REGγ敲除對(duì)細(xì)胞浸潤(rùn)的抑制作用

孫錦霞，王 瑞，黃 鐘

1)深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部，廣東深圳518060；2)聊城大學(xué)藥學(xué)院，山東聊城252059

【生物工程 / Bioengineering】

REGγ敲除對(duì)細(xì)胞浸潤(rùn)的抑制作用

孫錦霞1，王 瑞2，黃 鐘1

1)深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部，廣東深圳518060；2)聊城大學(xué)藥學(xué)院，山東聊城252059

研究蛋白酶體激活因子REGγ對(duì)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)能力的影響，分別腹腔注射李斯特菌于野生型和REGγ敲除小鼠，通過(guò)存活率檢測(cè)、克隆形成、流式細(xì)胞術(shù)和蘇木精-伊紅染色實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)REGγ敲除小鼠表現(xiàn)為較低的存活率和李斯特菌清除能力．REGγ敲除顯著抑制了中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞向感染部位的浸潤(rùn)．表明REGγ敲除后免疫細(xì)胞不能募集至感染部位，導(dǎo)致細(xì)菌未能被有效清除而在體內(nèi)大量繁殖，最終引發(fā)敗血癥的發(fā)生，降低小鼠的存活率．

敗血癥；蛋白酶體；李斯特菌；中性粒細(xì)胞；單核細(xì)胞；細(xì)胞浸潤(rùn)；克隆形成實(shí)驗(yàn)；流式細(xì)胞術(shù)；蘇木精-伊紅染色

雖然現(xiàn)代醫(yī)學(xué)進(jìn)展突飛猛進(jìn)，但細(xì)菌性感染引發(fā)的敗血癥仍然是威脅人類(lèi)生命的世界難題[1]．其中，以李斯特菌(ListeriaMonocytogenes)和沙門(mén)氏菌(S.typhimuriu)為主的食物性感染導(dǎo)致的死亡率一直處于較高水平．李斯特菌屬于G+的胞內(nèi)細(xì)菌，感染早期主要被中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等髓系固有免疫細(xì)胞清除，腹腔注射或靜脈注射李斯特菌誘導(dǎo)的菌血癥模型被廣泛用于宿主抵御細(xì)菌感染的機(jī)制研究[2-4]．REGγ是普遍存在于蠕蟲(chóng)、昆蟲(chóng)和高等動(dòng)物細(xì)胞中的蛋白酶體激活因子，可通過(guò)泛素-和腺嘌呤核苷三磷酸(adenosinetriphosphate,ATP)-非依賴(lài)的方式降解一些小肽或完整蛋白，參與許多重要的生理過(guò)程，如原癌基因SRC-3和PTTG1、抑癌基因P21和P53[5-8]．文獻(xiàn)[9]研究表明，敗血癥患者PBMC中REGγ表達(dá)上調(diào)，造血細(xì)胞中REGγ的缺失顯著上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子KLF2表達(dá)，進(jìn)而抑制NF-κB介導(dǎo)的吞噬細(xì)胞對(duì)大腸桿菌和李斯特細(xì)菌的殺傷作用，加重小鼠敗血癥病情，降低小鼠存活率．本研究為探討REGγ對(duì)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)至感染部位的調(diào)控作用，以闡明細(xì)菌感染狀態(tài)下，REGγ缺失對(duì)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn)的調(diào)節(jié)作用．

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

心腦浸粉培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)BD公司；脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)、2,2,2-三溴乙醇和2-甲基-2-丁醇購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；抗-GR1、抗CD11b、抗B220和抗CD3熒光標(biāo)記抗體購(gòu)自美國(guó)eBioScience公司；蘇木精和伊紅染色液購(gòu)自上海碧云天公司；HBSS緩沖液(Hank’s平衡鹽緩沖液)購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；體積分?jǐn)?shù)4%的多聚甲醛固定液、NH4Cl、KHCO3和EDTA化學(xué)試劑購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司．流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；石蠟包埋劑、石蠟切片機(jī)和熒光正置顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Leica公司．

1.2 腹膜炎模型建立和檢測(cè)

