• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    3種對(duì)蝦精子超低溫冷凍保存技術(shù)研究

    2017-03-26 03:37:45王文琪楊敬昆徐世宏劉清華
    海洋科學(xué) 2017年9期
    關(guān)鍵詞:超低溫白對(duì)蝦抗凍

    王文琪, 楊敬昆, 徐世宏, 劉清華, 李 軍

    ?

    3種對(duì)蝦精子超低溫冷凍保存技術(shù)研究

    王文琪1, 楊敬昆1, 徐世宏2, 3, 劉清華2, 3, 李 軍2, 3

    (1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 海洋科學(xué)與工程學(xué)院, 山東 青島 266109; 2. 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所 中科院實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071; 3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266237)

    作者以日本囊對(duì)蝦()、中國(guó)明對(duì)蝦()和南美白對(duì)蝦()作為實(shí)驗(yàn)材料, 研究3種稀釋液(天然海水, 人工無(wú)鈣海水, Hank’s平衡鹽溶液)、3種抗凍劑(二甲基亞砜、丙二醇和丙三醇)、3種稀釋比例(5%、10%和15%)、3種不同的降溫程序?qū)?種對(duì)蝦精子超低溫冷凍保存效果的影響。凍精解凍后通過臺(tái)盼藍(lán)染色的方法計(jì)算其存活率。結(jié)果顯示, 對(duì)于3種對(duì)蝦, 以天然海水作為稀釋液, 10%PG作為抗凍劑, 4℃平衡20 min, 以–2℃/min降溫至–40℃, –40℃平衡10℃, 以–15℃/min降溫至–150℃, 然后投入液氮作為降溫程序進(jìn)行超低溫冷凍保存效果最好, 凍精解凍后存活率分別為75.33%±2.56%、69.00%±3.00%和 23.33%±8.55%。

    日本囊對(duì)蝦(); 中國(guó)明對(duì)蝦(); 南美白對(duì)蝦(); 精子; 超低溫冷凍; 存活率

    動(dòng)物種質(zhì)細(xì)胞的超低溫保存是指在超低溫條件下, 動(dòng)物種質(zhì)細(xì)胞內(nèi)一切新陳代謝過程中的化學(xué)變化被超低溫所抑制, 即隨著溫度的逐漸下降, 細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)能力也在逐漸降低, 當(dāng)溫度降到一定閾值時(shí), 細(xì)胞的生理活動(dòng)趨于停止; 低溫保存的細(xì)胞以一定的方式復(fù)蘇后, 又具有存活的能力[1]。細(xì)胞在冷凍和解凍過程中的損傷主要包括: 過冷休克、冰晶損傷、高滲休克、抗凍保護(hù)劑的毒性作用等[2]。精子冷凍過程中由于受到以上多方面因素的影響, 會(huì)使精子結(jié)構(gòu)受到損傷, 進(jìn)而使其功能受到影響。由于不同物種的精子對(duì)不同保存條件的承受能力不同, 因此, 應(yīng)該盡力優(yōu)化超低溫冷凍保存的各個(gè)條件, 盡量減少對(duì)精子的損傷, 增加精子冷凍保存效率。

    自20世紀(jì)80年代以來(lái), 對(duì)蝦養(yǎng)殖一直是中國(guó)海水經(jīng)濟(jì)作物的支柱型產(chǎn)業(yè), 尤其以南美白對(duì)蝦()、中國(guó)明對(duì)蝦()、日本囊對(duì)蝦()為主要的養(yǎng)殖物種, 但是, 由于近年來(lái)的養(yǎng)殖泛濫、種質(zhì)退化、品質(zhì)下降、病害增加等問題日益嚴(yán)重, 種質(zhì)資源保護(hù)問題一直是對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的一個(gè)亟待解決的大問題, 解決這一問題最成熟的辦法就是超低溫冷凍保存技術(shù)。近年來(lái), 超低溫冷凍保存技術(shù)對(duì)于哺乳動(dòng)物和魚類的精子中應(yīng)用廣泛, 而在幾種經(jīng)濟(jì)類對(duì)蝦品種的研究較少[3-5]??聛喎虻萚4]對(duì)中國(guó)明對(duì)蝦精子的超低溫冷凍保存進(jìn)行初步的研究,以自然海水或人工海水作基礎(chǔ)液添加10%DMSO和少量甘油配成抗凍稀釋液, 經(jīng)液氮蒸氣兩段預(yù)冷結(jié)冰后投人液氮中進(jìn)行超低溫冷凍保存, 解凍后精子存活率達(dá)到60%; Vuthiphandchai等[6]對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦()的納精囊冷凍保存進(jìn)行了研究, 使用5%DMSO作為抗凍劑, 無(wú)鈣人工海水作為稀釋液時(shí)保存效果最佳, 解凍后存活率達(dá)71.6%~72.2%; 浦蘊(yùn)惠等[7]對(duì)脊尾白蝦()的精子體外保存進(jìn)行了研究, 并研究了存活率和頂體酶之間的相關(guān)性。目前, 中國(guó)對(duì)對(duì)蝦精子的超低溫冷凍保存研究較少, 因此, 本實(shí)驗(yàn)決定以日本囊對(duì)蝦、中國(guó)明對(duì)蝦、南美白對(duì)蝦為實(shí)驗(yàn)對(duì)象, 篩選以上3種對(duì)蝦精子超低溫冷凍保存的最適方法。

    1 材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    實(shí)驗(yàn)用中國(guó)明對(duì)蝦和日本對(duì)蝦均來(lái)自日照對(duì)蝦良種養(yǎng)殖場(chǎng), 中國(guó)明對(duì)蝦體長(zhǎng)15.96 cm±0.68 cm, 體質(zhì)量40.19 g±3.68 g, 養(yǎng)殖溫度18~20℃。日本囊對(duì)蝦體長(zhǎng)12.11 cm±0.33 cm, 體質(zhì)量35.36 g±4.02 g, 養(yǎng)殖溫度25~27℃。南美白對(duì)蝦來(lái)自煙臺(tái)對(duì)蝦良種養(yǎng)殖場(chǎng), 體長(zhǎng)12.22 cm±0.56 cm, 體質(zhì)量38.95 g±5.02 g, 養(yǎng)殖溫度27~28℃。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 精子的獲取

