SLS人體單次斑貼試驗陽性對照物基準模型的建立

SLS人體單次斑貼試驗陽性對照物基準模型的建立

楊麗潔1胡蔚毅1馬亞峰2袁 超1

目的:建立十二烷基磺酸鈉(SLS)人體單次斑貼試驗陽性基準模型。方法:60名健康受試者使用0．01%、0．05%、0．10%、0．50%和1．00%SLS進行第一階段皮膚單次斑貼試驗，確定陽性對照物的初步合適濃度區(qū)間。然后再選取60名健康受試者根據(jù)第一階段合適濃度范圍設(shè)計濃度進行第二階段試驗，進一步確定合適濃度。結(jié)果:第一階段的試驗提示，陽性基準物的濃度在0．01%～0．05%之間，第二階段確定0．02%SLS的1級皮膚反應(yīng)人數(shù)≤5例，2級皮膚反應(yīng)人數(shù)＜2例，該反應(yīng)率與標準中的陽性結(jié)果最為接近。結(jié)論:建議以0．02%SLS作為人體單次斑貼試驗的陽性對照物基準模型。

皮膚斑貼試驗;刺激反應(yīng);基準模型;十二烷基磺酸鈉

我國化妝品產(chǎn)業(yè)已經(jīng)呈現(xiàn)出消費市場不斷擴大、產(chǎn)品更新?lián)Q代不斷加快、新型化妝品不斷涌現(xiàn)、新原料不斷開發(fā)的新趨勢?；瘖y品產(chǎn)業(yè)的這種發(fā)展趨勢必然會增加化妝品不良反應(yīng)發(fā)生的可能性。國際上通常采用人體重復(fù)激發(fā)斑貼試驗(Human Repeated Insult Patch Test，HRIPT)來評價化妝品對皮膚潛在的致敏性［1］;而皮膚刺激性評價方法上，目前在國家藥品食品監(jiān)督管理局的監(jiān)管下，按照《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》(2007版)對化妝品進行單次皮膚斑貼試驗，以此來檢測化妝品對人體皮膚潛在不良反應(yīng)。據(jù)上海市皮膚病醫(yī)院2008年統(tǒng)計的“3497件特殊用途化妝品人體單次皮膚斑貼試驗結(jié)果分析”認為［2］:斑貼試驗進行的季節(jié)、受試者性別對其結(jié)果有一定影響，如冬季化妝品斑貼試驗陽性率高于夏季，男性對化妝品陽性率高于女性。

如何在斑貼試驗的方法學(xué)上規(guī)避混雜因素對其試驗結(jié)果的影響，這是化妝品監(jiān)測管理中的重要環(huán)節(jié)之一。在很多研究中，十二烷基磺酸鈉(Sodium Lauryl Sulphate，SLS)常常被應(yīng)用為皮膚刺激物模型，以SLS作為陽性對照物進行相應(yīng)的判斷［3，4］。因此，我們設(shè)想在化妝品監(jiān)測管理中，如加上合適濃度的SLS作為陽性判讀的依據(jù)，是否能夠?qū)⒅八峒暗幕祀s因素進行規(guī)避，這是我們此次的研究目的。

1 材料與方法

1．1 研究對象試驗分為兩個階段進行:階段一，SLS陽性反應(yīng)濃度的初步確定。按照《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》(2007版)中“人體皮膚斑貼試驗”的受試者選擇要求，60名健康自愿受試者分兩次進行試驗。階段二，SLS陽性反應(yīng)濃度的進一步確定，再次選擇60名健康自愿受試者分為兩次進行試驗。120名受試者基本信息見表1。試驗前，每位受試者簽署知情同意書。受試者試驗期間，避免背部試驗部位的洗浴或搔抓，并停用任何藥物。整個試驗過程和方法經(jīng)過上海市皮膚病醫(yī)院倫理委員會審核和通過。為了避免季節(jié)因素對試驗結(jié)果的影響，選擇同一季節(jié)(九月份)進行試驗。

表1 試驗不同階段的受試者性別和年齡分布

1．2 材料與方法

1．2．1 材料斑試器:上海市衛(wèi)生材料廠出品。其直徑為8 mm?？烧{(diào)微量移液器:上海求精生化試劑及儀器公司生產(chǎn)。其可調(diào)范圍為10～50μL。SLS:希格瑪公司出品。為試驗用分析純濃度99%。