李斯特菌(listeria)由心腦浸粉培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜， 此時(shí)光密度D(600)值約為1，菌液濃度為1×108mL-1，經(jīng)PBS洗2遍后稀釋至2.5×106mL-1．腹腔注射200μL李斯特菌于體質(zhì)量和性別相同的8～12周野生型和REGγ敲除小鼠，每天記錄小鼠存活率和體質(zhì)量變化. 腹腔注射40μL李斯特菌于體質(zhì)量和性別相同的8～12周野生型和REGγ敲除小鼠，3d后處死小鼠，取出肝臟和脾臟后稱(chēng)重，克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)組織中李斯特菌的負(fù)荷量．組織中加入1mLPBS(含有體積分?jǐn)?shù)為0.025%的TritonX-100)，經(jīng)勻漿器研磨得到組織勻漿液，梯度稀釋后涂板于腦心浸粉固體培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜，統(tǒng)計(jì)長(zhǎng)出單克隆數(shù)目．

1.3 流式細(xì)胞術(shù)

體質(zhì)量和性別相同的8～12周野生型和REGγ敲除小鼠，經(jīng)麻醉后取外周血，取出股骨和脛骨，10mLHBSS緩沖液(無(wú)Ca2+和Mg2+)(含有10g/LBSA和5mmol/LHepes)沖出骨髓細(xì)胞．腹腔注射400μL李斯特菌于體質(zhì)量和性別相同的8～12周野生型和REGγ敲除小鼠，4h后麻醉小鼠，分別取血液和腹腔液．所得細(xì)胞經(jīng)ACK緩沖液(含有0.15mol/LNH4Cl、10.0mmol/LKHCO3和0.1mmol/LEDTA)裂解去除紅細(xì)胞，用PBS(含有10.0g/LBSA和5.0mmol/LEDTA)重懸，加入相應(yīng)流式抗體，冰上避光孵育30min．染色結(jié)束，經(jīng)PBS洗滌后上機(jī)檢測(cè)，F(xiàn)lowjo軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果．

1.4 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色

腹腔注射1×105個(gè)李斯特菌于體質(zhì)量和性別相同的8～12周野生型和REGγ敲除小鼠，3d后處死小鼠，取出肝臟立即放入體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定過(guò)夜．腹腔注射LPS(15mg/kg)于體質(zhì)量和性別相同的8～12周野生型和REGγ敲除小鼠，8h后處死小鼠，取出肺組織立即放入體積分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛固定過(guò)夜．固定后的組織經(jīng)酒精脫水和二甲苯透明后，制備石蠟切片．依次經(jīng)蘇木精和伊紅染色后，顯微鏡下觀察REGγ敲除對(duì)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)能力的影響，并采集圖片．

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果與分析

2.1REGγ敲除降低小鼠抵抗李斯特菌感染的能力

分別腹腔注射200μL李斯特菌于野生型(REGγ+/+)和REGγ敲除小鼠(REGγ-/-)各10只，每天記錄兩組小鼠存活率和質(zhì)量的變化．結(jié)果如圖1，與野生型小鼠相比，李斯特菌感染后REGγ敲除小鼠的存活率和體重下降較快．

圖1 李斯特菌感染后，野生型和REGγ敲除小鼠存活率和質(zhì)量變化Fig.1 The changes of survival rateand average body weight of wild-type and REGγ-knockout mice after Listeria monocytogenes infection

分別腹腔注射40μL李斯特菌于6只野生型和7只REGγ敲除小鼠，3d后取出肝臟和脾臟，組織勻漿后梯度涂板．結(jié)果如圖2，與野生型小鼠相比，李斯特菌感染后REGγ敲除小鼠的組織勻漿液長(zhǎng)出的單克隆數(shù)目遠(yuǎn)多于野生型的小鼠的組織，每克組織經(jīng)勻漿后再培養(yǎng)長(zhǎng)出的細(xì)菌數(shù)論作n． 由圖2可見(jiàn)，REG敲除小鼠抵抗李斯特菌感染的能力較弱．

2.2 靜息狀態(tài)下，REGγ對(duì)免疫細(xì)胞的調(diào)控作用

為了檢測(cè)REGγ對(duì)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的影響，本研究比較了生理?xiàng)l件下，野生型和REGγ敲除小鼠骨髓和外周血中B(B220+)淋巴細(xì)胞、T(CD3+)淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞(GR1+CD11b+)和單核細(xì)胞(GR1-CD11b+)的分布差異．靜息狀態(tài)下，分別提取野生型和REGγ敲除小鼠的骨髓和外周血細(xì)胞，各3只，裂解紅細(xì)胞后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各細(xì)胞所占百分比的差異．結(jié)果如圖3，REGγ敲除對(duì)骨髓和外周血中各細(xì)胞所占的百分比沒(méi)有影響．

