匙羹藤總皂苷通過調(diào)控脂肪組織PI3K/AKT信號通路改善胰島素抵抗的作用機制研究＊

秦靈靈，穆曉紅，徐暾海，劉銅華

（1.北京中醫(yī)藥大學科技處 北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院 北京 100700；3.北京中醫(yī)藥大學中藥學院 北京 100029；4.北京中醫(yī)藥大學研究生院 北京 100029）

肥胖已成為全球性問題，據(jù)統(tǒng)計86%的2型糖尿?。╰ype 2 diabetes，T2DM）是肥胖患者，近年來研究顯示肥胖患者脂肪組織中異常病理改變可導致脂肪組織發(fā)生IR，進而引起T2DM發(fā)生發(fā)展[1]，脂肪組織中胰島素介導的PI3K-AKT信號通路是IR發(fā)生發(fā)展的主要分子作用機制[2]。本課題組前期實驗表明，匙羹藤具有緩解IR的作用[3]，而GA同時又是其降糖的主要作用成分，因此本實驗以GA為干預因素，觀察其對具有IR以及肥胖特征的KKay小鼠脂肪組織IR的作用，并以PI3K-AKT信號通路為切入點，觀察其分子調(diào)控機制。

1 材料

1.1 實驗動物

27只SPF級KKay小鼠（雄性，6-7周齡），9只同周齡雄性SPF級C57BL/6J小鼠，均購自中國醫(yī)學科學院實驗動物所，許可證號SCXK京2009-0004，均采用單籠喂養(yǎng)。

1.2 藥物與試劑

GA提取流程：將匙羹藤生藥2 kg按照料水比1:10，1.5 h→1:10，1.5 h→1:8，1 h進行煎煮，濾液濃縮至稠膏，干燥后制成粉末。稱取粉末50.7000 g，水溶后超聲15 min，過濾后分別用水、10%、50%、75%、95%的乙醇上大孔樹脂RS-3洗脫，隨后濃縮。采用香草醛-高氯酸比色紫外分光光度法測定各濃縮液中GA含量，選取皂苷含量最高的知50%乙醇洗脫物液用于實驗。

鹽酸吡格列酮片（北京太洋藥業(yè)有限公司）；MMLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara公司）；100bp DNA Ladder（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；擴增試劑盒（北京中原領(lǐng)先科技有限公司）；Trizol試劑盒（Invitrogen公司）；Agarose（Promega公司）；DEPC（Sigma公司）；蛋白質(zhì)Marker（MBI公司）；AKT抗體（CST公司，#4685）；PAKT（ser473）（CST 公 司 ，#4060）；P-AKT（Thr 308）（CST公司，#4056）；PDK1抗體（CST公司，#3062）。

1.3 主要儀器

低溫高速離心機（3κ30，Sigma）、實時熒光定量PCR儀（ABI 7500）、高速4℃低溫離心機（Thermo）、核酸紫外分光光度計（Biophotometer）、半干轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)印儀（Bio-Rad）、轉(zhuǎn)膜儀（J-MAX，#ST-2）、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（Bio-Rad）、垂直電泳槽（Bio-Rad）、計算機圖像分析儀（Image-Pro Plus Analysis Soft ware）。

2 方法

2.1 動物分組及飼養(yǎng)方法

動物適應性喂養(yǎng)1周后測隨機血糖，選取非同日兩次隨機血糖13.9 mmol·L-1的27只KKay小鼠，按體重隨機分為DM組、BG組、GA組。選取9只C57BL/6J小鼠作為NC組。KKay小鼠喂以KK高脂鼠料，C57BL/6J小鼠喂以普通飼料。

2.2 給藥方法

采用灌胃方式，按1 mL·100 g-1/天（但不超過0.5 mL）的體積給藥。按照體表面積法換算小鼠給藥劑量：BG組4.05 mg·kg-1/天；GA組按照中藥生藥量15 g·kg-1/天給藥；NC組和DM組給予相同劑量的無菌水。

