食源性致病菌PCR檢測前處理方法研究進(jìn)展

白亞龍 - 索玉娟 - 周昌艷 -

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，上海 201403)

致病性微生物引起的食源性疾病是食品安全的首要問題。近年來，大規(guī)模的食源致病菌污染事件屢屢發(fā)生，己成為世界性公共衛(wèi)生安全問題。據(jù)2015年12月WHO發(fā)布的《全球食源性疾病負(fù)擔(dān)的估算報告》，每年10人中就有1人因被污染的食物生病，總?cè)藬?shù)約為5.5億，并導(dǎo)致42萬人死亡。其中，腹瀉病占全球食源性疾病的50%以上，造成每年23萬例死亡[1]。腹瀉病通常是因為食用被彎曲桿菌、非傷寒沙門菌、致病性大腸桿菌和諾如病毒等污染的生的或未煮熟的肉、蛋、新鮮農(nóng)產(chǎn)品和乳制品等造成的。

目前，食源性致病菌檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”依然是培養(yǎng)法[2-4]，但因耗時長，在實際應(yīng)用中仍有一定的局限性。一般要經(jīng)過前增菌、選擇性增菌、選擇性平板分離、生化鑒定、血清學(xué)鑒定5個步驟，往往需要4～7 d，甚至更長時間才能做出最終鑒定[5]。在食品行業(yè)，生產(chǎn)、加工、運輸、貯藏等環(huán)節(jié)都應(yīng)該進(jìn)行行之有效的監(jiān)控，傳統(tǒng)的培養(yǎng)法無法滿足這種快速需求，建立快速、靈敏的食源性致病菌檢測方法來保證食品供應(yīng)的安全性日漸需要?？焖贆z測的靈敏度也可以滿足一些致病菌(如金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌等)的限量標(biāo)準(zhǔn)，這使得快速檢測更有用武之地。

在食源性致病菌的快速檢測中，以PCR為代表的分子檢測技術(shù)占有重要地位。遺傳物質(zhì)是生命物質(zhì)的關(guān)鍵核心，隨著基因組學(xué)、計算機(jī)技術(shù)等領(lǐng)域的發(fā)展，以PCR為代表的分子檢測技術(shù)將在致病菌檢測中發(fā)揮越來越強(qiáng)大的優(yōu)勢。通過比較基因組學(xué)，不但尋找到種屬、血清型，甚至菌株特異性的靶點序列，還可以檢測毒素基因、耐藥基因等。不過，雖然PCR可以在1 h左右將目標(biāo)序列從幾個拷貝擴(kuò)增到108倍，但是用PCR檢測食源性致病菌時，食品成分對反應(yīng)體系的干擾與微量的致病菌核酸的難以分離，導(dǎo)致分子檢測的優(yōu)勢無法徹底發(fā)揮。所以，從復(fù)雜的食品介質(zhì)中分離或富集目標(biāo)致病菌(或核酸)是食源性致病菌分子檢測的一個重要瓶頸，本文就食源性致病菌PCR檢測方法的前處理方法展開綜述。

1 培養(yǎng)增菌

致病菌是活的生物物質(zhì)，為了得到大量的可檢測致病菌，可以取一定量食品在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)增菌。培養(yǎng)增菌還可以簡化介質(zhì)，減少復(fù)雜食品介質(zhì)對PCR的抑制影響。Yang等[6]發(fā)現(xiàn)，食品樣品本身以及其他非目標(biāo)菌的核酸等會對PCR檢測造成嚴(yán)重抑制，在生肉和火腿中即使單增李斯特菌殘留量達(dá)到107CFU/g的水平，依然無法檢測到。因此，增菌常常是PCR檢測不可缺少的步驟。Zhou等[7]經(jīng)過18 h增菌處理，可以應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR檢測雞蛋或者牛奶中1 CFU/mL活的沙門氏菌殘留。Lee等[8]經(jīng)過12 h 增菌，用六重PCR同時檢測沙門氏菌等6種食源性致病菌，檢出限可達(dá)到1 CFU/mL的水平。