1．2．2 方法根據(jù)《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》(2007版)中人體皮膚斑貼試驗的基本原則和方法，對不同濃度的SLS進行檢測，階段一中試驗用SLS濃度為0．01%、0．05%、0．10%、0．50%和1．00%;階段二中試驗用SLS濃度為0．01%、0．02%、0．03%和0．04%。試驗過程:將試驗物和空白對照、蒸餾水對照貼覆于受試者背部24 h。在去除受試物斑試器后0．5 h、24 h及48 h對皮膚反應(yīng)進行評價，并記錄評價結(jié)果。所有皮膚反應(yīng)均有受過專業(yè)培訓(xùn)的兩位皮膚科醫(yī)師按照統(tǒng)一標準判讀。評判標準使用《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》(2007版)中的“皮膚不良反應(yīng)分級標準”。該試驗在經(jīng)過中華人民共和國國家藥品食品監(jiān)督管理局認定的人體安全性和功效性檢驗機構(gòu)及國家計量認證單位認證的實驗室內(nèi)進行，符合良好非創(chuàng)傷性檢測試驗條件。

1．2．3 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS醫(yī)學(xué)統(tǒng)計軟件包進行分析。計數(shù)資料采用卡方檢驗，其顯著性水平為0．05。

2 結(jié)果

2．1 第一階段的結(jié)果

2．1．1 不同濃度SLS反應(yīng)人數(shù)情況1%SLS在第一階段的兩次試驗中，均引起了100%反應(yīng)率;而0．01%和0．05%SLS反應(yīng)率相對較低，見表2。對照《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》(2007版)中“結(jié)果解釋”部分:30例受試者中出現(xiàn)1級皮膚不良反應(yīng)人數(shù)多于5例(反應(yīng)率為16．7%)，判定受試物對人體有皮膚不良反應(yīng)。與16．7%的反應(yīng)率相比，0．10%、0．50%和1．00%的SLS反應(yīng)率較高(P＜0．05)?？梢猿醪酵茢?，陽性對照物的合適濃度區(qū)間范圍在0．01%～0．05%之間，需要進一步分層探索其合適濃度。

表2 第一階段中不同濃度SLS反應(yīng)人數(shù)情況

2．1．2 不同性別的反應(yīng)率比較男性對SLS反應(yīng)率在0．05%和0．10%之間顯著高于女性(P＜0．05)，而在0．01%、0．50%及1%時和女性沒有顯著性差異(P＞0．05)。此結(jié)果與2008年統(tǒng)計的“3497件特殊用途化妝品人體單次皮膚斑貼試驗結(jié)果分析”中一致，說明對于低濃度的刺激物而言，男性的陽性反應(yīng)率高于女性(圖1)。

圖1 階段一中不同性別反應(yīng)率比較

2．2 第二階段的結(jié)果根據(jù)階段一的結(jié)果，將SLS的試驗濃度調(diào)整為0．01%、0．02%、0．03%及0．04%，再次進行人體皮膚斑貼試驗。

2．2．1 不同濃度SLS反應(yīng)人數(shù)情況兩個批次的試驗中，0．02%SLS反應(yīng)率低于“1級皮膚不良反應(yīng)人數(shù)5例”(反應(yīng)率為16．7%)的標準，且無顯著性統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0．05);0．03%SLS的反應(yīng)率高于16．7%，也無顯著性差異(P＞0．05);而0．01%或0．04%SLS均顯著低于或高于該標準(P＜0．05)，見表3。

表3 第二階段中不同濃度SLS反應(yīng)人數(shù)情況

2．2．2 與衛(wèi)生規(guī)范標準的比較按照《2007版化妝品衛(wèi)生規(guī)范》中“結(jié)果解釋”的標準，比較這四種不同濃度SLS的1級反應(yīng)和2級反應(yīng)人數(shù)，認為:兩次試驗中，0．02%SLS的1級皮膚反應(yīng)人數(shù)≤5例，且2級皮膚反應(yīng)人數(shù)＜2人。見圖2，3。

圖2 第一批1級和2級皮膚反應(yīng)人數(shù)

圖3 第二批1級和2級皮膚反應(yīng)人數(shù)

3 討論

早在九十年代早期，Basketter等人就提倡使用人體4 h斑貼試驗來替代動物試驗辨別皮膚急性刺激反應(yīng)［5，6］。但因為化妝品終產(chǎn)品很少產(chǎn)生急性刺激反應(yīng)，且大多產(chǎn)品需要駐留在皮膚表面，所以該方法應(yīng)用的并不多。在1996年，由歐洲化妝品－洗滌產(chǎn)品－香精協(xié)會(COLIPA)的特別小組制定了一項指南，通過該指南明確了化妝品終產(chǎn)品對人體皮膚潛在不良反應(yīng)的檢測規(guī)定:該指南中有明確的單次/多次開放型斑貼試驗和單次/多次封閉性或半封閉性斑貼試驗方法與操作步驟［7］。國內(nèi)在2007年頒布的《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》中明確規(guī)定了人體皮膚斑貼試驗的原則和方法，并且作為一種行業(yè)規(guī)范在全國的各大化妝品行政許可檢驗機構(gòu)進行實施和評價。

