白鶴芋染色體制片技術(shù)優(yōu)化及核型分析

張桂芳，任改婷，周佐葡，雷利鋒，劉 春，張 黎

(1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081)

白鶴芋染色體制片技術(shù)優(yōu)化及核型分析

張桂芳1，任改婷1，周佐葡1，雷利鋒1，劉 春2，張 黎1

(1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081)

以白鶴芋(Spathiphyllumfloribundum) ‘Mojo’品種的組培苗根尖為試驗材料，采用常規(guī)壓片法，比較不同取材時間、預(yù)處理方法對染色體制片的影響，并對其進(jìn)行核型分析。結(jié)果表明，于08:45-09:15取材，用0.002 mol·L-18-羥基喹啉或0.07 mmol·L-1放線菌酮預(yù)處理4 h所得的染色體制片效果最佳。白鶴芋的染色體數(shù)目為2n=2x=30，為二倍體，‘Mojo’品種有B染色體，核型公式為2n=2x=30=20m+6m(SAT)+2sm+2sm(SAT)(B染色體)，其中3號和8號為近中部著絲粒染色體(sm)，其余的染色體都是中部著絲粒染色體(m)。3號、4號、6號和9號的染色體具隨體。最長染色體與最短染色體比為1.73；核型屬2A型，核型不對稱系數(shù)為56.37%。

白鶴芋；染色體；制片優(yōu)化；核型分析

白鶴芋(Spathiphyllumfloribundum)是天南星科白鶴芋屬多年生常綠草本植物，是一種理想的室內(nèi)觀賞花卉[1-2]。1874 年從原產(chǎn)地哥倫比亞等美洲熱帶地區(qū)被引種至歐洲，20 世紀(jì)初成為盆栽花卉，我國于20世紀(jì)80年代末開始引種栽培[2]。盆栽花卉有著廣闊的市場前景，據(jù)統(tǒng)計[3]，2010年，荷蘭盆栽白鶴芋的年銷售額已達(dá)1 990萬美元，位列荷蘭盆花產(chǎn)量的第九位。白鶴芋具有凈化空氣，過濾空氣中的苯、三氯乙烯和甲醛的功能[4-5]，具有較高的經(jīng)濟(jì)價值和觀賞價值，目前我國各地均有栽培[5]。

植物染色體的數(shù)目、形態(tài)特征是最穩(wěn)定的細(xì)胞學(xué)特征之一[6-7]。對染色體數(shù)目進(jìn)行計數(shù)可以用來確定植物是否為多倍體以及多倍體加倍的倍性[8]。此外，染色體核型參數(shù)、核型類型可作為物種的系統(tǒng)演化及其親緣關(guān)系和分類鑒定的重要依據(jù)[6]。然而，目前針對白鶴芋屬植物染色體制片優(yōu)化及核型分析的研究報道較少，2013年劉金梅等[9]對白鶴芋屬染色體的數(shù)目進(jìn)行了報道，并未對其進(jìn)行更深層次的研究。本研究優(yōu)化白鶴芋細(xì)胞染色體的制片條件，并進(jìn)行核型分析，旨在為白鶴芋細(xì)胞遺傳學(xué)和育種研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取白鶴芋‘Mojo’品種生長健壯的組培苗接入到生根培養(yǎng)基中，長出新根后，剪取新根進(jìn)行試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 取材時間 取組培苗新長出的根尖1.5～2 cm，于08:00-10:00，每隔15 min取材一次，用0.07 mmol·L-1放線菌酮20 ℃預(yù)處理4 h，蒸餾水漂洗3～4次，放入卡諾氏固定液(冰醋酸∶無水乙醇=1∶3)中4 ℃下固定24 h后，用蒸餾水清洗3～4次，分別用蒸餾水和KCl前低滲各30 min，然后用1 mol·L-1HCl 60 ℃解離10 min之后，用蒸餾水清洗干凈，再用蒸餾水后低滲10 min，取根尖小白點，用鑷子碾碎，卡寶品紅染色10～30 min后，制片。40倍鏡下，觀察約1 000個細(xì)胞，計算其中期分裂指數(shù)和染色體分散指數(shù)。