    解剖對(duì)蝦, 切斷腹神經(jīng)索, 使雄蝦不能彈跳, 以便操作, 將頭胸部與腹部分開, 切斷貯精囊與生殖孔的聯(lián)系, 取出貯精囊, 輕輕擠壓使精莢露出, 用鑷子夾住精莢扇狀體與豆?fàn)铙w的聯(lián)結(jié)處, 將精莢取出[8]。將單個(gè)精莢放入500 μL天然海水, 將精莢剪碎后用研磨棒進(jìn)行研磨, 300目篩網(wǎng)進(jìn)行過濾, 濾出后精子懸液備用。

    1.2.2 超低溫冷凍保存條件的篩選

    選取3種不同的稀釋液(天然海水、無(wú)鈣人工海水和HBSS(Hank's平衡鹽溶液)), 3種不同的抗凍劑(二甲基亞砜(DMSO)、丙二醇(PG)和丙三醇(GLY), DMSO購(gòu)自SIGMA公司, 其他藥品均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)配成3個(gè)不同的濃度(5%, 10%, 15%), 提前1 d置于4℃冰箱預(yù)冷過夜。將過濾后的精子懸濁液與冷凍保護(hù)劑1︰1混合, 每個(gè)樣品取10 μL顯微鏡下觀察并計(jì)算活精子個(gè)數(shù), 放入500 μL的麥管(IMV, L’Aigle, France)中, 4℃放置30 min, 放入程序降溫儀(Kyro360-1.7)運(yùn)行表1(A-1、A-2和A-3)的程序進(jìn)行程序降溫, 之后將樣品投入液氮。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)平行, 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    表1 冷凍降溫程序

    冷凍保存30日后, 37℃解凍, 臺(tái)盼藍(lán)染色觀察其存活個(gè)數(shù)。每個(gè)樣品統(tǒng)計(jì)3個(gè)視野中存活個(gè)數(shù)總值, 統(tǒng)計(jì)活精子個(gè)數(shù)與冷凍前進(jìn)行比較計(jì)算其存活率, 3個(gè)平行樣品間取平均值對(duì)對(duì)蝦精子的超低溫冷凍保存不同條件進(jìn)行比較。

    1.3 日本囊對(duì)蝦和中國(guó)明對(duì)蝦的超微結(jié)構(gòu)觀察

    透射電鏡(transmission electron microscopy, TEM)觀察: 取機(jī)械勻漿法得到的對(duì)蝦精子, 用2.5%戊二醛(0.2mol/L, pH=7.4, 磷酸緩沖液配制)進(jìn)行前固定, 然后用1%鋨酸(4℃)固定2h, 梯度酒精脫水, 然后用Epon-812滲透包埋, 超薄切片機(jī)切片, 經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色后透射電鏡(日立H-7000)下觀察、拍照。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用 SPSS17.0 軟件進(jìn)行單因素方差(One-Way ANOVA)分析, 結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異顯著性采用Duncan法進(jìn)行多重比較(=0.05)。

    2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    2.1 精莢及凍存前后精子形態(tài)結(jié)構(gòu)的比較

    圖1為對(duì)蝦形態(tài)圖, 3種對(duì)蝦精子大小形狀相似, 南美白對(duì)蝦精子(圖1-1)略大于中國(guó)明對(duì)蝦(圖1-2), 直徑約為4 μm, 中國(guó)明對(duì)蝦精子略小, 直徑約3 μm, 日本囊對(duì)蝦(圖1-3)精子大小與南美白對(duì)蝦精子大小相當(dāng), 直徑約為4 μm。所得的游離成熟精子在10×100倍油鏡下觀察主體部呈圓球狀, 帶有明顯的棘突, 無(wú)鞭毛, 不運(yùn)動(dòng)。圖2為日本囊對(duì)蝦(圖2-1)和中國(guó)明對(duì)蝦(圖2-2)投射電鏡圖, 由圖2可見日本囊對(duì)蝦和中國(guó)明對(duì)蝦精子整體形態(tài)相似, 呈橢圓形, 都有單一棘突, 并與頂體相連。

    2.2 冷凍降溫程序的確定

    以10%DMSO為抗凍劑, 天然海水為稀釋液, 運(yùn)行3種降溫程序, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2, 運(yùn)行A-1降溫程序進(jìn)行冷凍保存, 解凍后存活率最高, 3種對(duì)蝦凍精存活率分別為: 43.11%±6.88%(日本囊對(duì)蝦)、33.35%± 6.51%(中國(guó)明對(duì)蝦)、11.02%±1.12%(南美白對(duì)蝦)。

    圖1 冷凍保存前后對(duì)蝦精子形態(tài)

    1-1. 南美白對(duì)蝦活精子; 1-2. 中國(guó)明對(duì)蝦活精子; 1-3. 日本囊對(duì)蝦活精子; 1-4. 日本囊對(duì)蝦凍精解凍后形態(tài); a. 活精子; b. 死精子

    1-1. live sperm of; 1-2. live sperm of; 1-3. live sperm of; 1-4. frozen sperm of; a. live sperm; b. a dead sperm

    圖2 日本囊對(duì)蝦和中國(guó)明對(duì)蝦透射電鏡結(jié)果

    2-1. 日本囊對(duì)蝦精子; 2-2. 中國(guó)明對(duì)蝦精子; s. 棘突; ac. 頂體; sr. 亞頂體; n. 細(xì)胞核; ct. 細(xì)胞質(zhì)

    2-1.sperm; 2-2.sperm; s. spike; ac. acrosomal cap; sr. subacrosomal region; n. nucleus; ct. cytoplasm

    表2 各個(gè)降溫程序下存活率

    同行數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(<0.05)