在生產(chǎn)、運輸或者貯存過程中食品樣品除了受目標(biāo)檢測菌污染之外，可能還含有大量雜菌，因此，對于這些樣品除了用非選擇性培養(yǎng)基(如緩沖蛋白胨水、胰蛋白胨大豆肉湯以及營養(yǎng)肉湯等)培養(yǎng)以外，還需要選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行目標(biāo)菌的特異性增菌。食品在生產(chǎn)、運輸、貯存、銷售等過程中，污染到的致病菌可能處于不同的狀態(tài)，增菌培養(yǎng)不僅可以增加目標(biāo)檢測物的數(shù)量，還可以對目標(biāo)菌的損傷和不良狀態(tài)進(jìn)行修復(fù)。然而一些選擇性的培養(yǎng)基會對損傷或者不良狀態(tài)的致病菌生長有抑制作用，所以通常在選擇性培養(yǎng)之前需要非選擇性培養(yǎng)[9-10]。

多重PCR可以同時檢測幾種致病菌，但是每種培養(yǎng)基針對不同致病菌的培養(yǎng)速率是不一致的，所以，開發(fā)通用型預(yù)增菌培養(yǎng)液使其可應(yīng)用于多種食源性致病菌的同時增菌培養(yǎng)也是致病菌檢測中的一個研究熱點。Suo等[11]開發(fā)了一種SEL培養(yǎng)液可以同時用于損傷修復(fù)與培養(yǎng)Salmonellaspp.、E.coliO157:H7和L.monocytogenes3種致病菌，而且這種培養(yǎng)液含有抑制其他菌生長的物質(zhì)，因此可以使得這3種菌成為主要生長菌。

目前，對于分子檢測食源性致病菌方法而言，廣泛采用的前處理方式依然是培養(yǎng)增菌。優(yōu)點是可以實現(xiàn)較低的食源性致病菌污染檢測(如1 CFU/25 g的水平)，這種檢出限是非增菌培養(yǎng)的方法無法達(dá)到的，而且一般可以排除死菌干擾。此外，經(jīng)過增菌培養(yǎng)的食源性致病菌核酸提取也更為容易與高效，但培養(yǎng)時間較長，而且也無法定量致病菌初始?xì)埩魯?shù)目。

2 離心

2.1 普通離心

對于食品樣品，常規(guī)離心并不能作為單獨的濃縮方法，而是有效的輔助手段。對于一些液態(tài)食品，如飲用水、果汁、牛奶、飲料等，可以通過高速離心將菌體進(jìn)行初步濃縮。對于復(fù)雜的固體或半固體食品介質(zhì)(如肉、禽類、水產(chǎn)品等)，可以在均質(zhì)后先低速離心除去顆粒的食品介質(zhì)，然后采用高速離心濃縮到目標(biāo)菌體。對大多數(shù)食品樣品而言，經(jīng)過離心處理，雖然可以進(jìn)行初步濃縮，但是仍然含有大量的雜質(zhì)成分，并不適合直接提取核酸。往往還需要與其他分離手段相互結(jié)合，如免疫磁珠分離、密度梯度離心等。

2.2 密度梯度離心

分子檢測前處理的重要目的是：① 有效濃縮目的菌體；② 盡可能去除其他雜質(zhì)。雜質(zhì)的存在會影響后續(xù)核酸的分離純化，還可能因為含有抑制劑而導(dǎo)致不能產(chǎn)生檢測信號。密度梯度離心法是利用試劑在離心之后產(chǎn)生不同的密度梯度，大多數(shù)食品介質(zhì)的顆粒物密度較輕，經(jīng)過低速離心處于上層而優(yōu)先被除去，而菌體往往處于特定的密度梯度范圍，從而有效地將目標(biāo)菌體進(jìn)行富集。Wolffs等[12]用密度梯度離心法處理雞肉中的空腸彎曲桿菌，發(fā)現(xiàn)雖然不同生長狀態(tài)的菌體密度有所不同，但是大都處于1.065～1.109 g/mL。最終結(jié)合qPCR的檢測限為8.6×102CFU/mL，最低定量限度為2.6×103CFU/mL。此外，Wolffs等[13]也用密度梯度離心法檢測了豬肉中的結(jié)腸炎耶爾森桿菌，結(jié)合qPCR的檢測限為4.2×103CFU/mL，當(dāng)存在106CFU/mL的雜菌時對檢測結(jié)果沒有影響。密度梯度離心操作簡便，只需要反復(fù)離心，死菌的干擾也可以被有效去除[12]。但是反復(fù)離心也可能會造成目標(biāo)菌體的損失，最終收集到的菌體也會不可避免地?fù)诫s一些密度相似的雜質(zhì)，最終的檢出限仍然偏高。