相關(guān)公式為：

中期分裂指數(shù)=中期分裂相細(xì)胞/觀察的細(xì)胞×100%；

染色體分散指數(shù)=適合做核型分析的中期細(xì)胞/中期分裂相細(xì)胞×100%。

1.2.2 預(yù)處理方法 采用不同的預(yù)處理方法對根尖進(jìn)行處理，分別用0.002 mol·L-18-羥基喹啉、飽和對二氯苯溶液、0.1%秋水仙素、0.07 mmol·L-1放線菌酮、0.1%秋水仙素與0.002 mol·L-18-羥基喹啉(1∶1)混合液及0.07 mmol·L-1放線菌酮與0.002 mol·L-18-羥基喹啉(1∶1)混合液20 ℃下預(yù)處理2、4和6 h，以及冰水混合物4 ℃下預(yù)處理24 h。

1.2.3 染色體核型分析 選取30個染色體分散和縮短較好的細(xì)胞，對其染色體進(jìn)行計數(shù)，將85%以上細(xì)胞具有的染色體數(shù)目作為白鶴芋的染色體數(shù)目。以85%以上的細(xì)胞具有相同的染色體數(shù)作為該種的染色體數(shù)，選取5個分散較好的中期分裂相細(xì)胞，使用Photoshop 軟件對染色體進(jìn)行測量和配對，取平均值計算核型數(shù)據(jù)核型分析。利用Excel 及畫圖軟件繪制核型模式圖。依照李懋學(xué)等[10-11]提出的標(biāo)準(zhǔn)對其進(jìn)行核型分析；著絲點位置則根據(jù)Levan等[12]提出的命名法則來確定；染色體核型分類按照Stebbins[7]提出的標(biāo)準(zhǔn)劃分，染色體相對長度指數(shù)(I.R.L)參考Kuo[13]提出的方法計算；按Arano[14]的方法計算核型不對稱系數(shù)(As.K)。

相關(guān)公式為：

臂比=長臂長度/短臂長度；

著絲粒指數(shù)=短臂長度/染色體組總長度×100%；

染色體相對長度=染色體長度/染色體組總長度×100%；

染色體相對長度指數(shù)=染色體長度/全組染色體平均長度；

核型不對稱系數(shù)=長臂總長度/全組染色體總長度×100%[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 取材時間對染色體制片的影響

從08:00開始白鶴芋根尖的染色體分裂指數(shù)逐漸增大(表1)，到09:15時達(dá)到最大，為5.48%，隨后，其分裂指數(shù)又逐漸減小。染色體分散指數(shù)在08:45和09:15時達(dá)到最大，為50%。08:45和09:00的染色體中期分裂指數(shù)也較大，可以作為染色體制片的取材時間，所以白鶴芋染色體制片的最佳取材時間段為08:45-09:15，最佳的取材時間為09:15。

表1 不同取樣時間對染色體制片的影響

圖1 不同預(yù)處理方法對染色體制片的影響

注：A-C，0.1%秋水仙素預(yù)處理2、4、6 h；D-F，0.002 mol·L-18-羥基喹啉預(yù)處理2、4、6 h；G-I，0.07 mmol·L-1放線菌酮預(yù)處理2、4、6 h；J-L，飽和對二氯苯預(yù)處理2、4、6 h；M-O，0.1%秋水仙素與0.002 mol·L-18-羥基喹啉混合液預(yù)處理2、4、6 h；P-R，0.07 mmol·L-1放線菌酮與0.002 mol·L-18-羥基喹啉混合液處理預(yù)2、4、6 h；S，冰水混合物4 ℃下預(yù)處理24 h。Note： A-C， 0.1% Colchicine pretreatment times, 2, 4, and 6 h； D-F， 0.002 mol·L-18-hydroxyquinoline, pretreatment times, 2, 4, and 6 h； G-I， 0.07 mmol·L-1actidione, pretreatment times 2, 4, and 6 h；J-L， Saturated 1,4 dichlorophenyl solution, pretreatment times, 2, 4, and 6 h; M-O， mixture of 0.1% colchicine and 0.002 mol·L-18-hydroxyquinoline, pretreatment times, 2, 4, and 6 h; P-R， mixture of 0.07 mmol·L-1actidione and 0.002 mol·L-18-hydroxyquinoline, pretreatment times, 2, 4, and 6 h；S mixture of ice and water (4 ℃), pretreatment time, 24 h.

