基因治療肌腱韌帶損傷的研究進(jìn)展*

張國榮 張玫琦 胡金秋

肌腱韌帶再生能力較差，損傷后常由瘢痕組織代替，很難恢復(fù)其正常特性。傳統(tǒng)治療方法療效有限，基因治療作為一種生物醫(yī)學(xué)新技術(shù)越來越受到研究者的青睞。筆者就肌腱韌帶損傷修復(fù)相關(guān)因子、基因治療方法與應(yīng)用前景作一簡要綜述。

1 肌腱韌帶的結(jié)構(gòu)與損傷修復(fù)

肌腱與韌帶的結(jié)構(gòu)大致相同，主要由致密結(jié)締組織構(gòu)成。大量密集的膠原纖維順著受力方向平行排列成束。腱細(xì)胞很少，只占其體積的5%左右，散在分布于纖維之間。膠原纖維占組織干重的60%～85%，化學(xué)成分主要是膠原蛋白，其中以Ⅰ型為主，Ⅲ型和Ⅴ型含量較少。此外還含有少量彈性蛋白和蛋白聚糖[1]。這些基質(zhì)由腱細(xì)胞分泌并調(diào)節(jié)膠原纖維的聚合。

年齡增長、運動過度、外傷均可造成肌腱損傷。在美國每年約有20萬人患韌帶肌腱損傷疾病[2]。損傷肌腱的修復(fù)可以分為3個階段[3]：（1）炎性反應(yīng)：受損部位首先會出現(xiàn)血腫，炎性細(xì)胞聚集并釋放炎性因子，血管生成因子啟動血管生成。（2）細(xì)胞增殖、纖維組織形成：隨后炎性細(xì)胞逐漸減少，成纖維細(xì)胞開始合成膠原纖維等細(xì)胞外基質(zhì)，這一過程持續(xù)數(shù)周。（3）重塑與成熟：合成的膠原纖維沿肌腱長軸方向進(jìn)行組裝排列，逐漸填充修復(fù)受損部位，這一過程持續(xù)1年以上。經(jīng)過自然修復(fù)過程，損傷肌腱在結(jié)構(gòu)與功能上能夠獲得一定程度的修復(fù)，但與正常組織相比，其微觀結(jié)構(gòu)改變，力學(xué)性能低下，易造成重復(fù)斷裂。目前，對于肌腱韌帶損傷的治療主要是移植修復(fù)，移植的材料包括自體肌腱、同種異體肌腱和人工合成肌腱，這些方法有很多局限且效果不佳[4-5]?；蛑委熥鳛橐环N生物醫(yī)學(xué)新技術(shù)越來越受到肌腱韌帶損傷研究者的重視[6]。

2 與肌腱韌帶損傷修復(fù)有關(guān)的生長因子

當(dāng)肌腱韌帶損傷后，很多生長因子能夠釋放到損傷部位促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化和細(xì)胞間質(zhì)的分泌。如成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）、血小板相關(guān)生長因子BB（PDGF-BB）、胰島素樣生長因子（IGF）、表皮生長因子（EGF）、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）和生長分化因子（GDF）。有研究表明，在大鼠髕韌帶損傷部位注射重組的FGF，能夠促進(jìn)Ⅲ型膠原分泌和細(xì)胞增殖[7]。PDGF-BB能夠改善損傷肌腱修復(fù)后的力學(xué)性能[8]。但一次給藥可能造成局部PDGF-BB過高，定時多次給藥可以獲得較好效果[9]。IGF-1有抗炎和誘導(dǎo)上皮細(xì)胞生成的作用[10]。PDGF-BB、IGF-1和EGF都能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖。有研究表明，TGF-b1能夠促進(jìn)膠原纖維生成。與EGF聯(lián)合應(yīng)用可以顯著提高其治療效果[8]。在胚胎發(fā)育時期，雞肢體遠(yuǎn)側(cè)肌腱的生成也與其有關(guān)[11]。TGFb家族的調(diào)節(jié)因子Smad8也能夠促進(jìn)肌腱生成[12]。同時，GDF-5、6、7也與肌腱的形成有關(guān)。抑制大鼠的GDF-5、6基因表達(dá)能夠引起肌腱生長障礙[13-15]。在肌肉或皮下異位注射GDF-5、6、7可以促進(jìn)肌腱樣組織生成。總之，很多生長因子都影響肌腱的形成與損傷修復(fù)，但是給藥時間、方式與劑量還需進(jìn)一步優(yōu)化。

3 與肌腱韌帶損傷修復(fù)有關(guān)的細(xì)胞間質(zhì)