    2.3 稀釋液和抗凍劑對(duì)日本囊對(duì)蝦精子冷凍保存影響

    以10%DMSO作為抗凍劑, 不同稀釋液下運(yùn)行A-1降溫程序冷凍后日本囊對(duì)蝦精子存活率見圖3。由圖3可知, 以10%DMSO作為抗凍劑、稀釋液為天然海水時(shí)凍精解凍存活率最高, 顯著高于其他處理組(<0.05), 存活率為61.56%±4.23%, 無(wú)鈣人工海水次之, 存活率為54.67%±5.22%, HBSS的效果最差, 存活率為15.00%±3.00%。

    圖3 不同稀釋液對(duì)日本囊對(duì)蝦精子冷凍后存活率的影響

    數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(<0.05), 圖4-圖8同

    Different lowercase letters indicate significant difference (<0.05), the same as fig.4-fig.8

    以天然海水作為稀釋液, 不同抗凍劑下運(yùn)行A-1降溫程序冷凍后日本囊對(duì)蝦精子存活率見由圖4。由圖4可知, 稀釋液為天然海水時(shí), 使用10%PG作為抗凍劑時(shí)凍精解凍存活率最高, 為75.33%± 2.56%, 顯著高于其他處理組(<0.05), 使用GLY和DMSO時(shí)抗凍劑時(shí)次之, 兩者之間差異不顯著(>0.05), 15%PG、5%GLY、10%GLY和5%DMSO組解凍后精子存活率不足20%, 顯著低于其他處理組(<0.05)。

    圖4 不同抗凍劑對(duì)日本囊對(duì)蝦精子冷凍后存活率的影響

    2.4 稀釋液和抗凍劑對(duì)中國(guó)明對(duì)蝦冷凍保存的影響

    以10%DMSO作為抗凍劑, 不同稀釋液下運(yùn)行A-1降溫程序冷凍后中國(guó)明對(duì)蝦精子存活率見圖5。由圖5可知, 在用10%DMSO作為抗凍劑, 稀釋液為天然海水時(shí)凍精解凍存活率最高, 顯著高于其他組(<0.05), 解凍后存活率為61.56%±3.67%, 無(wú)鈣人工海水次之, 存活率為39.67%±1.33%, HBSS的效果最差, 存活率為14.67%±5.00%。

    圖5 不同稀釋液對(duì)中國(guó)明對(duì)蝦精子冷凍后存活率的影響

    以天然海水作為稀釋液, 不同抗凍劑下運(yùn)行A-1降溫程序冷凍后中國(guó)明對(duì)蝦精子存活率見圖6。由圖6可知, 在使用天然海水作為稀釋液, 10%PG和10%DMSO組作為抗凍劑時(shí)凍精解凍存活率顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組(<0.05), 其中, 10%PG組凍精解凍后存活率最高, 為69.00%±3.00%, 其次為10%DMSO, 3種不同濃度DMSO差異不顯著, 5%GLY組作為抗凍劑凍精解凍存活率最低, 顯著低于其他處理組(<0.05)。

    圖6 不同抗凍劑對(duì)中國(guó)明對(duì)蝦精子冷凍后存活率的影響

    2.5 南美白對(duì)蝦冷凍保存稀釋液和抗凍劑的確定

    以10%DMSO作為抗凍劑, 不同稀釋液下運(yùn)行A-1降溫程序冷凍后南美白對(duì)蝦精子存活率見圖7。由圖7可知, 在使用10%DMSO作為抗凍劑時(shí), 稀釋液為天然海水時(shí)凍精解凍存活率最高, 顯著高于其他處理組(<0.05), 為12.33%±3.67%, 無(wú)鈣人工海水次之, 為10.20%±3.00%, HBSS的效果最差, 存活率僅為3.60%±2.33%。

    圖7 不同稀釋液對(duì)南美白對(duì)蝦精子冷凍后存活率的影響

    以天然海水作為稀釋液, 不同抗凍劑下運(yùn)行A-1降溫程序冷凍后南美白對(duì)蝦精子存活率見圖8。由圖8可知, 在使用天然作為稀釋液, 10%PG作為抗凍劑的凍精解凍存活率最高, 顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組(<0.05), 為23.33%±8.55%, 5%PG、10%GLY、15%GLY、5%DMSO和10%DMSO作為抗凍劑時(shí)差異不顯著(>0.05), 凍精解凍存活率低于20%, 15%PG組凍精解凍后存活率顯著低于其他處理組(<0.05), 僅不足5%。

    圖8 不同抗凍劑對(duì)南美白對(duì)蝦精子冷凍后存活率的影響

    3 討論

    3.1 對(duì)蝦精子的獲取

    對(duì)蝦的精子與魚類、貝類等不同, 它的精子儲(chǔ)存在精莢中, 而魚類、貝類精子在性腺中成熟, 可以通過擠壓、解剖等方法較為方便地獲得成熟的性腺。精莢是十足類動(dòng)物所具有的一種特殊結(jié)構(gòu), 成對(duì)存在并貯存在精囊中, 每側(cè)各1個(gè), 其發(fā)育程度直接影響卵子的受精率和人工育苗的產(chǎn)量, 在對(duì)蝦受精前, 精莢具有傳輸和保護(hù)精子的雙重作用。一般由精子、精莢基質(zhì)、精莢壁3部分構(gòu)成[9]。形態(tài)各異, 主要有3種類型: 柄狀(異尾類)、管狀 (長(zhǎng)尾類)、球形或圓形(短尾類)。而中國(guó)明對(duì)蝦和日本囊對(duì)蝦的精莢形態(tài)都為柄狀。在之前的研究中, 對(duì)蝦精子的獲取有用胰蛋白酶進(jìn)行消化, 但是, 在實(shí)際的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)用胰蛋白酶進(jìn)行消化不能很好地控制消化的時(shí)間, 因此采用機(jī)械勻漿法進(jìn)行研磨來(lái)獲取精子。