2.3REGγ敲除抑制吞噬細(xì)胞浸潤(rùn)至感染部位

***表示P<0.00圖2 李斯特菌感染后，野生型和REGγ敲除小鼠肝臟和脾臟的細(xì)菌負(fù)荷量Fig.2 Bacterial load in liver and spleen of wild-type and REGγ-knockout mice after Listeria monocytogenes infection

分別腹腔注射400μL李斯特菌于野生型和REGγ敲除小鼠各6只，4h后提取骨髓和外周血細(xì)胞．裂解紅細(xì)胞后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)中性粒細(xì)胞(GR1+CD11b+)和單核細(xì)胞(GR1-CD11b+)所占百分比的差異．結(jié)果如圖4，相對(duì)野生型小鼠，李斯特菌感染后REGγ敲除小鼠中中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞所占腹腔液細(xì)胞的百分比明顯降低，如圖4(a)、(b)和(c)，外周血中中性粒細(xì)胞所占百分比也顯著降低，而單核細(xì)胞所占外周血細(xì)胞的百分比沒(méi)有差異，如圖4(a)、(d)和(e)．

2.4 靜息狀態(tài)下，REGγ對(duì)免疫細(xì)胞的調(diào)控作用

分別腹腔注射40μL李斯特菌于野生型和REGγ敲除小鼠各6只，3d后取出肝組織．此外，分別腹腔注射LPS于野生型和REGγ敲除小鼠各6只，8h后取出肺組織．肝和肺組織經(jīng)多聚甲醛固定，石蠟切片后進(jìn)行HE染色．結(jié)果如圖5，與未感染小鼠組織相比，李斯特菌感染或LPS注射菌均介導(dǎo)不同程度的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)．但是，REGγ敲除小鼠肝組織中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)明顯低于野生型小鼠，如圖5(a)，REGγ敲除小鼠肺組織中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)也明顯低于野生型小鼠，且損傷程度也低于野生型小鼠，如圖5(b)．

圖3 生理?xiàng)l件下，野生型、REGγ敲除小鼠中B、T淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞在骨髓和外周血細(xì)胞中的比例Fig.3 Percentage of B,T lymphocytes and neutrophils, monocytes in bone marrow and peripheral blood of wild-type and REGγ-knockout mice under physiological condition

**表示P<0.01; ***表示P<0.001圖4 李斯特菌感染后，野生型和REGγ敲除小鼠中中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞向腹腔和外周血中的浸潤(rùn)Fig.4 Infiltration of neutrophils andmonocytes to peritoneal cavity and peripheral blood ofwild-type and REGγ-knockout mice after Listeria monocytogenes infection

圖5 李斯特菌感染和LPS注射后，野生型和REGγ敲除小鼠中免疫細(xì)胞向肝臟和肺組織的浸潤(rùn)Fig.5 (Color online)Immune cells infiltration to liver and lung of wild-type and REGγ-knockout mice after Listeria monocytogenes infection and LPS injection

3 討 論

造血系統(tǒng)在感染早期發(fā)揮重要的防御作用，以中性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞為主的固有免疫細(xì)胞充當(dāng)早期抵御感染的主力軍．免疫系統(tǒng)感應(yīng)到感染的危險(xiǎn)信號(hào)時(shí)，中性粒細(xì)胞迅速活化最早趨化至感染部位，吞噬殺傷以清除病原菌[10-12]．通過(guò)釋放細(xì)胞因子、趨化因子、抗菌肽、活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)和活性(nitricoxide，NO)等炎性介質(zhì)，一方面發(fā)揮吞噬殺傷作用，另一方面可以趨化更多的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)至此，以放大免疫應(yīng)答反應(yīng)，協(xié)同清除感染的病原菌，大多數(shù)的感染可止步于此．炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)在機(jī)體抵御病原菌感染過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，但大量炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)也是適可而止的，如果炎癥反應(yīng)過(guò)度，則周?chē)＝M織也會(huì)成為免疫系統(tǒng)的攻擊靶點(diǎn)，造成機(jī)體不必要的損傷[13]．