研究表明，肌腱韌帶的很多細(xì)胞間質(zhì)也參與其損傷修復(fù)。Ⅴ型膠原與核心蛋白聚糖（decorin）在正常肌腱韌帶中含量較少，但參與并影響Ⅰ型膠原的聚合過程[16]。體外研究發(fā)現(xiàn)過多的Ⅴ型膠原和decorin抑制了Ⅰ型膠原纖維的生長自聚。體內(nèi)動物實驗發(fā)現(xiàn)Ⅴ型膠原在損傷肌腱中持續(xù)高表達(dá)52周。decorin的表達(dá)也有所升高。同時損傷肌腱的膠原纖維直徑明顯變小。培養(yǎng)抑制了Ⅴ型膠原功能的纖維細(xì)胞（Ehlers-Danlos Syndrome），其所產(chǎn)生的Ⅰ型膠原纖維直徑大于正常膠原纖維[17]。這些研究顯示Ⅴ型膠原和decorin的多少或功能強弱直接影響Ⅰ型膠原纖維的直徑大小。而這些小直徑膠原纖維可能是導(dǎo)致?lián)p傷肌腱修復(fù)后力學(xué)性能低下的原因[18]。所以抑制損傷肌腱中Ⅴ型膠原和decorin的高表達(dá)可能有利于促進(jìn)大直徑膠原纖維的生成，提高損傷肌腱的修復(fù)效果。本研究組，通過培養(yǎng)體外組織工程肌腱，利用siRNA技術(shù)不同程度地抑制Ⅴ型膠原的表達(dá)，已經(jīng)獲得了含有較大直徑膠原纖維的人工肌腱[19-20]。

4 基因載體的種類與特性

如前所述，很多生長因子和細(xì)胞間質(zhì)參與肌腱韌帶的損傷修復(fù)。如何調(diào)控這些基因的表達(dá)，提高肌腱韌帶的修復(fù)效果是研究熱點。有治療作用的蛋白質(zhì)可以通過重組DNA技術(shù)獲得，但由于其半衰期較短，往往需要反復(fù)注射才能達(dá)到治療效果。所以利用基因調(diào)控技術(shù)，提高或降低靶細(xì)胞中某些基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)內(nèi)源性蛋白質(zhì)的合成與分泌，促進(jìn)肌腱韌帶損傷修復(fù)是一種更為可行的治療手段。

為了改變靶細(xì)胞中基因的表達(dá)，需將目的序列（DNA、反義核酸或siRNA等）包在載體中，由載體將其帶入靶細(xì)胞。DNA可以作為靶細(xì)胞中獨立的遺傳物質(zhì)或與其染色體進(jìn)行整合，被轉(zhuǎn)錄并翻譯出有治療作用的蛋白質(zhì)。反義核酸、siRNA等則可以干擾某些基因，降低在肌腱損傷過程中過表達(dá)的蛋白質(zhì)分子?；蜉d體分為非病毒載體和病毒載體[21-23]。非病毒載體有DNA基因槍、脂質(zhì)體等。他們毒性較小，操作簡單，很少產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)，但轉(zhuǎn)染能力較差，傳遞基因的效率不高。病毒載體常用的有腺病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、單純皰疹病毒等，它們傳遞基因的效率較高，且能夠持續(xù)穩(wěn)定地表達(dá)所需的蛋白質(zhì)。但易產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)，其安全性也有待進(jìn)一步控制和完善。當(dāng)前，病毒載體較多地應(yīng)用于各項基因治療研究中。脂質(zhì)體等也廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)移反義核酸和siRNA分子等[24]。

5 基因治療的優(yōu)缺點

基因治療有其自身的優(yōu)越性也存在較高風(fēng)險。其優(yōu)點主要有：（1）通過調(diào)節(jié)內(nèi)源性基因表達(dá)，可以在根本上治療某些基因缺陷疾病；（2）內(nèi)源性合成的蛋白比外源性重組蛋白生物活性更高；（3）可以在局部達(dá)到較高產(chǎn)物濃度，并持續(xù)較長時間?；蛑委煹娜秉c是其安全性有待完善和尚不能靈活控制。如攜帶基因的病毒是否會復(fù)制與活化；插入的基因是否會發(fā)生突變，造成細(xì)胞生長紊亂；目的蛋白過度表達(dá)或不穩(wěn)定表達(dá)也有可能發(fā)生[25]。當(dāng)然這種表達(dá)不穩(wěn)定也可能會對治療有利?？茖W(xué)家們正在研究一種特殊的啟動子，可以調(diào)節(jié)植入基因的啟動與關(guān)閉，以便靈活控制基因表達(dá)。

基因治療是目前肌腱韌帶損傷的研究熱點之一。在人體運動系統(tǒng)中，有研究者將IGF-l、TGF-b、BMP-2等基因轉(zhuǎn)移到肌肉、骨組織中產(chǎn)生了積極的治療效果。對于肌腱韌帶損傷，人們已經(jīng)獲得一些能夠改善或影響其修復(fù)的基因信息，最大的障礙是獲得安全有效的基因載體，可以靈活地調(diào)控目的基因的表達(dá)，并維持其穩(wěn)定性和安全性?？傊蛑委熂‰祉g帶損傷的廣闊前景還需研究者進(jìn)一步探索和研究。

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