3 膜分離

膜過濾方法同樣也是為了去除食品顆粒和濃縮目標(biāo)菌體而進(jìn)行的前處理方法。Wolffs等[14]用兩步過濾法處理碎雞肉漂洗液和豆芽萌發(fā)用水來檢測其中的沙門氏菌，先用40 μm 孔徑以上的膜過濾去除大的食品顆粒，再用0.22 μm孔徑的膜收集菌體，生理鹽水洗脫目標(biāo)菌體之后進(jìn)行以SYBR Green為染料的qPCR檢測，檢測限可以達(dá)到7.5×102CFU/100 mL樣品的水平。這種方法不需要前增菌也不需要提取核酸，時間大大縮短，可以在3 h之內(nèi)完成檢測。Rodríguez等[15]用11 μm孔徑的濾膜過濾食品均質(zhì)物，再用Chelex-100提取DNA，最后用qPCR檢測生豬肉、熏火腿、熏香腸等食品中的單增李斯特菌，檢測限可以達(dá)到103CFU/mL 的水平。膜分離技術(shù)雖然有了一定的研究，但操作復(fù)雜，不適合批量樣品檢測，而且還存在交叉污染的風(fēng)險。

4 磁性分離

相對于其他分離手段而言，磁性分離具有一定的優(yōu)勢，可以較為徹底地去除食品介質(zhì)中的一些抑制物，甚至可以只分離得到目標(biāo)菌體(或目標(biāo)菌的核酸)而棄掉其他雜質(zhì)，所以，在食源性致病菌檢測中得到高度的重視與廣泛的探究。

4.1 磁性分離菌體

如果不進(jìn)行增菌或者分離，直接對肉類樣品進(jìn)行處理后提取核酸進(jìn)行PCR檢測，達(dá)不到較好的靈敏度。眾多報道[16-17]表明，蛋白質(zhì)、短肽、脂肪、多糖、氨基酸、金屬離子、鹽濃度、pH、酚類等物質(zhì)，以及樣品的黏稠度都會影響PCR的靈敏度。因為抽提核酸過程無法排除所有干擾物。磁性納米粒子分離致病菌回收率并不是很高，但能有效減少PCR的干擾物，而理論上，PCR可以在極短時間內(nèi)將幾個拷貝的靶DNA特異地擴(kuò)增上百萬倍。大多數(shù)應(yīng)用于分離的磁性材料具有超順磁性，即在通常情況下沒有磁力，而在外加磁場下表現(xiàn)出磁性。在沒有磁場的情況下可以充分地分散在溶液中，與目標(biāo)物相互結(jié)合，之后在外加磁場下聚集于容器一側(cè)，只需要棄去溶液和洗滌就可以最大限度地排除抑制物，而少量的磁性收集物就是高濃度的目標(biāo)分離物。磁性材料只是載體，只有標(biāo)記上能夠識別菌體的生物分子才能進(jìn)行捕獲，目前能夠充當(dāng)識別材料的生物分子一般有抗體、適配體、小分子材料、核酸探針等。