REG家族包括REGα、REGβ和REGγ，其中，REGα和REGβ高表達(dá)于免疫細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，參與MHC-Ⅰ-抗原肽復(fù)合物的形成[14]．REGγ僅分布在細(xì)胞核內(nèi)，通過(guò)降解P53[8]、SirT1[15]、SirT7[16]、c-Myc[17]、KLF2[9]和IBε[18]等，參與調(diào)節(jié)衰老、脂肪代謝、細(xì)胞增殖、宿主防御、腸炎和能量平衡等生理、病理進(jìn)程．本研究首次發(fā)現(xiàn)REGγ敲除抑制中性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)至感染部位．因此，REGγ缺失不僅可以直接調(diào)控中性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞對(duì)病原菌的殺傷活性，而且抑制了其向感染部位的浸潤(rùn)，共同導(dǎo)致REGγ敲除小鼠感染部位的細(xì)菌不能有效的被清除，細(xì)菌大量增殖，進(jìn)而進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，引發(fā)全身性的感染和組織器官的功能紊亂，即敗血癥，最終導(dǎo)致REGγ敲除小鼠的存活率下降．但是，關(guān)于REGγ對(duì)于細(xì)胞浸潤(rùn)的調(diào)控機(jī)制尚不清楚，還需深入研究．

結(jié) 語(yǔ)

感染發(fā)生時(shí)，骨髓中的血細(xì)胞將被動(dòng)員而遷移至外周，最終穿過(guò)血管壁到達(dá)感染部位，中性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞在抵抗局部感染中發(fā)揮主力軍作用．蛋白酶體激活因子REGγ可能通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞向感染部位的浸潤(rùn)和募集，參與調(diào)節(jié)機(jī)體宿主防御功能，后續(xù)仍需深入研究其調(diào)控機(jī)制．

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【中文責(zé)編：晨 兮；英文責(zé)編：艾 琳】

The inhibitory effect of REGγ-knockout on cell infiltration

Sun Jinxia1, Wang Rui2, and Huang Zhong1?

1) Health Science Center, Shenzhen University, Shenzhen 518060, Guangdong Province, P.R.China 2) College of Pharmacy, Liaocheng University, Liaocheng 252059, Shandong Province, P.R.China

Peritoneal injections ofListeriaMonocytogenestowild-typeandREGγ-knockoutmicewereperformedforanalyzingtherolesofproteasomeactivatorREGγinimmunecellinfiltration.Bysurvivalassay,cloneformationassay,flowcytometryandhematoxylin-eosinstaining,wefoundthatmicelackingREGγshowssignificantlylowersurvivalandListeriaMonocytogenesclearance.Furthermore,REGγdeficiencyobviouslyinhibitstheinfiltrationofneutrophilandmonocytetoinfectionsites.Thus,theresultssuggestthatREGγdeficiencysuppressesimmunecellrecruitmenttoinfectionsites，resultinginimpairedbacterialclearance.Rapidbacterialreproductioncausessepsiseventually,andleadstothereducedsurvivalrateofREGγ-knockoutmice.

sepsis; proteasome;ListeriaMonocytogenes;neutrophil;monocyte;cellinfiltration;cloneformationassay;flowcytometry;hematoxylin-eosinstaining

：Sun Jinxia, Wang Rui, Huang Zhong. The inhibitory effect of REGγ-knockout on cell infiltration[J]. Journal of Shenzhen University Science and Engineering, 2017, 34(2): 111-116.(in Chinese)

R 392

A

10.3724/SP.J.1249.2017.02111

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31401217)；中國(guó)博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2014M0560672)

孫錦霞(1986—)，女，深圳大學(xué)博士后研究人員. 研究方向：免疫學(xué).E-mail：jinxia8608@126.com

Received：2016-12-16；Accepted：2017-01-27

Foundation：National Natural Science Foundation of China (31401217); Postdoctral Science Foundation of China (2014M0560672)

? Corresponding author：Professor Huang Zhong. E-mail: zhuang809@126.com

引 文：孫錦霞，王 瑞，黃 鐘.REGγ敲除對(duì)細(xì)胞浸潤(rùn)的抑制作用[J]. 深圳大學(xué)學(xué)報(bào)理工版，2017，34(2)：111-116.