閉結束后，用TBST洗滌5min，將該PVDF膜放入槽中；按照體積比為1∶5將家蠶過敏患者的混合血清在含脫脂奶粉(質(zhì)量分數(shù)為50g/L)的TBST中稀釋，將稀釋后的血清加入槽中并使其覆蓋PVDF膜，4 ℃孵育過夜，孵育完成后，用TBST洗膜3次，每次5min；按體積比為1∶2 000加入稀釋的偶聯(lián)了HRP的鼠抗人IgE，室溫孵育1h，之后再用TBST洗膜3次，每次5min；PVDF膜用電化學發(fā)光(electro-chemi-luminescence,ECL)的發(fā)光液在暗室中反應并成像．

2 實驗結果

2.1pMAL-Bmlp7重組表達載體的鑒定

將Bmlp7基因堿基插入到pMAL-C5e質(zhì)粒中，經(jīng)過BamH I和HindⅢ雙酶切鑒定，圖1的核酸膠結果顯示，雙酶切所得片段長度與Bmlp7理論長度基本一致，約720堿基對(basepair,bp)．

圖1 重組pMAL-Bmlp7表達載體的雙酶切鑒定Fig.1 Identification of the recombinant plasmid pMAL-Bmlp7 by restriction enzyme digestion

2.2MBP-Bmlp7融合蛋白的誘導表達及純化

將含有pMAL-Bmlp7重組質(zhì)粒的E.coilBL21加入到含有氨芐青霉素及葡糖糖的LB培養(yǎng)基中進行擴增培養(yǎng)，加入終濃度為1mmol/L的IPTG誘導目的蛋白的表達，經(jīng)SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)目的蛋白在高溫(37 ℃)及低溫(16 ℃)兩種條件下都為可溶性表達，且表達量基本一致．利用Amylose親和柱純化MBP-Bmlp7融合蛋白，圖2的SDS-PAGE結果顯示，在約70kD處有目的蛋白條帶出現(xiàn)，該條帶與MBP-Bmlp7的理論相對分子質(zhì)量(72.2kD)基本一致．

圖2 融合蛋白MBP-Bmlp7的誘導表達及純化Fig.2 Expression and purification of fusion protein MBP-Bmlp7

2.3MBP-Bmlp7融合蛋白的免疫學鑒定

選用家蠶過敏患者的混合血清作為一抗，對MBP-Bmlp7融合蛋白的免疫原性進行鑒定，并選用塵螨過敏患者血清和正常人血清作為陰性對照．同時以家蠶過敏患者混合血清作為一抗，鑒定MBP蛋白的免疫原性．圖3結果顯示，MBP-Bmlp7融合蛋白與家蠶過敏患者血清的特異性IgE結合，同時依據(jù)MBP蛋白條帶為陰性，也可以進一步推測Bmlp7蛋白與血清特異性IgE結合．

圖3 MBP-Bmlp7融合蛋白的western blotting分析Fig.3 Analysis of IgE reactivity of fusion protein MBP-Bmlp7 by western blotting

3 討 論

變態(tài)反應性疾病在世界各國的發(fā)病率約為10%～30%[7]，且隨著工業(yè)化的進程和人民生活質(zhì)量的提高呈上升趨勢．變態(tài)反應性疾病嚴重影響了人們的生活質(zhì)量[8]．

蔡國勝等[9-10]早在1989及1990年就先后報道了17例和51例蠶蛹性哮喘的病例．1994年王旭東等[11]對3個養(yǎng)蠶場90名工人進行了調(diào)查研究，發(fā)現(xiàn)有75.6%的工人因職業(yè)性接觸而出現(xiàn)不同程度的呼吸道過敏癥狀, 其中15.6%的工人患有職業(yè)性哮喘．因食用蠶蛹而引發(fā)過敏的例子也常有報道[12]．李維中等[13]利用蠶蛹粗浸液成功建立了小鼠哮喘模型，進一步證實了蠶蛹的過敏原性．