4.1.1 免疫磁珠分離致病菌 免疫磁珠是指標(biāo)記了抗致病菌抗體的磁珠，抗致病菌抗體與致病菌通過抗原抗體反應(yīng)相互結(jié)合，利用磁性材料的磁性可以達(dá)到將致病菌分離與富集的目的。免疫磁珠分散于食品處理液中充分混合，然后用外加的磁鐵將結(jié)合了致病菌的免疫磁珠吸附于容器一側(cè)，棄去溶液，提取磁性富集之后致病菌中的核酸，就可以進(jìn)行PCR檢測。免疫磁珠和PCR技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用既能實現(xiàn)快速檢測，又具有較高的靈敏度。Chen等[18]用免疫磁珠分離嬰幼兒奶粉中的阪崎腸桿菌，結(jié)合PCR檢測，無需增菌靈敏度可以達(dá)到5.2×102CFU/mL。Amagliani等[19]用免疫磁珠分離檢測乳制品中的單增李斯特菌，結(jié)合PCR檢測，靈敏度可以達(dá)到10 CFU/mL。Luo等[20]用免疫磁珠分離巴氏殺菌奶中的單增李斯特菌，結(jié)合PCR檢測，檢測限為80 CFU/mL。

4.1.2 標(biāo)記了適配子的磁性粒子分離致病菌 核酸適配子是一小段經(jīng)體外篩選(SELEX技術(shù))得到的寡核苷酸序列，能與相應(yīng)的配體進(jìn)行高親和力和強(qiáng)特異性的結(jié)合。在某種意義上來說，適配子和抗體的功能類似，都可以特異性地和目標(biāo)物相互結(jié)合，不同的是：抗體是由氨基酸序列組成，而適配子是由核苷酸序列組成；抗體通過免疫動物機(jī)體得到，適配子通過體外多輪篩選獲得。相對于抗體來說，適配子經(jīng)過篩選之后就可以穩(wěn)定地合成，可以最大限度地保證相應(yīng)產(chǎn)品的批次誤差最小化。Suh等[21]用適配體標(biāo)記的磁珠結(jié)合qPCR檢測空腸彎曲桿菌發(fā)現(xiàn)檢測限比免疫磁珠結(jié)合qPCR低1個數(shù)量級。Suh等[22]還用標(biāo)記了適配子的磁珠分離單核細(xì)胞增生李斯特菌結(jié)合PCR檢測，檢測限<60 CFU/500 μL，回收率為26%～77%，而免疫磁珠的回收率為16%～21%。顯然和免疫磁珠相比，磁性適配子分離致病菌更具潛力。

4.1.3 抗菌物質(zhì)標(biāo)記磁性粒子分離致病菌 除了用特異性的磁珠分離相應(yīng)致病菌以外，可以同時分離多種致病菌的分離磁珠也是研究的熱點之一。一些抗菌物質(zhì)能夠抗菌是因為能與致病菌表面的一些生物結(jié)構(gòu)相互結(jié)合，因此，將其與磁性粒子結(jié)合可以起到捕獲致病菌的作用。Kell等[23]研究發(fā)現(xiàn)萬古霉素修飾的磁性納米粒子對革蘭氏陰性菌具有很好的分離效果。Meng等[24]用萬古霉素修飾的磁珠捕獲生菜中的單增李斯特菌，然后用PCR進(jìn)行檢測，檢出限可以達(dá)到 30 CFU/g，在4 h之內(nèi)可以得到檢測結(jié)果。除了萬古霉素之外，其他的能與菌體表面結(jié)合的抗生素或者抗菌物質(zhì)是否也有這種分離能力，可作為后續(xù)致病菌分離的研究方向。

4.1.4 其他磁性粒子分離致病菌 除了上述這些類型的分離磁珠之外，還有一些其他的經(jīng)過改性或者生物標(biāo)記的磁珠用于致病菌分離。Huang等[25]報道了用氨基修飾的硅包Fe3O4磁性納米粒子分離水和飲料中的大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等多種革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌，分離效率可以達(dá)88.5%～99.1%；El-Boubbou等[26]用甘露糖標(biāo)記磁性納米粒子，結(jié)果表明這種磁珠可以在5 min之內(nèi)分離到88%的大腸桿菌；Erin等[27]用載脂蛋白H標(biāo)記磁性納米粒子，用以分離單增李斯特菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌，用qPCR進(jìn)行檢測，分離效率>10%。這些生物分子標(biāo)記的磁珠易于質(zhì)控，雖然它們不能像抗體那樣特異性地區(qū)分某個特定的種屬或者菌株，但是特異性可以由分子檢測來進(jìn)行保證，這種廣泛性更是抗體等無法比擬的，因此，這類磁珠的研究與開發(fā)也會是未來的熱點方向之一。