    甲殼動(dòng)物精子多種多樣, 其中須蝦亞綱(Mysta-cocaride)、蔓足亞綱(Cirripedia)、鰓尾亞綱(Branchiura) 等3個(gè)亞綱的精子具鞭毛, 能運(yùn)動(dòng), 其他5個(gè)亞綱的精子形狀各異, 沒有中間體和鞭毛[10]。十足類動(dòng)物的精子與其他較高等動(dòng)物的精子比較有很大的不同, 缺少鞭毛, 核松散, 不運(yùn)動(dòng), 依據(jù)形態(tài)分兩類: (1) 從中央體部散發(fā)出若干棘突的精子, 如爬行目的蟹(Brachyura)、龍蝦(Palinuridae)和螯蝦(); (2)具有單一棘突的精子, 如游泳亞目的各種蝦類。而所有種類的對(duì)蝦都屬于游泳亞目, 據(jù)有單一棘突, 其內(nèi)部結(jié)構(gòu)分為棘突、中間部和主體部, 沒有鞭毛, 不主動(dòng)運(yùn)動(dòng)。

    3.2 對(duì)蝦精子活力的評(píng)價(jià)方法研究

    十足目(Decapoda)精子的棘突對(duì)于精子在卵的定位和刺穿次序是必需的。而其他魚類和貝類精子由于有鞭毛, 可以通過精子運(yùn)動(dòng)情況直接觀察精子活力狀況。由于對(duì)蝦精子沒有鞭毛, 不能自由地游動(dòng)[11]。因此, 對(duì)蝦精子的質(zhì)量評(píng)價(jià)主要通過生物染色劑染色和精卵相互作用這兩種方法進(jìn)行, 由于對(duì)蝦同一時(shí)期的未受精卵難以大量獲得, 因此, 生物染色的方法是主要對(duì)對(duì)蝦精子活力評(píng)價(jià)的方法[12-13]。生物染色主要使用的染色劑有臺(tái)盼藍(lán)、伊紅-苯胺黑, 實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)用臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)行染色效果要比其他的要好, 但是在染色過程中, 有些精子的棘突消失但是仍能不被臺(tái)盼藍(lán)染色, 但實(shí)際由于精子的棘突消失, 精子本身已經(jīng)沒有了受精能力。因此, 染料排斥實(shí)驗(yàn)只能作為一種粗略的估計(jì)精子活力的方法, 但是作為篩選對(duì)蝦超低溫冷凍保存方法的技術(shù), 生物染色方法確實(shí)可行。但現(xiàn)在對(duì)于對(duì)蝦精子活力的準(zhǔn)確測(cè)定只能通過精卵相互作用這一方法, 由于對(duì)蝦相同發(fā)育時(shí)期的卵獲取難度大, 因此此方法難以實(shí)現(xiàn)。

    3.3 稀釋液和抗凍劑的篩選

    稀釋的天然或人工海水已被廣泛地用于十足目甲殼動(dòng)物精子冷凍的研究中??聛喎虻萚4]研究表明, 中國(guó)明對(duì)蝦精子冷凍稀釋液中, Ca2+、Mg2+、K+為必需, 其中Ca2+不能超過0.7 mol/dm3; Bhabvanishankar[13]發(fā)現(xiàn)海水和無(wú)鈣人工海水均可作為精子冷凍稀釋液; 陳東華等[14]研究證實(shí), Na+、K+是魚類血漿、精漿的重要組分和構(gòu)成滲透壓的主要離子, Na+有促進(jìn)精子活動(dòng)的作用, 而適當(dāng)?shù)腒+濃度可延長(zhǎng)精子壽命??聛喎虻萚4]對(duì)中國(guó)明對(duì)蝦精子冷凍保存進(jìn)行研究, 發(fā)現(xiàn)稀釋液為天然海水時(shí)效果最好; 而廖馨等[15]、浦蘊(yùn)惠等[7]實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)使用壬氏液作為稀釋液對(duì)青蝦, 脊尾白蝦精子冷凍保存效果最好, 使用DMSO作為抗凍劑時(shí)凍精解凍存活率最高, 本研究結(jié)果對(duì)于3種不同的對(duì)蝦而言, 10%PG作為抗凍劑、天然海水作為稀釋液, 運(yùn)行A-1程序進(jìn)行冷凍保存, 解凍后存活率最高。

    雖然本實(shí)驗(yàn)成功篩選出了3種對(duì)蝦精子超低溫冷凍保存的最適方法, 但是對(duì)于對(duì)蝦精子解凍后的存活率統(tǒng)計(jì)上還是略有不足。對(duì)于對(duì)蝦精子存活率的統(tǒng)計(jì), 通過人工授精的方法更為可靠, 而且本實(shí)驗(yàn)只是對(duì)對(duì)蝦精子冷凍保存的方法進(jìn)行了一個(gè)初步的篩選, 并沒有進(jìn)行有關(guān)添加劑對(duì)于冷凍保存效果的討論, 希望在以后的研究中能夠進(jìn)一步進(jìn)行探討。

    [1] 李純, 李軍, 薛欽昭. 海洋生物種質(zhì)細(xì)胞低溫保存與機(jī)理[J]. 海洋科學(xué), 2000, 24(4): 12-15. Li Chun, Li Jun, Xue Qinzhao. Cryopreservation of germ cells of marine organisms and its mechanism[J]. Marine Sciences, 2000, 24(4): 12-15.

    [2] 李喜龍, 季維智. 動(dòng)物種質(zhì)細(xì)胞的超低溫冷凍保存[J].動(dòng)物學(xué)研究, 2000, 21(5): 407-411. Li Xilong, Ji Weizhi. Cryopreservation of animal germplasm cells[J]. Zoological Studies, 2000, 21(5): 407-411.

    [3] Abdelmoneimi Y, Beth R, Saba K, et al. The effects of antifreeze peptideⅢ (AFP)and insulin transferrin selenium (ITS) on cryopreservation ofchimpanzee () spermatozoa[J]. J Androl, 1998, 19: 207.

    [4] 柯亞夫, 蔡難兒. 中國(guó)對(duì)蝦精子超低溫保存的研究[J]. 海洋與湖沼, 1996, 27(2): 187-193. Ke Yafu, Cai Nan’er. Cryopreservation of spermatozoa from the marine shrimp penaeus chinensis[J]. Oceano-logia Et Limnologia Sinica, 1996, 27(2): 187-193.

