糙米酵素混菌發(fā)酵工藝優(yōu)化

張旭普 - 白俊巖 - 劉騰云 - 吳榮榮 - 程書梅 -

(1. 河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，河北 保定 071000；2. 衡水學院生命科學系，河北 衡水 053000)

糙米(Brownrice)是指除了外殼之外都保留的全谷粒，其營養(yǎng)及保健價值均大于精白米[1]，但由于口感較粗，蒸煮耗時，不符合現(xiàn)代人飲食習慣，而加工成精白米造成食物資源浪費達10%～20%[2]。糙米酵素是在糙米中加入蜂蜜、麥芽等，采用酵母等發(fā)酵而成的功能性食品基料。微生物通過本身的中間代謝，使底物產(chǎn)生一系列的生物化學變化，不僅改善了口感[3]，而且在保留原有營養(yǎng)的基礎(chǔ)上又通過微生物代謝產(chǎn)生了很多諸如γ-谷維醇[4-6]、GABA和GSH等[7-8]生理活性物質(zhì)。關(guān)于糙米酵素的研究國外起步較早，日本和美國已有眾多相關(guān)發(fā)酵文獻，部分酵素產(chǎn)品如米乳米露等已經(jīng)面世并廣泛銷往港澳臺等地[2]。中國近年已有糙米酵素的研究報道，較多學者集中探討了糙米酵素合適的發(fā)酵工藝條件，如陳庶來等[1]以還原糖消耗量為指標優(yōu)化了發(fā)酵時間，酵母活化時間及添加量；張麗萍等[2]以酸度及感官評定為指標分別對配方及發(fā)酵工藝作了改進；呂美等[3]以GSH為指標確定了糙米米糠的配比、加水量、蜂蜜添加量及玉米胚油的添加量。

但傳統(tǒng)的糙米酵素發(fā)酵工藝存在幾點缺憾：① 原料未進行滅菌，只靠優(yōu)勢菌種發(fā)酵，發(fā)酵不易控制且易染菌[9]2-3；② 處理工藝未經(jīng)過糖化，很多不具有產(chǎn)淀粉酶的菌株不能有效利用糙米中的碳源，使得發(fā)酵不完全，發(fā)酵劑開發(fā)受限[9]3-5；③ 大部分糙米酵素的發(fā)酵采用固態(tài)或半固態(tài)發(fā)酵，相關(guān)參數(shù)不易控制[2]。本實驗室改進了以上部分工藝，利用釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)與本實驗室保藏的植物乳桿菌L42(Lactobacillusplantarum)混合發(fā)酵[10]，在預試驗的基礎(chǔ)上[11]，利用PB試驗(Plackett-Burman)[12]、最陡爬坡試驗[13-14]和響應面BB試驗(Box-Behnken)[15]對混合發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，旨在較短的發(fā)酵時間內(nèi)獲得理論最大活菌數(shù),以確保GABA與GSH等代謝產(chǎn)物的積累[16-17]。通過改進糖化工藝使多菌種發(fā)酵成為可能，添加滅菌工藝使純種發(fā)酵不易受影響,同時便于活菌計數(shù)排除雜菌干擾，并以活菌量作為發(fā)酵指標進行配方優(yōu)化，旨在為后續(xù)的酵素生產(chǎn)工藝及產(chǎn)物測定研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

釀酒酵母：安琪酵母股份有限公司；

植物乳桿菌L42：由本實驗室篩選及保藏。

1.2 材料與試劑

MRS肉湯：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；

蛋白胨：北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；

酵母浸粉：英國Oxoid公司；

蜂蜜：桂林周氏順發(fā)食品有限公司；

糙米：黑龍江鶴崗市五谷農(nóng)家養(yǎng)生坊；

大麥芽、小麥芽：煙臺市帝伯仕啤酒技術(shù)有限公司；

云南大葉種曬青毛茶葉：云南品潤有限公司；

NaCl、(NH4)2SO4：分析純，天津市福晨化學試劑廠。

1.3 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基(供釀酒酵母種子活化使用)：酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L；

