酶法制備薩拉米風(fēng)味基料的研究

卜冬冬，汪建明，周紅，李秉業(yè)，張偉偉

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；2.山東新泰市檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東泰安 271000；3.山東天博食品配料有限公司，山東濟(jì)寧 272000）

酶法制備薩拉米風(fēng)味基料的研究

卜冬冬1，汪建明1，周紅2，李秉業(yè)3，張偉偉3

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；2.山東新泰市檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東泰安 271000；3.山東天博食品配料有限公司，山東濟(jì)寧 272000）

以發(fā)酵肉為原料，研究了酶法水解發(fā)酵肉制備薩拉米風(fēng)味基料的工藝條件。通過單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)和模糊數(shù)學(xué)感官評(píng)價(jià)法最終確定最佳的薩拉米風(fēng)味的產(chǎn)生條件，分別為蛋白酶添加量1.4%，料水比1∶3，54℃水解3h，水解度達(dá)到24.1%，得到的產(chǎn)物經(jīng)美拉德反應(yīng)增香具有濃郁的薩拉米風(fēng)味。

酶法水解；正交試驗(yàn)；薩拉米風(fēng)味；發(fā)酵肉

肉味香精是近年來迅速發(fā)展起來的食用香精之一，早期的肉類香精主要是利用各種單體香料和其他輔助配料經(jīng)拌和、調(diào)香制備而成，這種方法制備的香精往往特征香氣不足、口感較差。以氨基酸、水解動(dòng)植物蛋白（HAP，HVP）和還原糖為主要原料制備熱反應(yīng)香精的技術(shù)逐漸被肉味香精生產(chǎn)企業(yè)所采用，用此種方法生產(chǎn)的肉味香精產(chǎn)品香味濃郁、成本較低，但由于其原料為非肉源，所以缺少肉類的特征風(fēng)味和天然香氣。

為了進(jìn)一步改善肉味香精的質(zhì)量，酶解法技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，酶解工藝具有條件溫和，副反應(yīng)少，有利于營養(yǎng)成分的保留，生產(chǎn)工藝易控制等優(yōu)點(diǎn)。本文以發(fā)酵肉為主要原料，利用酶解技術(shù)制備薩拉米風(fēng)味基料，為后期成品香精的制備奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要原料與試劑

新鮮豬肉市售；復(fù)合蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶山東天博食品配料有限公司提供。

氯化鈉、甲醛、硫酸、鹽酸、硼酸（均為分析純） 山東天博食品配料有限公司提供。

1.2 主要儀器設(shè)備

98-1-B電子調(diào)溫電熱套，天津市泰斯特儀器有限公司；PHS-3C數(shù)顯pH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；MS403S分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；KT840凱氏定氮儀，丹麥福斯有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 制作工藝

豬肉糜→發(fā)酵→發(fā)酵肉→酶解→滅酶→成品。

1.3.2 氨基態(tài)氮的測(cè)定

采用甲醛滴定法［1］。

1.3.3 總氮的測(cè)定

采用凱式定氮法［2］。

1.3.4 水解度的測(cè)定［3］

1.3.5 單酶的篩選

準(zhǔn)確稱取發(fā)酵肉30g，選用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、胰蛋白酶、酸性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶8種蛋白酶分別酶解發(fā)酵肉，蛋白酶添加量均0.6%，pH自然，酶解溫度為各蛋白酶的最適溫度，酶解時(shí)間2h，通過測(cè)定酶解液的水解度來選擇效果最佳的蛋白酶。

1.3.6 蛋白酶的復(fù)配

將風(fēng)味蛋白酶分別與步驟1.3.5中水解度較高的3種蛋白酶以1∶1進(jìn)行復(fù)配，蛋白酶添加量0.6%，pH自然，酶解溫度55℃，酶解時(shí)間2h，通過測(cè)定酶解液的水解度來選擇效果最佳的蛋白酶組合。

1.3.7 酶解工藝的優(yōu)化

1.3.7.1 酶解溫度對(duì)酶解工藝的影響

準(zhǔn)確稱取發(fā)酵肉30g，酶解溫度分別為30，40，50，60，70℃，蛋白酶添加量0.6%，酶配比（胰蛋白酶∶風(fēng)味蛋白酶）1∶1，料水比1∶1，酶解時(shí)間2h，通過測(cè)定酶解液的水解度來選擇效果最佳的酶解溫度。