    [5] 蔡難兒, 林峰, 陳本楠, 等. 中國(guó)對(duì)蝦受精生物學(xué)的研究[J]. 海洋與湖沼, 1997, 28(3): 271-277. Cai Nan’er, Lin Feng, Chen Bennan, et al. Biology of fertilization in[J]. Oceanologia Et Limnologia Sinica, 1997, 28(3): 271-277.

    [6] Vuthiphandchai V, Nimrat S, Kotcharat S, et al. Development of a cryopreservation protocol for long-term storage of black tiger shrimp () sper-ma-tophores[J]. Theriogenology, 2007, 68(8): 1192-1199.

    [7] 浦蘊(yùn)惠, 許星鴻, 高煥, 等. 脊尾白蝦精子體外保存的研究[J]. 海洋科學(xué), 2013, 37(3): 95-101. Pu Yunhui, Xu Xinghong, Gao Huan, et al. Study on in vitro preservation of spermatozoa of[J]. Marine Sciences, 2013, 37(3): 95-101.

    [8] Anchordoguy T, Crowe J H, Griffin F J, et al. Cryopreservation of sperm from the marine shrimp[J]. Cryobiology, 1988, 25(3): 238-243.

    [9] Aungsuchawan S, Browdy C L, Withyachumnarnkul B. Sperm capacitation of the shrimp[J]. Aquaculture Research, 2011, 42(2): 188-195.

    [10] Pochon-Masson J. Spermatogenesis and sperm function (Vol.II, )[M]. New York: Wiley, 1983: 107-449.

    [11] Jeyalectumie C, Subramoniam T. Cryopreservation of spermatophores and seminal plasma of the edible crab[J]. Biol Bull, 1989, 177: 247-253.

    [12] Bray W A, Lawrence A L. Male viability determinations in: evaluation of short-term storage of spermatophores up to 36h and comparison of Ca2+-free saline and seawater as sperm homogenate media[J]. Aquaculture, 1998, 160: 63-67.

    [13] Bhabvanishankar S, Subramoniam T. Cryopreservation of spermatozoa of the edible mud crab(Forska)[J]. J Exp Zool, 1997, 277: 326-336.

    [14] 陳東華, 李艷東, 賈林芝, 等. 冷凍保護(hù)劑及預(yù)冷時(shí)間對(duì)河蟹精子體外冷凍保存的影響[J]. 水生生物學(xué)報(bào), 2008, 4: 579-585. Chen Donghua, Li Yandong, Jia Linzhi, et al. Cryopreservation of eriocheir sinensis sperms (in vitro) with different cryoprotective solutions and prefreezing time[J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2008, 4: 579-585.

    [15] 廖馨, 葛家春, 丁淑燕, 等.青蝦精子超低溫冷凍保存技術(shù)的研究[J]. 南京大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)), 2008, 44(4): 421-426. Liao Xin, Ge Jiachun, Ding Shuyan, et al. Study on cryopreservation of the sperm of freshwater prawn[J]. Journal of Nanjing University (natural science), 2008, 44(4): 421-426.

    (本文編輯: 譚雪靜)

    Cryopreservation of spermatozoa of three prawn species

    WANG Wen-qi1, YANG Jing-kun1, XU Shi-hong2, 3, LIU Qing-hua2, 3, LI Jun2, 3

    (1.Marine Science and Engineer College, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China; 2. Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 3 Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266237, China)

    This study was conducted to examine the cryoprotective effects of three extenders (natural seawater, calcium-free saline, and Hank’s balanced salt solution), three cryoprotectants (DMSO, propylene glycol, and glycerol) at different concentrations and three dilution ratios (5%, 10%, and 15%), and three cooling procedures on the cryopreservation of sperms of three types of shrimp, Kuruma prawn,, and. The survival rates of post-thawed sperms were calculated by trypan blue staining, and the cryopreservation procedures of the three shrimps were screened. Successful cryopreservation of sperms of these three shrimps in liquid nitrogen was achieved using sterilized natural seawater containing 10% propylene glycol with A-1 procedure, with the survival rates being 75.33% ± 2.56%, 69.00% ± 3.00%, and 23.33% ± 8.55%, respectively.

    ;;; cryopreservation; spermatozoa; survival rate

    Oct. 24, 2016

    王文琪(1969-), 女, 山東萊陽(yáng)人, 博士, 教授, 主要從事海洋生物養(yǎng)殖生態(tài)方面的研究, 電話: 13730901370, E-mail: wenqi31@163.com; 李軍,

    , 電話: 13506482136, E-mail: junli@qdio.ac.cn

    S917.4

    A

    1000-3096(2017)09-0081-06

    10.11759//hykx20161024003

    2016-10-24;

    2017-05-24

    山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系蝦蟹創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(SDAIT-13); 農(nóng)業(yè)部948項(xiàng)目(2015-Z59); 鰲山科技創(chuàng)新計(jì)劃資助項(xiàng)目(2015ASKJ02, 2015ASKJ02-03-033); 海洋藥源生物種質(zhì)資源庫(kù)建設(shè)項(xiàng)目(12PYY001SF08)

    [Shandong Province’s Innovation Team of Modern Agricultural Technology System, No. SDAIT-13; Ministry of Agriculture 948 Project, No.2015-Z59; Aoshan Science and Technology Innovation Plan, No.2015ASKJ02, 2015ASKJ0203-033; Marine Economy Innovative Development Project, No. 12PYY001SF08]