2.3 檢測方法

2.3.1 空腹血糖

空腹血糖取血方法：剪尾取血，用血糖儀及試紙測定；

表1 擴增基因的引物序列

2.3.2 Fins

Fins值測定方法為：放射性免疫法檢測血清中Fins值；

2.3.3 ISI

ISI計算方法為：ISI=1/FPG×Fins，取其自然對數(shù)進行統(tǒng)計。

2.3.4 實時熒光定量PCR法檢測目標mRNA含量

檢測附睪脂肪組織中APN、PTEN、PI3K-p85mRNA表達量。① Trizol一步法提取總RNA：將脂肪組織放入研缽中加入液氮進行快速研磨，用核酸紫外分光光度計法檢測RNA的濃度與純度；②引物序列：見下表1；③RNA的體外反轉(zhuǎn)與實時熒光PCR：采用25 μL反轉(zhuǎn)錄體系，42℃孵育60 min→70℃ 10 min，將cDNA加入20 μL反應體系，94℃預變性1 min，94℃ 15 s 、60℃ 34 s、72℃ 15 s 40個循環(huán)，72℃ 10min，用相對定量2-△△CT法分析結(jié)果。

2.4.5 western blot法檢測 AKT、P-AKT（Ser473）、PAKT（Thr 308）、PDK-1蛋白表達量

提取細胞內(nèi)蛋白→測定總蛋白含量→蛋白變性→SDS-PAGE電泳（10%SDS-PAGE分離膠，5%濃縮膠分離蛋白）→轉(zhuǎn)印→封閉→一抗（1∶1 000比例稀釋）孵育→二抗（1∶10 000稀釋）孵育，室溫放置1 h→清洗→ECL發(fā)光→用IPP軟件對掃描圖象的目的條帶進行灰度分析。

2.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以平均值±標準差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析方法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 一般情況

表2 各組小鼠攝食量的變化(±s)

表2 各組小鼠攝食量的變化(±s)

注：與NC組相比，*P＜0.05。

圖1 各組小鼠體重的變化(±s)

表3 各組小鼠FPG、Fins、ISI水平(±s)

表3 各組小鼠FPG、Fins、ISI水平(±s)

注：與NC組相比，*P＜0.05；與DM組相比，&P＜0.05。

在給藥期內(nèi)由于灌胃操作失敗，DM組小鼠死亡1只。NC組小鼠精神狀態(tài)良好，皮毛有光澤，活動自如，反應機敏；DM組小鼠精神萎靡，皮毛干枯無光澤，動作遲緩，行為倦怠，反應遲鈍，且在實驗過程中逐漸加重；BG、GA組與DM組小鼠狀態(tài)相似，在給藥過程中，皮毛顏色有相黑色轉(zhuǎn)變的情況，與DM組小鼠相比較，精神狀態(tài)較好，活動時間較多且較靈活，反應較靈敏些。

3.2 GA對攝食量、體重的影響

從表2可以看出：與NC組攝食量相比較，DM組小鼠顯著增加（P＜0.05）；在給藥過程中，與DM組攝食量相比較，BG，GA組雖有減少但沒有統(tǒng)計學意義。

從圖1可以看出：與NC組體重相比較，DM組升高（P＜0.05），與DM組體重相比較，BG組小鼠從第7周開始降低（P＜0.05），GA組小鼠從第3周開始降低（P＜0.05）。

3.3 GA對FPG、Fins、ISI的影響

由表3可以看出，經(jīng)GA干預后，與NC組相比，DM組FPG、Fins水平升高，ISI降低（P＜0.05）；與DM組相比，BG組FPG、Fins水平降低，ISI升高（P＜0.05），GA組FPG、Fins水平降低，ISI升高（P＜0.05）。

3.4 GA對脂聯(lián)素基因表達的影響

從圖2-（1-3）可以看出：與NC組APNmRNA表達量相比較，DM組降低（P＜0.05）；與DM組APNmRNA表達量相比較，BG組、GA組均增加（P＜0.01）。

3.5 GA對脂肪組織PI3K-p85mRNA表達量的影響

從圖3-（1-3）可以看出：與NC組PI3K-p85mRNA表達量相比較，DM組降低（P＜0.05）；與DM組PI3K-p85mRNA表達量相比較，GA組增加（P＜0.05）。