1.3.7.2 酶解時(shí)間對(duì)酶解工藝的影響

在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，酶解時(shí)間分別為1，2，3，4，5，6h，通過測(cè)定酶解液的水解度來選擇效果最佳的酶解時(shí)間。

1.3.7.3 料水比對(duì)酶解工藝的影響

在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，料水比分別為1∶0.5，1∶1，1∶1.5，1∶2，1∶2.5，1∶3，通過測(cè)定酶解液的水解度來選擇效果最佳的料水比。

1.3.7.4 蛋白酶添加量對(duì)酶解工藝的影響

在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，蛋白酶∶添加量分別為0.6%，0.8%，1%，1.2%，1.4%，1.6%，通過測(cè)定酶解液的水解度來選擇效果最佳的蛋白酶添加量。

1.3.7.5 蛋白酶配比對(duì)酶解工藝的影響

在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，酶配比（胰蛋白酶∶風(fēng)味蛋白酶）分別為1∶1，1.5∶1，2∶1，通過測(cè)定酶解液的水解度來選擇效果最佳的蛋白酶配比。

1.3.8 酶解工藝的正交優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇對(duì)酶解工藝影響較大的四個(gè)因素即酶解溫度、酶解時(shí)間、加酶量、料水比及空列，采用五因素四水平的正交試驗(yàn)對(duì)酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table 1Orthogonal test design table

2 結(jié)果與討論

2.1 單酶的篩選

不同蛋白酶酶解同一種物質(zhì)，會(huì)使得水解程度和水解產(chǎn)物組成不同［4］，故實(shí)驗(yàn)選取多種性質(zhì)各異的蛋白酶對(duì)發(fā)酵肉進(jìn)行酶解。按照1.3.5進(jìn)行試驗(yàn)，單一蛋白酶的酶解效果見圖1。

圖1 單酶對(duì)酶解工藝的影響Fig.1Influence of single enzyme on enzymolysis technology

由圖1可知，8種蛋白酶對(duì)發(fā)酵肉的酶解效果差異較明顯，胰蛋白酶的酶解效果最佳，水解度11.0%；木瓜蛋白酶的酶解效果次之，水解度9.7%；復(fù)合蛋白酶的酶解效果僅次于木瓜蛋白酶，水解度8.9%。故胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和復(fù)合蛋白酶是單酶酶解發(fā)酵肉中效果最好的3種蛋白酶。

2.2 蛋白酶的復(fù)配

酶解過程中，蛋白酶具有特異的酶切位點(diǎn)，酶解作用范圍較小，因此選擇復(fù)配酶解，可以使得疏水氨基酸被進(jìn)一步水解。由于風(fēng)味酶同時(shí)具有內(nèi)切和外切兩種活性，可用于脫除水解液的苦味，改善水解風(fēng)味［5，6］。故采用風(fēng)味蛋白酶分別與胰蛋白酶、木瓜蛋白酶及復(fù)合蛋白酶復(fù)合酶解發(fā)酵肉，在一定程度上提高酶解液的風(fēng)味、減少苦味。按照1.3.6進(jìn)行試驗(yàn)，雙酶的酶解效果見圖2。

圖2 雙酶對(duì)酶解工藝的影響Fig.2Influence of double enzymes on enzymolysis technology

由圖2可知，雙酶酶解發(fā)酵肉酶解效果的優(yōu)劣順序?yàn)轱L(fēng)味蛋白酶＋胰蛋白酶＞風(fēng)味蛋白酶＋木瓜蛋白酶＞風(fēng)味蛋白酶＋復(fù)合蛋白酶。故風(fēng)味蛋白酶與胰蛋白酶復(fù)合酶解發(fā)酵肉的酶解效果最佳，水解度為12.9%。

2.3 酶解條件的優(yōu)化

2.3.1 酶解溫度對(duì)酶解工藝的影響

按照1.3.7.1進(jìn)行試驗(yàn)，研究酶解溫度對(duì)酶解工藝的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 酶解溫度對(duì)酶解工藝的影響Fig.3Influence of enzymolysis temperature on enzymolysis technology