    猜你喜歡
    超低溫白對(duì)蝦抗凍
    果上豐:神奇的抗凍衛(wèi)士
    高密度養(yǎng)殖南美白對(duì)蝦或者更容易成功
    不同超低溫及其再回至常溫時(shí)混凝土受壓強(qiáng)度試驗(yàn)研究*
    畜禽防寒抗凍及凍后應(yīng)急管理
    人體六部位最不抗凍
    海峽姐妹(2020年1期)2020-03-03 13:36:02
    南美白對(duì)蝦大棚高效養(yǎng)殖技術(shù)
    內(nèi)噴式超低溫加工機(jī)床的溫度場(chǎng)仿真分析
    淺淡引氣劑在抗凍混凝土中的應(yīng)用
    南美白對(duì)蝦2016年春季生產(chǎn)形勢(shì)
    麻省理工學(xué)院創(chuàng)造超低溫紀(jì)錄
    美女 人体艺术 gogo| 给我免费播放毛片高清在线观看| 亚洲五月婷婷丁香| 国产精品久久视频播放| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 久久久国产精品麻豆| 亚洲,欧美精品.| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 国产一区在线观看成人免费| 国产男靠女视频免费网站| 国内精品美女久久久久久| 在线观看舔阴道视频| 国产精品1区2区在线观看.| 啦啦啦免费观看视频1| 黄色视频,在线免费观看| 可以在线观看的亚洲视频| 国产在线精品亚洲第一网站| 动漫黄色视频在线观看| 老汉色av国产亚洲站长工具| 可以在线观看的亚洲视频| 看免费av毛片| 成人av一区二区三区在线看| 国产欧美日韩精品亚洲av| 久久九九热精品免费| 级片在线观看| 欧美日韩黄片免| 高清在线国产一区| 91九色精品人成在线观看| ponron亚洲| 久久精品影院6| 给我免费播放毛片高清在线观看| 欧美最黄视频在线播放免费| 大型黄色视频在线免费观看| 色综合亚洲欧美另类图片| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 十八禁网站免费在线| 啪啪无遮挡十八禁网站| 午夜福利成人在线免费观看| 在线a可以看的网站| 草草在线视频免费看| 色播亚洲综合网| 99久久综合精品五月天人人| av福利片在线观看| 香蕉av资源在线| 欧美成人一区二区免费高清观看 | av国产免费在线观看| 欧美日韩乱码在线| 91麻豆av在线| 国产精品一区二区精品视频观看| 国产私拍福利视频在线观看| 男人和女人高潮做爰伦理| 亚洲av成人精品一区久久| 精品国产亚洲在线| 88av欧美| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 一个人免费在线观看电影 | 国产91精品成人一区二区三区| 在线观看午夜福利视频| xxx96com| 国产一区二区三区视频了| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 婷婷丁香在线五月| 免费av不卡在线播放| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 亚洲国产欧美一区二区综合| 亚洲av成人精品一区久久| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲精品美女久久av网站| 午夜精品久久久久久毛片777| 日日夜夜操网爽| 一进一出抽搐gif免费好疼| 国产成人福利小说| 久久久国产成人精品二区| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产精品久久久av美女十八| 69av精品久久久久久| 日韩欧美在线二视频| 亚洲专区国产一区二区| 久久中文看片网| 美女cb高潮喷水在线观看 | 少妇裸体淫交视频免费看高清| 美女高潮的动态| 少妇熟女aⅴ在线视频| avwww免费| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 亚洲第一电影网av| 麻豆久久精品国产亚洲av| 国产精品九九99| 午夜激情欧美在线| 婷婷亚洲欧美| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 欧美日韩一级在线毛片| 国产熟女xx| 一级a爱片免费观看的视频| 岛国在线免费视频观看| 久久国产精品人妻蜜桃| av在线蜜桃| 成人特级av手机在线观看| 欧美色欧美亚洲另类二区| 欧美乱色亚洲激情| 国产一区二区在线观看日韩 | 欧美色视频一区免费| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 12—13女人毛片做爰片一| 露出奶头的视频| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 嫁个100分男人电影在线观看| 日韩大尺度精品在线看网址| 我的老师免费观看完整版| av天堂在线播放| 国产真人三级小视频在线观看| 1000部很黄的大片| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 香蕉丝袜av| 桃红色精品国产亚洲av| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 国产激情欧美一区二区| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 国产野战对白在线观看| 床上黄色一级片| 日本 欧美在线| 精品日产1卡2卡| 99久久综合精品五月天人人| 99热这里只有是精品50| 日韩国内少妇激情av| 欧美+亚洲+日韩+国产| 黄色视频,在线免费观看| 色综合欧美亚洲国产小说| 久久国产精品影院| 十八禁网站免费在线| 亚洲人成伊人成综合网2020| 特级一级黄色大片| 欧美午夜高清在线| 很黄的视频免费| 天天一区二区日本电影三级| 国产精品久久久久久精品电影| 后天国语完整版免费观看| 亚洲国产欧美网| 18禁黄网站禁片免费观看直播| www.www免费av| 可以在线观看毛片的网站| 午夜影院日韩av| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 日本一本二区三区精品| 日本与韩国留学比较| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 久久久久久久久免费视频了| 午夜免费成人在线视频| 99riav亚洲国产免费| 亚洲无线在线观看| 少妇的丰满在线观看| 亚洲av五月六月丁香网| 国产成年人精品一区二区| 久久这里只有精品19| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产私拍福利视频在线观看| aaaaa片日本免费| 精品福利观看| 一个人免费在线观看的高清视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产精品综合久久久久久久免费| 啪啪无遮挡十八禁网站| 久久精品国产综合久久久| 日本 av在线| 久久久国产成人免费| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 亚洲激情在线av| 熟女人妻精品中文字幕| 免费av不卡在线播放| 麻豆国产97在线/欧美| 国产亚洲欧美98| av天堂中文字幕网| 叶爱在线成人免费视频播放| 精品国产乱子伦一区二区三区| 日本与韩国留学比较| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产亚洲精品av在线| 国产精品av视频在线免费观看| 午夜精品久久久久久毛片777| 天天一区二区日本电影三级| 亚洲无线在线观看| 午夜久久久久精精品| 午夜福利在线在线| 