2.2 預(yù)處理方法對染色體制片的影響

對比分析各預(yù)處理方法對染色體制片的影響(圖1)，結(jié)果表明,0.1%秋水仙素預(yù)處理條件下，2 h的染色體縮短程度較差，呈絲狀。4和6 h的染色體均縮短的非常好，呈短棒狀，但6 h的染色體分散效果不是很好，而預(yù)處理4 h的染色體分散效果較好，所以以0.1%秋水仙素預(yù)處理4 h適合白鶴芋染色體制片。0.002 mol·L-18-羥基喹啉預(yù)處理條件下，4 h的效果最好，染色體縮短適中，清晰，分散效果好，且染色背景清晰。2 h的染色體縮短程度差，呈絲狀，6 h的染色體縮短程度較高，但分散效果不好，兩個時間均不利于染色體計數(shù)與核型分析。0.07 mmol·L-1放線菌酮預(yù)處理條件下，2和4 h的染色體縮短均較好，染色體清晰，但預(yù)處理2 h的染色體分散程度要比4 h的差；6 h的染色體縮短程度較高，呈極短棒狀，對核型分析不利。飽和對二氯苯預(yù)處理條件下，2和4 h的處理效果均較差；6 h的處理效果較好，染色體縮短較好，染色體清晰，分散效果好，但其中期分裂指數(shù)較低，可以作為白鶴芋的染色體制片。0.07 mmol·L-1放線菌酮與0.002 mol·L-18-羥基喹啉(1∶1)混合液預(yù)處理條件下，3種預(yù)處理時間下的染色體分散效果都較好，預(yù)處理4 h的染色體呈短棒狀，染色體清晰，制片效果最好；預(yù)處理2和6 h的染色體分別呈長棒狀和極短棒狀，都不適合做染色體的核型分析。0.07 mmol·L-1放線菌酮與0.002 mol·L-18-羥基喹啉(1∶1)混合液預(yù)處理條件下，4與6 h效果差別不大，染色體縮短程度較好，染色體較清晰，染色背景清晰，但染色體的分散程度較差，2 h要比4和6 h的效果差，因此該處理液不適合白鶴芋染色體制片。冰水混合物4 ℃預(yù)處理24 h條件下，染色體縮短正好，染色體清晰，但染色體的分散程度較差，若能提高染色體的分散度，則是白鶴芋染色體制片較好的選擇。

綜合比較各處理組的中期分裂指數(shù)、染色體分散指數(shù)以及染色體制片效果，0.1%秋水仙素、0.002 mol·L-18-羥基喹啉、0.07 mmol·L-1放線菌酮及0.07 mmol·L-1放線菌酮與0.002 mol·L-18-羥基喹啉(1∶1)混合液，預(yù)處理4 h均適合白鶴芋的染色體制片。飽和對二氯苯預(yù)處理6 h也可以作為白鶴芋的染色體制片方法。而最適合白鶴芋染色體制片的是0.002 mol·L-18-羥基喹啉和0.07 mmol·L-1放線菌酮，預(yù)處理4 h。

表2 白鶴芋染色體核型分析

注：隨體的長度計算在內(nèi)；*表示該染色體上具有隨體。

Note: Whole chromosomal length includes satellite length;*indicates chromosome possessing one or more satellites.