3.6 GA對AKT、P-AKT（ser473），P-AKT（Thr 308）蛋白表達量的影響

從圖4-(1-6)可以看出：P-AKT（Thr 308）：與NC組P-AKT（Thr 308）蛋白表達量相比較，DM組顯著降低（P＜0.01）；與DM組P-AKT（Thr 308）蛋白表達量相比較，BG組升高（P＜0.05），GA組顯著升高（P＜0.01）。P-AKT（Ser473）：與NC組P-AKT（Ser 473）蛋白表達量相比較，DM組降低（P＜0.05）；與DM組PAKT（Ser 473）蛋白表達量相比較，GA組升高（P＜0.05）。P-AKT（Thr 308）/AKT比值（磷酸化程度）：與NC組AKT第308位Thr磷酸化程度相比較，DM組顯著降低（P＜0.01）；與DM組AKT第308位Thr磷酸化程度相比較，BG組、GA組均顯著升高（P＜0.01）。PAKT（Ser473）/AKT比值（磷酸化程度）：與NC組AKT第473位Ser磷酸化程度相比較，DM組降低（P＜0.01）；與DM組AKT第473位Ser磷酸化程度相比較，GA組顯著升高（P＜0.01），BG組此位點磷酸化程度有上升趨勢，但是沒有統(tǒng)計學差異。

3.7 GA對PDK-1蛋白表達量的影響

從圖5-(1-2)可以看出：與NC組PDK-1蛋白表達量相比較，DM組增加（P＜0.01）；與DM組PDK-1蛋白表達量相比較，BG組降低（P＜0.05），GA組降低（P＜0.01）。

3.8 GA對PTEN基因表達量的影響

從圖6-（1-3）可以看出：與NC組PTENmRNA表達量相比較，DM組沒有顯著變化，但是與DM組PTE-NmRNA表達量相比較，BG組、GA組降低（P＜0.05）。

圖2-1 各組小鼠APNmRNA表達量(±s)

圖2-2 APN擴增曲線

圖2-3 APN溶解曲線

4 討論

圖3-1 各組小鼠PI3K-p85mRNA表達量(±s)

圖3-2 PI3K-p85擴增曲線

圖3-3 PI3K-p85溶解曲線

目前，以IR為主要特征的相關(guān)代謝性疾病，包括2型糖尿病、高脂血癥、高尿酸血癥、心血管疾病及代謝綜合征在全球呈迅速上升趨勢，而肥胖成為了這類人群的潛在發(fā)病因素，越來越多的研究認為異常增多的脂肪組織引起的IR，是IR疾病群的觸發(fā)因素[4]。胰島素在其外周靶組織中借助于不同的信號通路發(fā)揮其對葡萄糖代謝及利用的生物學效應，其中PI3K/AKT占主要地位，該通路主要至通過與目標細胞表面胰島素受體結(jié)合后，通過一系列反應使胰島素受體底物被磷酸化，進而與PI3K的p85調(diào)節(jié)亞單位相結(jié)合，從而催化p110，最終激活PI3K，經(jīng)過一系列級聯(lián)反應最終通過磷酸化AKT第308位的蘇氨酸以及473位的絲氨酸激活AKT，發(fā)揮生物學效應[5]。近年來發(fā)現(xiàn)PTEN具有削弱PI3K/AKT的作用，主要是通過特異地使磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸3′位脫磷酸實現(xiàn)的[6,7]。PDK-1在PI3K/AKT信號通路中主要是在三磷酸肌醇的作用下與AKT相結(jié)合，參與了其第308位蘇氨酸的磷酸化過程[8]。本實驗在進行中，發(fā)現(xiàn)GA在不影響攝食量的前提下對于小鼠的體重具有明顯的減輕作用，且可改善IR狀態(tài)，因此本實驗選擇脂肪組織為目標組織，以PI3K/AKT信號通路為切入點觀察GA干預IR的作用機制。

圖4-1 各組小鼠目標蛋白表達量（自左到右為：NC，DM，BG，GA）

圖4-2 各組小鼠AKT蛋白表達量(±s)