最近最新免费中文字幕在线| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 欧美在线黄色| 午夜精品久久久久久毛片777| 日本熟妇午夜| 亚洲av免费在线观看| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 黄色成人免费大全| 俄罗斯特黄特色一大片| 精品久久久久久久久久免费视频| 男女下面进入的视频免费午夜| 两性夫妻黄色片| 国产免费男女视频| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 91麻豆av在线| 精品人妻1区二区| 中亚洲国语对白在线视频| 真人做人爱边吃奶动态| 久久精品国产清高在天天线| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产一区二区三区视频了| 精品免费久久久久久久清纯| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 久久久久久久久久黄片| 校园春色视频在线观看| 一区二区三区高清视频在线| 色播亚洲综合网| 麻豆一二三区av精品| 国产伦精品一区二区三区视频9 | 法律面前人人平等表现在哪些方面| 精品电影一区二区在线| 啪啪无遮挡十八禁网站| 欧美乱色亚洲激情| 一个人免费在线观看的高清视频| 天堂影院成人在线观看| 少妇丰满av| 亚洲人与动物交配视频| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 日韩精品青青久久久久久| 中亚洲国语对白在线视频| 亚洲av成人一区二区三| 一二三四社区在线视频社区8| 成熟少妇高潮喷水视频| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 久久久久久久午夜电影| 久久热在线av| 国内揄拍国产精品人妻在线| 狂野欧美激情性xxxx| 身体一侧抽搐| 久久久久久久精品吃奶| 亚洲成av人片在线播放无| 日韩欧美三级三区| 在线播放国产精品三级| 99re在线观看精品视频| av片东京热男人的天堂| 久久精品人妻少妇| 一本一本综合久久| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 亚洲七黄色美女视频| 成人一区二区视频在线观看| 国产精品久久久久久精品电影| 亚洲一区高清亚洲精品| 日韩精品青青久久久久久| 一本久久中文字幕| 中文字幕av在线有码专区| www.自偷自拍.com| 欧美黄色片欧美黄色片| 精品免费久久久久久久清纯| 免费在线观看亚洲国产| 国产高清三级在线| 黄色成人免费大全| 一个人免费在线观看的高清视频| 久久国产精品人妻蜜桃| 久久天堂一区二区三区四区| 日本三级黄在线观看| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 午夜激情福利司机影院| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 久久久国产欧美日韩av| 一进一出抽搐动态| 三级国产精品欧美在线观看 | 人妻夜夜爽99麻豆av| 嫩草影院入口| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 听说在线观看完整版免费高清| 精品一区二区三区av网在线观看| 久久天堂一区二区三区四区| 成人18禁在线播放| 在线观看一区二区三区| 免费看日本二区| 97碰自拍视频| bbb黄色大片| 日韩中文字幕欧美一区二区| 一边摸一边抽搐一进一小说| 免费av不卡在线播放| 精品免费久久久久久久清纯| 欧美乱色亚洲激情| 久久久国产精品麻豆| 欧美一级a爱片免费观看看| 婷婷六月久久综合丁香| 亚洲男人的天堂狠狠| 日本与韩国留学比较| 在线观看日韩欧美| 国产高清视频在线播放一区| 毛片女人毛片| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 国产黄色小视频在线观看| 99热精品在线国产| 久久久久久久久久黄片| 亚洲第一电影网av| 精品国产美女av久久久久小说| 欧美一级毛片孕妇| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲欧美激情综合另类| 精品人妻1区二区| 国产成人aa在线观看| 国产99白浆流出| 中亚洲国语对白在线视频| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 久久久精品欧美日韩精品| 一级毛片精品| 亚洲国产欧美人成| 看免费av毛片| 热99在线观看视频| 婷婷丁香在线五月| 少妇丰满av| 久久久久国产一级毛片高清牌| av中文乱码字幕在线| 国产麻豆成人av免费视频| 悠悠久久av| 国产成人影院久久av| 国产乱人伦免费视频| av视频在线观看入口| 欧美乱色亚洲激情| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 不卡av一区二区三区| 成在线人永久免费视频| 中文字幕高清在线视频| 国产午夜精品久久久久久| 亚洲在线自拍视频| 热99在线观看视频| 黄色丝袜av网址大全| 日本 av在线| 亚洲av电影不卡..在线观看| 欧美av亚洲av综合av国产av| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产三级在线视频| 在线看三级毛片| 国产三级中文精品| 精品一区二区三区四区五区乱码| 国产爱豆传媒在线观看| 日韩有码中文字幕| 国产爱豆传媒在线观看| 久99久视频精品免费| 麻豆久久精品国产亚洲av| 毛片女人毛片| 国产高清视频在线播放一区| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 欧美一区二区精品小视频在线| 亚洲成av人片免费观看| 国产一级毛片七仙女欲春2| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 一二三四在线观看免费中文在| 欧美黑人巨大hd| 成人国产综合亚洲| 国产成人精品无人区| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 日本a在线网址| 日韩国内少妇激情av| 一个人免费在线观看电影 | 国产成人影院久久av| 欧美日韩综合久久久久久 | 日韩精品中文字幕看吧| av视频在线观看入口| 亚洲国产精品合色在线| 99久久无色码亚洲精品果冻| 精品福利观看| 久久久久国内视频| 国产视频一区二区在线看| 18美女黄网站色大片免费观看| 在线观看66精品国产| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 精品福利观看| 久久久久国内视频| 日本黄大片高清| 毛片女人毛片| 成人av一区二区三区在线看| 精品无人区乱码1区二区| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 精品一区二区三区四区五区乱码| 最好的美女福利视频网| 欧美丝袜亚洲另类 | 蜜桃久久精品国产亚洲av| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 精品久久久久久成人av| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 一进一出好大好爽视频| 亚洲在线自拍视频| 国产精品九九99| 国产成人精品久久二区二区免费| 黄色视频,在线免费观看| 一本综合久久免费| 精品免费久久久久久久清纯| 欧美日韩精品网址| 午夜免费激情av| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 男人和女人高潮做爰伦理| 成人av一区二区三区在线看| 在线免费观看不下载黄p国产 | www.