對于人體皮膚斑貼試驗的結(jié)果解釋，一直在化妝品安全性評價中有著一定的爭議。雖然在規(guī)范中定義了受試者選擇和排除的相關(guān)標準，但是在實施過程中，我們發(fā)現(xiàn):受試者皮膚屏障功能對檢測結(jié)果及化妝品判定有重要影響，而影響皮膚屏障功能的因素有很多:如人種、性別、年齡、藥物、環(huán)境溫度、濕度等［8］。在國外，如泰國衛(wèi)生行政許可檢驗斑貼試驗中，就是使用2．5%SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)作為陽性對照物，將待測化妝品終產(chǎn)物與陽性對照物進行比對，來判定產(chǎn)品的安全性［9］。刺激性皮炎發(fā)生原因很多，但最重要的是刺激物滲透到角質(zhì)層，并影響到角質(zhì)層相關(guān)結(jié)構(gòu)，從而出現(xiàn)刺激反應(yīng)。在既往很多研究中，應(yīng)用SLS斑貼試驗來評估患者是否容易產(chǎn)生刺激性皮炎，這就是一種對皮膚屏障功能評價手段。Gloor M等用1%SLS在手臂屈側(cè)進行皮膚斑貼試驗，并應(yīng)用多普勒血流儀測定其紅斑改變情況，研究發(fā)現(xiàn)紅斑可一直持續(xù)到試驗后7～9天［10］。該結(jié)果和我們研究一致，在參與1%SLS斑貼60人中，100%出現(xiàn)了反應(yīng)，說明該濃度是可以引起明顯刺激反應(yīng)。

在對陽性基準物模型探索中，我們逐步降低SLS濃度，期望能夠得到一個符合衛(wèi)生規(guī)范標準的合適濃度。試驗第一階段中，通過五種不同濃度SLS比較，分析出陽性對照物的合適濃度區(qū)間范圍在0．01%～0．05%之間;在第二階段中，將0．01%～0．05%進行分層，發(fā)現(xiàn)0．02%SLS反應(yīng)情況最接近“1級皮膚不良反應(yīng)人數(shù)5例”的標準。在人體皮膚斑貼試驗的操作中，將0．02%SLS作為陽性對照基準物，如化妝品終產(chǎn)品反應(yīng)大于0．02%SLS的反應(yīng)，認為可能對皮膚存在潛在刺激反應(yīng)可能;相反，如化妝品終產(chǎn)品反應(yīng)小于或等于0．02%SLS的反應(yīng)，認為產(chǎn)品是安全的。

當然，本次研究只是在尋找陽性對照物基準模型中的一個初步摸索，正式使用該標準還需要在實際工作中不斷總結(jié)和提煉，最好能在多個不同試驗室進行比對工作，以獲得更多數(shù)據(jù)支持。另外，在我們的研究中，僅僅將SLS定義為一個刺激物模型，如出現(xiàn)SLS變態(tài)反應(yīng)，則需要對結(jié)果進行科學(xué)分析。同時，該方法只有在評價刺激反應(yīng)時，可以規(guī)避混雜因素對斑貼試驗結(jié)果的影響，而對變態(tài)反應(yīng)的評價時，就需要應(yīng)用其他類型斑貼試驗進行證實。

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(收稿:2016－07－28修回:2016－10－08)

Establishment of positive control for benchmark in human single patch test

YANGLijie1，HUWeiyi1，MAYafeng2，YUANChao1．
1．ResearchLaboratoryofcosmeticsandskin，ShanghaiDermatologyHospital，Shanghai200443，China;2．DepartmentofDermatology，theAffiliatedHospitalofXuzhouMedicalUniversity，Xuzhou210002，China Correspondingauthor:YUANChao，E－mail:dermayuan@163．com

Objective:To establish the positive control for benchmark model of human asingle patch test．Methods:In the first stage，sixty healthy subjects were tested by different concentrations(0．01%、0．05%、0．10%、0．50%and 1．00%)of sodium lauryl sulphate(SLS)in single patch test in order to determine the proper concentration．In the second stage，the results obtained from the first stage of the experiment was used to determine the test concentration in 60 study subjects．Results:The positive benchmark concentration was between 0．01%－0．05%in the first study stage．When the concentration of SLS was 0．02%，there was less than 5 subjects in level 1 skin reaction and less than 2 subjects in level 2 skin reaction，which was most close to the positive standard according to the Cosmetics Health Standards 2007．Conclusion:0．02%SLS is applicable as a positive control for benchmark in human single patch test．

Skin Patch Test;irritative reaction;benchmark model;sodium lauryl sulphate

1上海市皮膚病醫(yī)院，皮膚與化妝品研究室，上海，200443 2徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，江蘇徐州，221002

袁超，E－mail:dermayuan@163．com