蛋白酶的活性受溫度影響較明顯，由圖3可知，在一定溫度范圍內(nèi)，隨著酶解溫度的不斷增加，水解度呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。因?yàn)榉磻?yīng)溫度太低，酶活力不足，水解較慢，反應(yīng)不完全；當(dāng)溫度較高時(shí)，部分酶失活，水解不完全。酶解溫度50℃時(shí)，水解度達(dá)到最高，為18.7%，故酶解溫度50℃時(shí)，酶解效果最佳。

2.3.2 酶解時(shí)間對(duì)酶解工藝的影響

按照1.3.7.2進(jìn)行試驗(yàn)，研究酶解時(shí)間對(duì)酶解工藝的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)酶解工藝的影響Fig.4Influence of enzymolysis time on enzymolysis technology

由圖4可知，酶解時(shí)間從1h增加到3h時(shí)，水解度增加速度較快；酶解時(shí)間從3h增加到6h的過程中，水解度增加緩慢，最終趨于平穩(wěn)。酶解時(shí)間從2h增加到3h時(shí)，水解度提高了24.8%；酶解時(shí)間從3h增加到4h時(shí)，水解度僅提高了4.22%，從經(jīng)濟(jì)效益考慮，應(yīng)選擇酶解時(shí)間為3h，此時(shí)的水解度為16.6%。

2.3.3 料水比對(duì)酶解工藝的影響

按照1.3.7.3進(jìn)行試驗(yàn)，研究料水比對(duì)酶解工藝的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 料水比對(duì)酶解工藝的影響Fig.5Influence of material-water ratio on enzymolysis technology

酶的水解過程是一個(gè)可逆過程，料水比直接影響水解氨基酸及多肽的濃度，從而可能影響底物的最終水解度。由圖5可知，隨著料水比比值的降低，水解度呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，在料水比1∶2.5時(shí)，水解度最大，為18.2%，故料水比1∶2.5時(shí)，酶解效果最好。

2.3.4 蛋白酶添加量對(duì)酶解工藝的影響

按照1.3.7.4進(jìn)行試驗(yàn)，研究蛋白酶添加量對(duì)酶解工藝的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 蛋白酶添加量對(duì)酶解工藝的影響Fig.6Influence of enzyme addtive amount on enzymolysis technology

由圖6可知，隨著蛋白酶添加量的增加，水解度呈現(xiàn)出整體上升最后趨于平緩的趨勢(shì)，蛋白酶添加量低于1.2%時(shí)，隨著蛋白酶添加量的增加，水解度不斷增加，且增加速度較快，此時(shí)，底物尚未被酶飽和，通過添加酶量可以結(jié)合更多的底物，在多個(gè)酶切位點(diǎn)進(jìn)行反應(yīng)［7］；蛋白酶添加量高于1.2%時(shí)，水解度略有增加最終趨于平緩，說明底物接近飽和狀態(tài)，酶添加量的增加很難提高酶切效率，從節(jié)約成本的角度出發(fā)，選擇最佳蛋白酶添加量為1.2%，此時(shí)水解度為20.1%。

2.3.5 蛋白酶配比對(duì)酶解工藝的影響

按照1.3.7.5進(jìn)行試驗(yàn)，研究蛋白酶配比對(duì)酶解工藝的影響，結(jié)果見圖7。

圖7 酶配比對(duì)酶解工藝的影響Fig.7Influence of enzyme ratio on enzymolysis technology

由圖7可知，胰蛋白酶∶風(fēng)味蛋白酶為1.5∶1時(shí)，水解度最高，達(dá)到20.6%，水解效果最佳，故1.5∶1為最優(yōu)酶配比。

2.4 酶解工藝的正交優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用五因素四水平的正交試驗(yàn)對(duì)酶解工藝進(jìn)行了優(yōu)化，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1，得到的正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果得到的正交試驗(yàn)效應(yīng)曲線圖見圖8。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果表Table 2Result table of orthogonal test

圖8 正交試驗(yàn)效應(yīng)曲線圖Fig.8Effective curves of orthogonal experiment

極差R的大小可以用來衡量實(shí)驗(yàn)中相應(yīng)因素作用的大小，各因素的極差與空列的極差相比較，比空列極差大說明該因素對(duì)酶解效果影響顯著，反之說明該因素對(duì)酶解效果影響不顯著；極差R值越大，說明顯著性越高，反之說明顯著性越低。