2.3 核型分析

按照植物核型分析標(biāo)準(zhǔn)，對白鶴芋的染色體進(jìn)行核型分析。選取30個染色體分散和縮短較好的細(xì)胞進(jìn)行染色體計數(shù)，測量每一組染色體的長臂和短臂。根據(jù)公式計算其染色體相對長度、臂比、著絲粒指數(shù)以及染色體相對長度指數(shù)，利用Photoshop 軟件對染色體按照總長度由長至短的順序進(jìn)行排列和編號(表2，圖2-4)。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白鶴芋‘Mojo’的染色體數(shù)目為2n=2x=30，有1條B染色體。其中3號和8號為近中部著絲粒染色體(sm)，占染色體總數(shù)的13.33%，其余的染色都是中部著絲粒染色體(m)，占染色體總數(shù)的86.67%。3號、4號、6號和9號的染色體具隨體，且3號和4號的隨體在長臂上，6號和9號的隨體在短臂上。核型公式為2n=2x=30=20m+6m(SAT)+2sm+2sm(SAT)(B染色體)，最長染色體與最短染色

體比為1.73，染色體相對長度在3.57%～10.12%，染色體相對長度指數(shù)在0.53～1.54。白鶴芋的核型為2A型，核型不對稱系數(shù)為56.37%。

圖2 白鶴芋染色體形態(tài)

圖3 白鶴芋染色體核型

圖4 白鶴芋染色體核型模式

3 討論與結(jié)論

取材部位、取材時間和預(yù)處理方法等都對染色體制片有很大的影響，采用嫩葉或莖的細(xì)胞制片，細(xì)胞分裂也極少，再加上去除其細(xì)胞壁的時間不好控制，而且其細(xì)胞壁不易去除，所以制片時能觀察到的細(xì)胞分裂相較少，與之相比，植物的根尖細(xì)胞分裂能力較強(qiáng)，制片較為容易，是研究有絲分裂過程的理想材料[15]。理論上，任何時間取樣制片，都可以從新根中獲得中期分裂相細(xì)胞。植物細(xì)胞染色體的分裂高峰期一般在08:00-10:00[16]，相關(guān)研究表明，火龍果(Hylocereusundatus)氣生根染色體制片的最佳取材時間為10:30[17]；對樹上干杏(Armeniaca)進(jìn)行核型分析研究時發(fā)現(xiàn)，其取材的最佳時間為08:30[8]。本研究初步發(fā)現(xiàn)，白鶴芋染色體制片的最佳取樣時間為08:45-09:15，這與百里香(Thymusmongolicus)[18]核型分析研究中得出的結(jié)論一樣。

預(yù)處理在染色體制片過程中起到關(guān)鍵性作用，對材料進(jìn)行預(yù)處理主要是阻斷紡錘體的形成，使細(xì)胞分裂終止在中期階段，從而提高中期分裂相的出現(xiàn)頻率[18]，優(yōu)化染色體的制片效果。而不同的植物其預(yù)處理方法一般也不同，菠蘿蜜(Artocarpusheterophyllus)染色體制片的最佳預(yù)處理方法為以0.002 mol·L-18-羥基喹啉與0.2%秋水仙素(1∶1)混合液作為預(yù)處理劑，預(yù)處理3 h[19]；春石斛(nobile-typeDendrobium)的染色體制片中使用0.002 mol·L-18-羥基喹啉與飽和對二氯苯的混合液預(yù)處理4 h的效果最佳[20];。藥材五鶴續(xù)斷(Dipsacusasper)染色體制片的最佳預(yù)方法是用0.1%秋水仙素預(yù)處理2.5 h[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，白鶴芋染色體最佳的預(yù)處理方法是用0.002 mol·L-18-羥基喹啉或0.07 mmol·L-1放線菌酮預(yù)處理4 h。用0.002 mol·L-18-羥基喹啉作為預(yù)處理液，處理4 h，獲得的染色體主、次縊痕清晰，染色體縮短適中，分散效果好。用0.07 mmol·L-1放線菌酮預(yù)處理4 h獲得的染色體縮短較好，染色體清晰，且分散效果好。