劉志剛等[14]對家蠶變應原tropomyosin進行了克隆表達，Westernblotting結果顯示，該過敏原與病人血清有26%的陽性反應率．Zuo等[15]利用雙向電泳從家蠶中尋找到了過敏原Bomm9，且證實該蛋白可能引起哮喘．胡維等[16-17]分別克隆表達了家蠶蠶蛹過敏原CPH30與表皮蛋白RR-2基序63前體(CPR63)，并進行了抗原表位的預測，結果顯示，重組的CPH30和CPR63都具有免疫原性，前者潛在的B細胞表位在第57～69位和第150～158位氨基酸區(qū)段，后者的B細胞表位在第21～40、37～56、47～66、64～83位氨基酸區(qū)段．同年，Jeong等[18]從熱處理后的家蠶蠶蛹中找到一種新的熱穩(wěn)定過敏原27kD糖蛋白，且該過敏原的重組蛋白與家蠶過敏患者血清有33.3%的陽性反應率．

張杰等[19]利用Westernblot發(fā)現(xiàn)蠶蛹粗提液中主要過敏原是位于80kD和30kD的蛋白條帶，并且在與IgE的反應中，30kD蛋白的反應強度高于80kD蛋白條帶．通過質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)這些30kD蛋白屬于30kD脂蛋白家族．然而，對于30kD脂蛋白家族中哪些成員是致敏原尚不完全清楚．

本研究使用生物信息學及分子生物學手段，從Genebank網(wǎng)站下載Bmlp7蛋白的基因序列，合成后將其連接至pMAL-c5e質(zhì)粒上，再將其轉化進E.coilBL21中，誘導表達得到了分子量約為72.2kD的MBP-Bmlp7(MBP相對分子質(zhì)量為42.5kD)融合蛋白，通過Amylose親和柱純化得到了純度較高的目的蛋白．從免疫印跡結果可以看出，Bmlp7蛋白與家蠶過敏患者血清特異性IgE結合較強．

結 語

鑒定過敏原對于過敏性疾病的診斷與治療具有重要的意義．家蠶是重要的昆蟲過敏原，本研究通過克隆表達家蠶30kD脂蛋白家族成員的融合蛋白，鑒定出Bmlp7是一種潛在的過敏原，不僅為臨床的診斷與治療提供了依據(jù)，也為進一步深入研究與探索30kD脂蛋白家族成員奠定了基礎．蠶蛹作為一種高蛋白、營養(yǎng)豐富的食物，此研究對蠶蛹食品安全有重要意義．

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【中文責編：晨 兮；英文責編：艾 琳】

Expression and immunological identification of MBP-Bmlp7 fromBombyxmori

Cao Hui1, Cai Defeng2, Yang Pingchang1, Liu Zhigang1, and Xia Lixin1?

1)Health Science Center, State Key Laboratory of Respiratory Disease for Allergy at Shenzhen University,Shenzhen University, Shenzhen 518060, Guangdong Province, P.R.China 2) Department of Clinical Laboratory, Shenzhen Children’s Hospital, Shenzhen 518026, Guangdong Province, P.R.China

The open reading frame of Bmlp7 from silkworm (Bombyxmori)waschemicallysynthesizedandclonedintoplasmidpMAL-c5e.TherecombinantplasmidpMAL-Bmlp7wastransformedintoE.coliBL21andexpressedasafusionprotein.Theproteinwaspurifiedusingamyloseaffinitychromatographyandpurifiedtohomogeneity.TheimmunoglobulinsE(IgE)reactivityofthefusionproteinwasassayedbywesternblottingusingseraofpatientwithsilkwormallergies.TheresultsshowthattheBmlp7fusionproteinhasIgEreactivitywiththepatientsera.

immunology;Bombyxmori; 30kDlipoprotein;expressionandpurification;immunoblotting;fusionprotein;immnogenicity

：Cao Hui, Cai Defeng, Yang Pingchang, et al. Expression and immunological identification of MBP-Bmlp7 fromBombyxmori[J]. Journal of Shenzhen University Science and Engineering, 2017, 34(2): 117-121.(in Chinese)

R392.8；Q

A

10.3724/SP.J.1249.2017.02117

國家自然科學基金資助項目(81273275)；廣東省科技計劃資助項目(2014A020212422)

曹 會(1991—)，男，深圳大學碩士研究生．研究方向：醫(yī)藥生化與分子生物學．E-mail：huiencao@163.com

Received：2016-09-13；Accepted：2016-11-01

Foundation：National Natural Science Foundation of China(81273275)；Science and Technology Plan of Guangdong Province(2014A020212422)

? Corresponding author：Professor Xia Lixin．E-mail: xialixin@126.com

引 文：曹 會，蔡德豐，楊平常，等. 家蠶MBP-Bmlp7蛋白的克隆表達及免疫學鑒定[J]. 深圳大學學報理工版，2017，34(1)：117-121.