由表2可知，對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析可得極差的大小順序?yàn)镽C＞RB＞RD＞RE＞RA，可見酶解時(shí)間、加酶量及料水比的極差均大于空列，故酶解時(shí)間、加酶量及料水比均對(duì)酶解工藝影響顯著；而酶解溫度的極差小于空列，故酶解溫度對(duì)酶解工藝的影響不顯著。顯著因素從主到次的順序?yàn)镃（加酶量）＞B（酶解時(shí)間）＞D（料水比）。

由圖8可知，最優(yōu)方案為A3B4C4D4，即酶解溫度54℃，酶解時(shí)間3.5h，蛋白酶添加量1.4%，料水比1∶3，考慮到KB3＝0.206，KB2＝0.207，兩者相差極小，為節(jié)約成本，A3B3C4D4被考慮在最優(yōu)方案之列。進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，重復(fù)3次，方案A3B4C4D4的水解度24.9%，方案A3B3C4D4的水解度24.1%，綜合考慮，選擇A3B3C4D4為最優(yōu)方案，即酶解溫度54℃，酶解時(shí)間3h，蛋白酶添加量1.4%，料水比1∶3。

2.5 模糊數(shù)學(xué)評(píng)價(jià)檢驗(yàn)

水解度高說明酶解效果好，即被蛋白酶酶解后產(chǎn)生的氨基酸及肽含量高，為后期美拉德反應(yīng)提供高效反應(yīng)原料。水解度不同說明酶解液中氨基酸及肽的含量不同，后期美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的風(fēng)味就會(huì)有所差異［8］。對(duì)正交試驗(yàn)最優(yōu)方案A3B4C4D4（第1組）和方案A3B3C4D4（第2組）進(jìn)行輕度美拉德增香反應(yīng)，采用模糊數(shù)學(xué)評(píng)價(jià)檢驗(yàn)法選出最具薩拉米風(fēng)味的基料，不但克服了感官評(píng)定的主觀性和片面性，使模糊的問題數(shù)學(xué)化，還可使評(píng)定結(jié)果更趨于合理性［9］。

2.5.1 模糊矩陣建立結(jié)果

對(duì)正交試驗(yàn)最優(yōu)方案A3B4C4D4（第1組）和方案A3B3C4D4（第2組）進(jìn)行模糊數(shù)學(xué)評(píng)價(jià)檢驗(yàn)，最終確定酶解工藝的最佳條件。則評(píng)判對(duì)象集 U為：U＝｛u1……ui，……un｝，對(duì)于薩拉米風(fēng)味基料，確定由3項(xiàng)指標(biāo)組成因素集，即U＝（氣味u1，滋味u2，整體協(xié)調(diào)性u(píng)3）；評(píng)判因素V＝（vl，v2，……，vi，……，vm），經(jīng)過評(píng)定小組討論，確立薩拉米風(fēng)味基料的評(píng)語集為V＝（優(yōu)秀v1，良好v2，一般v3，較差v4），各級(jí)評(píng)語對(duì)應(yīng)的感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)見表3。

表3 薩拉米風(fēng)味基料的感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)表Table 3Sensory evaluation standard table of Salami flavor base

根據(jù)參考文獻(xiàn)［10］確定其相應(yīng)的權(quán)重向量為：W＝｛w1，……wi，……wn｝＝（0.36，0.34，0.30）。

將每個(gè)樣品的質(zhì)量評(píng)價(jià)因素進(jìn)行歸一化處理，得到以下模糊矩陣：

其中j＝l，2為樣品編號(hào)，i＝l，2，3為質(zhì)量評(píng)價(jià)因素，ril，ri2，ri3分別為第i個(gè)評(píng)價(jià)因素。

10名感官評(píng)定員對(duì)2組樣品按氣味、滋味、整體協(xié)調(diào)性3個(gè)因素逐一評(píng)價(jià)，其對(duì)應(yīng)的等級(jí)票數(shù)分布情況見表4。

表4 感官評(píng)定票數(shù)分布Table 4Votes＇distribution of sensory evaluation

根據(jù)以上規(guī)定，得到2組樣品的模糊矩陣：R11＝V11/10……。

2.5.2 模糊變換及綜合評(píng)價(jià)結(jié)果

根據(jù)模糊矩陣變化原理：R＝W×A，則第1組樣品的綜合評(píng)價(jià)結(jié)果為：R1＝W×A1＝（0.36，0.34，0.30）×A1＝（0.466，0.344，0.166，0.034）；第2組樣品的綜合評(píng)價(jià)結(jié)果為：R2＝W×A2＝（0.36，0.34，0.30）×A2＝（0.6，0.236，0.134，0.03）。