本研究得出白鶴芋的染色體數(shù)目為30，為二倍體，且‘Mojo’品種具有B染色體，這與劉金梅等[6]的報道一致。一般染色體的核型進(jìn)化趨勢是由對稱向不對稱方向演化，系統(tǒng)演化上處于比較原始或古老的植物，大多具有較對稱的核型，而衍生的、特化的以及比較進(jìn)化的植物類群，核型大多不對稱[22]。白鶴芋的不對稱系數(shù)為56.37%，具有較高的對稱性。B染色體是獨立存在于物種染色體之外的一種特殊染色體，又被稱為超染色體、附加染色體或額外染色體[23]。本研究發(fā)現(xiàn)白鶴芋‘Mojo’品種具有B染色體，而劉金梅等[6]在對白鶴芋的19個種或品種染色體的研究中發(fā)現(xiàn)，除了‘Mojo’品種外，還有其它的2個種5個品種也同樣具有B染色體。B染色體的存在會影響A染色體交叉的分布及頻率，而且對A染色體上特定基因的表達(dá)具有積極意義，從而影響個體的適應(yīng)性[24]。所以，白鶴芋中B染色體的存在可能有增強(qiáng)其適應(yīng)性的作用。隨體特征是重要的細(xì)胞學(xué)標(biāo)記,有可能作為雜種早期鑒定的細(xì)胞學(xué)特征[25],白鶴芋染色體上的隨體可作為其雜種鑒定的標(biāo)記。染色體的隨體一般在短臂上，但本研究發(fā)現(xiàn)‘Mojo’品種在3號和4號染色體長臂上也存在隨體，其作用有待進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯 王芳)

Optimization of chromosome sectioning and karyotype analysis ofSpathiphyllumfloribundum

Zhang Gui-fang1, Ren Gai-ting1, Zhou Zuo-pu1, Lei Li-feng1, Liu Chun2, Zhang Li1

(1.College of Agriculture, Ningxia University, Yinchuan 750021, China;2.Vegetable and Flower Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China)

To establish the optimal approach for analyzing the root tips ofSpathiphyllumfloribundum‘Mojo’, we compared different sampling times and pretreatments during chromosome sectioning. The results showed that the optimal sampling time was 08:45-09:15 and the optimal pretreatment was 0.002 mol·L-1or 0.07 mmol·L-1of 8-hydroxyquinolin or cycloheximide, respectively for 4 h.S.floribundumis a diploid plant and its chromosome number is 2n=2x=30. “Mojo” contains a B-chromosome. The karyotype analysis revealed thatS.floribundumis 2n=2x=30=20m+6m (SAT)+2sm+2sm(SAT) (B-chromosome). Furthermore, chromosome 3 and 8 are metacentric, whereas the others are facrocentric. Satellites were observed in the four pairs of chromosomes (3, 4, 6, and 9). The chromosomal length ratio was 1.73, mongolicus was 2A, and the karyotype asymmetry coefficient was 56.37%.

Spathiphyllumfloribundum; chromosome sectioning; chromosome; karyotype analysis

Zhang Li E-mail:zhang_li9988@163.com

10.11829/j.issn.1001-0629.2016-0333

2016-06-20 接受日期：2016-09-19

寧夏科技支撐計劃項目《寧夏設(shè)施園藝提升發(fā)展研究與示范》子課題——小盆花品種資源收集與種苗快繁技術(shù)研究與示范(2014ZZN09)；寧夏大學(xué)研究生創(chuàng)新項目(GIP201648)

張桂芳(1988-)，女，山西大同人，在讀碩士生，主要從事觀賞植物研究。E-mail:544406790@qq.com

張黎(1962-)，女，寧夏銀川人，教授，碩士，主要從事觀賞園藝研究。E-mail:zhang_li9988@163.com

Q943.1

A

1001-0629(2017)3-0532-07*

張桂芳,任改婷,周佐葡,雷利鋒,劉春,張黎.白鶴芋染色體制片技術(shù)優(yōu)化及核型分析.草業(yè)科學(xué),2017,34(3)：532-538.

Zhang G F,Ren G T,Zhou Z P,Lei L F,Liu C,Zhang L.Optimization of chromosome sectioning and karyotype analysis ofSpathiphyllumfloribundum.Pratacultural Science，2017,34(3)：532-538.