4.2 磁性分離核酸

4.2.1 非生物標(biāo)記的磁性納米粒子提取基因組核酸 用磁性納米粒子提取致病菌核酸可以減少常規(guī)提取方法的一些步驟(如沉淀、晾干等)，時間更短，也會減少有機(jī)試劑的應(yīng)用。早在1990年，Boom等[28]發(fā)現(xiàn)核酸(包括dsDNA、ssDNA與rRNA等)在高鹽與低pH條件下可以吸附于硅表面，而在低鹽與高pH條件下釋放核酸。帶有磁性的硅包磁性納米粒子則比硅珠更具有快速與簡單分離核酸的優(yōu)勢[29]。Li等[30]發(fā)現(xiàn)多孔的硅包材料具有更強(qiáng)的DNA吸附能力，硅是通過表面與核酸結(jié)合，多孔材料具有更大的總表面積。此外，Chiang等[31]發(fā)現(xiàn)硅包磁性納米粒子也可以很好地分離質(zhì)粒DNA，僅僅8 min就可以完成分離，而且產(chǎn)量比其他方法更高，RNA污染更少。此外，也有嘗試將硅包磁性納米粒子進(jìn)行改性來提高核酸分離能力的。Kang等[32]報道改性的磁性納米粒子顯著提高了DNA的分離能力，比硅包磁性納米粒子高4～5倍。羧基修飾的磁性納米粒子也具有DNA分離能力，和硅包磁性納米粒子類似，羧基修飾的磁性納米粒子也是在高鹽下吸附，在低鹽下解吸附[33]。也有一些研究者將硅包磁性納米粒子吸附了DNA之后的復(fù)合物直接添加到PCR中，Tang等[34]用硅包磁性納米粒子吸附銅綠假單胞菌基因組DNA，經(jīng)過漂洗之后，磁性復(fù)合物直接進(jìn)行巢式PCR，檢測限可以達(dá)到10 CFU/mL。Tang等[35]還用硅包磁性納米粒子吸附綠膿桿菌基因組DNA，漂洗之后磁性復(fù)合物進(jìn)行PCR，再結(jié)合化學(xué)發(fā)光檢測，靈敏度也可以達(dá)到10 CFU/mL。雖然磁性納米粒子會對PCR造成一定的抑制作用，但通過調(diào)整PCR成分會減少這種抑制。與此同時，Bai等[36]發(fā)現(xiàn)氨基化硅包磁性納米粒子吸附DNA更有獨特的優(yōu)勢，在適合PCR的環(huán)境中，氨基化硅包磁性納米粒子可以吸附微量的DNA，將氨基化硅包磁性納米粒子與DNA復(fù)合物直接添加進(jìn)PCR體系可以保證更高的分離效率；將氨基化磁性納米粒子吸附牛奶處理物中的沙門氏菌和單增李斯特菌的基因組DNA，結(jié)合多重PCR檢測，靈敏度均可以達(dá)到10 CFU/mL。同時，Bai等[37-38]還發(fā)現(xiàn)過多的納米粒子會抑制PCR主要是因為納米粒子表面會吸附PCR成分，如果將納米粒子表面進(jìn)行封閉，可以消除這種抑制作用。

4.2.2 標(biāo)記了核酸捕獲探針的磁性粒子分離致病菌的靶標(biāo)序列 除了非生物標(biāo)記的磁性納米粒子提取核酸以外，還有進(jìn)行了核酸序列標(biāo)記的以雜交為基礎(chǔ)的磁性分離方式，進(jìn)行不同的標(biāo)記既可以分離DNA還可分離mRNA。