以上結(jié)果說明，第1組樣品有46.6%的感官評(píng)定員認(rèn)為其等級(jí)為優(yōu)秀，34.4%的感官評(píng)定員認(rèn)為其等級(jí)為良好，16.6%認(rèn)為一般，3.4%認(rèn)為較差。第2組樣品具有最高的隸屬優(yōu)秀頻率，其綜合感官為優(yōu)秀的概率為60%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過第1組樣品，且只有3%的評(píng)定員認(rèn)為其較差，第2組樣品隸屬良好的頻率較第1組低，但優(yōu)秀與良好的總隸屬率達(dá)到83.6%，是2組樣品中最高的。根據(jù)最大隸屬原則認(rèn)為樣品2的綜合感官最佳，即酶解溫度54℃、酶解時(shí)間3h、蛋白酶添加量1.4%、料水比1∶3。

3 結(jié)論

以發(fā)酵肉為原料，通過蛋白酶的篩選、復(fù)配確定最佳的蛋白酶組合，即風(fēng)味蛋白酶和胰蛋白酶；通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定最優(yōu)酶解工藝，即酶解溫度54℃、酶解時(shí)間3.5h、蛋白酶添加量1.4%、料水比1∶3；最終通過模糊數(shù)學(xué)感官評(píng)價(jià)法確定最優(yōu)的酶解工藝，即酶解溫度54℃、酶解時(shí)間3h、蛋白酶添加量1.4%、料水比1∶3、水解度24.1%，為后期制備薩拉米風(fēng)味香精奠定了基礎(chǔ)。

［1］GB/T 5009.39－2003，醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法［S］.

［2］GB 5009.5－2010，食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定［S］.

［3］Adler-Nissen J.Determination of the degree of hydrolysis of food protein hydrolysates by trinitrobenzenesulfonic acid［J］.Journal of Agriculture and Food Chemistry，1979，27（6）：1256-1262.

［4］Ney K H.Voraussage der bitterkeit von peptiden aus deren aminosurezu-sammensetzung［J］.Lebensm-Umtersueh.Forscha.1971，147（2）：64-71.

［5］Jens Adler-Nissen.Control of proteolytic reaction and of the level of bitterness in protein hydrolysis process［J］.Chem Tech Biotechnol，2008，34（3）：215-222.

［6］Gleann Roy.The use of exopeptidases in bitter taste modification［M］.Asaymposium Pennsylvania：Technomic Publishing Company Inc.，1997.

［7］汪曉，李俊霞，王斐，等.酶法水解羊肉制備肉味香精的研究［J］.食品科技，2008（10）：39.

［8］郇興建.利用豬骨制備天然肉味香精的研究［D］.南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

［9］曹冬梅，王淑娟，王靜.模糊數(shù)學(xué)在豆?jié){感官評(píng)定中的應(yīng)用［J］.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，35（1）：39-41.

［10］Saiyavit Varavini.Production of meat-like flavor［J］.Science Asia，2000，26：219-224.

Study on Enzymatic Preparation of Salami Flavor Base

BU Dong-dong1，WANG Jian-ming1，ZHOU Hong2，LI Bing－ye3，ZHANG Wei-wei3
（1.College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science ＆Technology，Tianjin 300457，China；2.Shandong Xintai Inspection and Testing Center，Taian 271000，China；3.Shandong Tianbo Food Ingredients Co.，Ltd.，Ji＇ning 272000，China）

Study the preparation of Salami flavor base material with enzyme-hydrolyzed fermented meat as raw material.Through single-factor experiment，orthogonal experiment and sensory evaluation method of fuzzy mathematics，the optimum condition for preparation of Salami flavor is defined.The result shows that protease additive amount is 1.4%，material and water ratio is 1∶3，hydrolyzing for 3hunder 54℃.Under such conditions，the degree of hydrolysis reaches 24.1%.The product with better Salami flavor is obtained by Maillard reaction.

enzymatic hydrolysis；orthogonal experiment；Salami flavor；fermented meat

TS202.3

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.03.020

1000-9973（2017）03-0085-06

2016－09－04

卜冬冬（1989－），女，碩士，研究方向：食品添加劑。