熟女人妻精品国产| 色吧在线观看| 99精品在免费线老司机午夜| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 亚洲成av人片在线播放无| 91av网站免费观看| 老司机在亚洲福利影院| 午夜福利在线观看吧| 国产精品久久久久久久电影 | 99精品在免费线老司机午夜| 露出奶头的视频| 国产精品亚洲美女久久久| 岛国在线免费视频观看| 久久国产精品影院| 最近在线观看免费完整版| 久久久久久人人人人人| 久久久久性生活片| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产成人啪精品午夜网站| av欧美777| 最新美女视频免费是黄的| 波多野结衣高清作品| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 天天一区二区日本电影三级| 一边摸一边抽搐一进一小说| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 人人妻人人澡欧美一区二区| 精品久久久久久成人av| 国产成年人精品一区二区| 国产av麻豆久久久久久久| 一个人免费在线观看的高清视频| 亚洲国产精品合色在线| 十八禁人妻一区二区| 不卡一级毛片| 精品一区二区三区四区五区乱码| 五月伊人婷婷丁香| 中文字幕最新亚洲高清| 亚洲精品美女久久av网站| 亚洲国产欧美网| 日本a在线网址| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 麻豆国产av国片精品| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲欧美精品综合久久99| 九九久久精品国产亚洲av麻豆 | 亚洲美女黄片视频| 国产成人欧美在线观看| 欧美午夜高清在线| 看片在线看免费视频| 久久中文字幕人妻熟女| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 久9热在线精品视频| 波多野结衣高清无吗| 欧美一级毛片孕妇| 丰满人妻一区二区三区视频av | 超碰成人久久| 高清毛片免费观看视频网站| 午夜视频精品福利| 成年女人毛片免费观看观看9| 久久99热这里只有精品18| 高潮久久久久久久久久久不卡| 综合色av麻豆| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 这个男人来自地球电影免费观看| 日韩人妻高清精品专区| 99久久综合精品五月天人人| 久久久久久久久久黄片| 一区二区三区国产精品乱码| 日韩av在线大香蕉| 身体一侧抽搐| 欧美中文日本在线观看视频| 宅男免费午夜| 亚洲国产欧美网| 日韩av在线大香蕉| 不卡一级毛片| 性欧美人与动物交配| 婷婷六月久久综合丁香| 国产精品野战在线观看| 欧美激情在线99| 国产99白浆流出| 欧美色欧美亚洲另类二区| 日本 av在线| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 精品久久久久久久毛片微露脸| 激情在线观看视频在线高清| 国产淫片久久久久久久久 | 老司机深夜福利视频在线观看| 麻豆av在线久日| 12—13女人毛片做爰片一| 又爽又黄无遮挡网站| 午夜免费观看网址| 亚洲成av人片在线播放无| 久久亚洲真实| 日韩人妻高清精品专区| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 又大又爽又粗| 大型黄色视频在线免费观看| 精品久久久久久成人av| 亚洲精品粉嫩美女一区| 国产精品国产高清国产av| tocl精华| 欧美av亚洲av综合av国产av| 99热这里只有是精品50| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 亚洲avbb在线观看| 亚洲精品美女久久av网站| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 中国美女看黄片| 欧美+亚洲+日韩+国产| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 九色成人免费人妻av| 国产精品乱码一区二三区的特点| 男插女下体视频免费在线播放| 日本五十路高清| 亚洲国产精品久久男人天堂| 视频区欧美日本亚洲| 老司机在亚洲福利影院| bbb黄色大片| 国产一区在线观看成人免费| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 精品免费久久久久久久清纯| av在线蜜桃| 91麻豆av在线| 床上黄色一级片| 国产精品国产高清国产av| 麻豆成人午夜福利视频| 国产不卡一卡二| 中文字幕久久专区| 69av精品久久久久久| 一进一出抽搐gif免费好疼| 成人三级做爰电影| 国产精品九九99| 网址你懂的国产日韩在线| 国产美女午夜福利| 男人舔女人下体高潮全视频| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲九九香蕉| 757午夜福利合集在线观看| 国产三级黄色录像| 久久精品91无色码中文字幕| 欧美日韩国产亚洲二区| 我要搜黄色片| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 18禁美女被吸乳视频| 九九在线视频观看精品| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 久久久久亚洲av毛片大全| 免费看日本二区| 色综合亚洲欧美另类图片| 一级毛片女人18水好多| 天堂动漫精品| www国产在线视频色| 男女下面进入的视频免费午夜| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 色综合站精品国产| 国产在线精品亚洲第一网站| 欧美黑人欧美精品刺激| 美女被艹到高潮喷水动态| 久久久国产精品麻豆| 人人妻人人看人人澡| 舔av片在线| 欧美不卡视频在线免费观看| 最近最新免费中文字幕在线| 亚洲成人免费电影在线观看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 午夜影院日韩av| 国产精品永久免费网站| 国产av不卡久久| 亚洲专区字幕在线| 欧美zozozo另类| 日本黄色视频三级网站网址| 成人性生交大片免费视频hd| 亚洲真实伦在线观看| 成熟少妇高潮喷水视频| 丰满人妻一区二区三区视频av | 国产精品久久视频播放| 国产一级毛片七仙女欲春2| 欧美日韩福利视频一区二区| 一二三四在线观看免费中文在| 免费观看的影片在线观看| 久久欧美精品欧美久久欧美| 校园春色视频在线观看| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 成人永久免费在线观看视频| 精品久久久久久久末码| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 狂野欧美激情性xxxx| 久久精品国产清高在天天线| 99国产精品99久久久久| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 又紧又爽又黄一区二区| 成人av在线播放网站| 村上凉子中文字幕在线| 伦理电影免费视频| 变态另类丝袜制服| 久久久久免费精品人妻一区二区| 日韩av在线大香蕉| 色哟哟哟哟哟哟| 美女高潮的动态| 久久久成人免费电影| 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 久久久国产成人免费| 男人舔女人的私密视频| 成人鲁丝片一二三区免费| 男人舔女人下体高潮全视频| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 岛国视频午夜一区免费看| 少妇的逼水好多| 免费人成视频x8x8入口观看|