MRS培養(yǎng)基(供植物乳桿菌種子活化使用)：根據(jù)瓶裝說明稱取48 g/L，加熱溶解后分裝，121 ℃高壓滅菌15 min后冷卻備用；

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：洋槐蜂蜜8 g，發(fā)芽糙米粉9 g，小麥芽粉1 g，NaCl為1 g，曬青毛茶粉0.1 g，加水至100 mL，糖化液化后經(jīng)巴氏滅菌冷藏，6 h內(nèi)接種。發(fā)酵液初始pH為5.8，可溶性固形物含量為11.0 °Brix。

1.4 儀器與設(shè)備

水浴恒溫振蕩器：LY20-A型，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；

離心機：LD5-2A型，北京京立離心機有限公司；

潔凈工作臺：SW-CJ-1FD型，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；

生化培養(yǎng)箱：SPX-250B-Z型，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；

酸度計：PHS-25型，上海儀電科學儀器有限公司。

1.5 工藝流程及操作要點

糙米發(fā)芽處理[18-19]→干燥→粉碎(過80目篩)→培養(yǎng)基調(diào)配→糖化液化(升溫程序：37 ℃保溫10 min；52 ℃保溫40 min；65 ℃保溫1 h；78 ℃保溫10 min)[20-22]→冷卻→200目濾布過濾→離心取上清液(4 360×g，時間15 min)→調(diào)配→巴氏殺菌(62 ℃保溫35 min，殺菌強度約62.09 PU)[23]→冷卻→接種→發(fā)酵(12 h)→糙米酵素

1.6 可溶性固形物含量的測定

采用手持阿貝折光儀測定。

1.7 培養(yǎng)方法

用接種環(huán)分別挑取釀酒酵母和植物乳桿菌L42一環(huán)菌種于YPD種子培養(yǎng)基與MRS種子培養(yǎng)基的試管中，充分震蕩，在34 ℃培養(yǎng)箱中分別靜置培養(yǎng)。根據(jù)已測定的生長曲線，在10 h和15 h時分別達到對數(shù)生長期末期取出，以3 mL/100 mL(酵母約1.71×107CFU/mL，乳酸約2.15×108CFU/mL)接種量轉(zhuǎn)接到含有糙米基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，34 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)12 h后取出，梯度稀釋涂布于MRS平板計算活菌數(shù)[24]。

1.8 試驗設(shè)計

1.8.1 PB試驗設(shè)計 在預試驗的基礎(chǔ)上，以7種組分即蜂蜜、糙米、小麥芽、大麥芽、NaCl、(NH4)2SO4和茶作為因素，選用試驗次數(shù)N=9的試驗方法進行PB試驗設(shè)計，2個虛擬變量用于誤差估計，每個因子選取高低兩個水平，高水平是低水平的2倍。根據(jù)結(jié)果分析，選取3個主要影響因素[25]。

1.8.2 最陡爬坡試驗 根據(jù)PB試驗得到的最優(yōu)一階方程，以及實際試驗情況確定3個重要影響因素的爬坡方向和步長，從而得到3個因子的最佳組合濃度范圍以逼近最大響應區(qū)域[26]。

1.8.3 響應面試驗設(shè)計(RSM) PB試驗確定了3個主要影響因素，最陡爬坡試驗確定了最大響應區(qū)域以及響應區(qū)域的中心點，根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計原理，取3個主要影響因素的3個水平，設(shè)計3因素3水平的Box-Behnken試驗[27-29]。

1.8.4 數(shù)據(jù)分析 試驗處理均包含3個平行試驗，取值為3個試驗的平均值。Plackett-Burman試驗設(shè)計和Box-Behnken試驗設(shè)計采用Design Expert.V8.0.6軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗篩選重要影響因素

Plackett-Burman試驗因素和水平見表1。以活菌數(shù)(Y1)為響應值，試驗設(shè)計及響應值見表2。各因素的影響效果見表3。

表1 Plackett-Burman試驗因素和水平

表2 Plackett-Burman試驗設(shè)計及響應值

表3 Plackett-Burman試驗各因素對活菌數(shù)的影響效果

由表3可知，該模型高度顯著(0.01蜂蜜>NaCl>大麥芽>小麥芽>茶葉>(NH4)2SO4，糙米具有極顯著影響(P<0.01)，蜂蜜和NaCl具有高度顯著效應(0.01