(1) 磁性雜交捕獲探針分離DNA：雜交捕獲磁珠是在磁性納米粒子上連接20～30個堿基長度的捕獲序列，這段序列和致病菌目標(biāo)序列互補(bǔ)，兩者結(jié)合后進(jìn)行磁性分離，得到的是致病菌的一段靶序列，可以對這段序列直接進(jìn)行PCR檢測。捕獲序列與磁珠之間需要 “間隔臂”連接，適當(dāng)長度的“間隔臂”能保證較好的雜交分離率。Amaglini等[39]用氨基修飾的磁性納米粒子連接21個堿基的捕獲序列，其中，“間隔臂”為6個亞甲基和6個胞嘧啶，磁性分離靶序列，最終結(jié)合PCR檢測。以牛奶中的單增李斯特菌進(jìn)行檢測為例，靈敏度為10 CFU/mL。由于細(xì)菌基因組DNA過于龐大，純化后結(jié)構(gòu)也趨于復(fù)雜，即使經(jīng)過熱變性之后也很難確保目標(biāo)雜交序列保持單鏈裸露狀態(tài)，所以想雜交捕獲10 拷貝如此低的濃度存在一定的難度。

(2) 磁性雜交捕獲探針分離RNA：真核生物的mRNA的3′端存在一段多聚A序列，所以可以通過在磁性粒子上標(biāo)記一段多聚T序列，兩者通過雜交相互結(jié)合，從而達(dá)到磁性分離的目的[40]。但是對于細(xì)菌這樣的原核生物，要么多聚A很短，要么沒有多聚A，因此，這種方法并不適合細(xì)菌的mRNA分離，不過也可以在磁珠上標(biāo)記與目標(biāo)mRNA互補(bǔ)的一段序列捕獲目標(biāo)mRNA。Jacobsen等[41]將一段與沙門氏菌mRNA互補(bǔ)的寡核苷酸標(biāo)記在磁性粒子上，以捕獲沙門氏菌的mRNA序列，然后通過反轉(zhuǎn)錄qPCR進(jìn)行定量檢測，最低檢測限可以達(dá)到5×104CFU/g的水平。磁性核酸探針直接從食品樣品的處理物中分離核酸，減少了核酸純化的步驟，可以簡化檢測過程，縮短檢測時間。這也是快速分離的一個方向，值得更深入的研究。

以上各種磁性分離方法的優(yōu)缺點匯總見表1，總的來說，磁性分離在致病菌前處理方面具有明顯的優(yōu)勢，可以快速有效地去除干擾物與濃縮目標(biāo)物，無論是與分子檢測方法還是其他檢測方法結(jié)合都具有巨大的潛力，是致病菌快速檢測研究的一個重要方面。尤其是基于適配子的磁性分離方法，目前有大量的研究人員將注意力聚焦于此，極有希望基于此開發(fā)大量的商業(yè)化檢測產(chǎn)品。

表1 各種磁性分離方法的優(yōu)缺點匯總

5 結(jié)論與展望

PCR具有極強(qiáng)的體外擴(kuò)增能力，一般可以在1 h左右將幾個拷貝的核酸分子擴(kuò)增到108倍，所以，在生命物質(zhì)的檢測領(lǐng)域非常具有吸引力，如疾病診斷、法醫(yī)鑒定、生物分類、甚至是考古等領(lǐng)域。但是，當(dāng)PCR應(yīng)用于食品樣品中致病菌污染快速檢測時，會遇到新的問題：食品樣品極其復(fù)雜，往往含有大量的PCR抑制物，并且大多數(shù)致病菌污染限量又往往非?？量?，要求不得檢出，也就是說，如何從復(fù)雜的食品介質(zhì)中得到極其微量而純度又高的致病菌核酸是一個難題。所以，前處理在PCR檢測食源性致病菌中具有極為重要的作用。目前大量的檢測食源性致病菌的文章主要是針對PCR本身的優(yōu)化與構(gòu)建，對于前處理的研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。從現(xiàn)有的研究來看，磁性分離在食源性致病菌前處理方面極具潛力，可以最大程度地棄去雜質(zhì)及PCR抑制物，盡可能地捕獲到微量的目標(biāo)物。在今后的發(fā)展中，磁性分離食源性致病菌的高效化、自動化、標(biāo)準(zhǔn)化也是需要努力的方向。

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