圖4-3 各組小鼠P-AKT（Thr 308）蛋白表達量(±s)

圖4-6 各組小鼠P-AKT（Ser473）/AKT比值(±s)

KKay小鼠是一種自發(fā)2型糖尿病小鼠，表現(xiàn)為嚴重肥胖、高胰島素血癥、胰島素抵抗等代謝異常綜合征，研究發(fā)現(xiàn)KKay脂肪組織存在IR，且可能與PI3K信號通路傳導障礙有關(guān)[9]，適用于本實驗的設計思路，故選取了KKay小鼠作為研究對象。

圖5-1 各組小鼠目標蛋白表達量(自左到右為：NC，DM，BG，GA)

圖5-2 各組小鼠PDK-1蛋白表達量(±s)

APN是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種白色脂肪組織來源的具有多種生物活性的物質(zhì)，研究顯示其含量與脂肪組織IR呈負相關(guān)[10]。實驗結(jié)果顯示，經(jīng)GA干預后，ISI指數(shù)升高，脂肪組織APN基因表達量降低，此兩指標可從整體以及組織水平反映出GA改善脂肪組織IR的作用。對于PI3K-AKT信號通路，經(jīng)GA干預后表現(xiàn)為被激活狀態(tài)：①增加PI3K-p85mRNA的表達；②增強AKT第308位蘇氨酸、第473位絲氨酸的磷酸化：雖然對AKT的表達量沒有影響，但是增加了兩個磷酸化位點蛋白的表達量，從而增強了其磷酸化程度，進而增強了AKT的激活程度；③調(diào)節(jié)因子PDK-1蛋白表達量降低：雖然對于PI3K-AKT信號通路PDK-1起到正調(diào)節(jié)作用，但是PDK-1在模型小鼠脂肪組織中表現(xiàn)出表達量增加的現(xiàn)象，初步分析可能在IR狀態(tài)下，PI3K被抑制，三磷酸肌醇含量隨之降低，抑制了PDK-1的激活，而PDK-1的激活主要是通過PH域與細胞膜三磷酸肌醇相結(jié)合而被固定在細胞膜而實現(xiàn)的，因此存在于細胞漿中的未被激活的PDK-1含量增加，實驗中提取的是細胞內(nèi)的蛋白（未被激活的PDK-1），因此表現(xiàn)出來的是含量增加的現(xiàn)象，在經(jīng)GA干預后PI3K被激活，三磷酸肌醇含量增加，促進了PDK-1的激活，因此存在于細胞內(nèi)的未被激活的PDK-1降低，間接提示了IR得以緩解，其并非是GA對該信號通路的作用點，而是一系列調(diào)節(jié)作用所表現(xiàn)出來的現(xiàn)象；④減少PTEN基因表達量：與C57小鼠相比較，PTEN在模型小鼠脂肪組織中的基因表達量沒有變化，但是在經(jīng)過GA干預8周后，與模型組相比，給藥組小鼠體內(nèi)的基因表達量降低，由此推測其對PIK/AKT信號通路的抑制作用減弱，間接起到了增強該通路作用的效應。本實驗同時以具有緩解IR作用的BG為對照藥物，結(jié)果顯示其具有改善IR的作用，但是其降低體重的作用較GA出現(xiàn)晚，GA表現(xiàn)出了其減肥的優(yōu)勢所在。在對PI3K/AKT信號通路作用方面，BG表現(xiàn)出的激活作用與GA也不盡相同，BG主要通過作用在AKT的第473位絲氨酸的磷酸化上，而GA在對PI3K的P85亞基、AKT第308位Thr、第473位Ser的磷酸化上均表現(xiàn)出其激活作用，提示GA對PI3K/AKT信號通路調(diào)控具有多靶點、多樣化的特征。

圖6-1 各組小鼠PTENmRNA表達量(±s)

圖6-2 PTEN擴增曲線

圖6-3 PTEN溶解曲線

綜上所述，GA可通過多環(huán)節(jié)激活脂肪組織PI3K/AKT信號通路，進而改善KKay小鼠IR，但其具體分子調(diào)控機制還有待進一步的研究。

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