Y1=+3.91-0.46F1+0.59F2-0.15F3+0.29F4-0.43F5-0.023F6-0.042F7。

(1)

該方程擬合R2=0.939 1，能較好地模擬和解釋PB試驗的結(jié)果。本模型的精密度(Adeq Precision)為9.965>4，從而進一步說明該模型較為可靠。

2.2 最陡爬坡試驗逼近最大響應區(qū)域

根據(jù)PB試驗得到的最優(yōu)一階方程可知，對活菌數(shù)有正效應的因素為糙米和大麥芽，說明這2個因素在高水平時混菌增殖更為有利。對活菌數(shù)有負效應的因素為蜂蜜、小麥芽、NaCl、(NH4)2SO4和茶葉，說明這5個因素在低水平時對混菌增殖更為有利。各試驗因素對響應值Y1影響的顯著性順序為糙米>蜂蜜>NaCl>大麥芽>小麥芽>茶葉>(NH4)2SO4，其中糙米、蜂蜜和NaCl為顯著影響因素，糙米應在現(xiàn)有質(zhì)量濃度上繼續(xù)增大，蜂蜜和NaCl應在現(xiàn)有質(zhì)量濃度上繼續(xù)減少，其余因素按照其正負效應選取適當濃度，即大麥芽、小麥芽、茶葉和(NH4)2SO4質(zhì)量濃度分別為0.25，0.50，0.025，0.50 g/100 mL設(shè)計最陡爬坡試驗，水平和結(jié)果見表4。

表4 最陡爬坡試驗路徑設(shè)計及結(jié)果

在第5組試驗即蜂蜜、糙米、NaCl添加量分別為3.00，10.50，0.25 g/100 mL時，活菌數(shù)最大，因此選取第5組試驗中各顯著影響因子濃度作為響應面試驗的中心點。

2.3 Box-Behnken試驗設(shè)計

根據(jù)Plackett-Burman試驗獲得的3個重要影響因素以及最陡爬坡試驗得到的最佳質(zhì)量濃度，分別選取3個水平，以活菌數(shù)作為響應值(Y2)設(shè)計3因素3水平的Box-Behnken試驗。各因素及水平見表5，試驗設(shè)計及結(jié)果見表6。

表5 Box-Behnken試驗因素及水平

表6 Box-Behnken試驗設(shè)計及響應值

2.3.1 二次回歸模型與方差分析 通過軟件Design Expert.V8.0.6對BB試驗17組數(shù)據(jù)進行回歸分析，并經(jīng)過回歸方程擬合，得到各試驗因子對響應值影響的函數(shù)表達式為：

Y2=+5.35+0.10A+0.13B-0.030C+0.11AB-0.17AC+0.22BC-0.43A2-0.37B2-0.22C2。

(2)

利用方差分析對回歸方程進行F檢驗，F(xiàn)值為16.52，且大于F的概率低于0.000 6，說明該方程是顯著的，模型可信度高。其中A、B、AC、BC、A2、B2、C2對響應值影響顯著，表明三因素對試驗結(jié)果的影響不是簡單的線性關(guān)系，模型的R2=0.955 0，調(diào)整后為0.897 2，說明該模型能較好地模擬和驗證試驗結(jié)果，預測擬合度Pred-R2為0.814 2，說明它與校正決定系數(shù)保持一致，能夠解釋試驗結(jié)果；變異系數(shù)C.V.%=2.56，置信度比較高；本模型精密度(Adeq Precision)=10.199>4，說明模型可以反映真實的試驗值。Box-behnken試驗方差分析見表7。

為直觀說明蜂蜜、糙米和NaCl對于混菌發(fā)酵活菌數(shù)的影響，運用軟件Design Expert.V8.0.6做出3個重要影響因子之間交互作用的響應曲面圖和等高線圖，見圖1～3。

表7 Box-Behnken試驗方差分析?

?R2為0.955 0；Adj-R2為0.897 2；Pred-R2為0.814 2。

圖1 糙米與蜂蜜對活菌數(shù)交互影響的曲面圖和等高線圖Figure 1 The surface and contour maps of the interaction effects of brown rice and honey on Y2

圖2 蜂蜜和NaCl對活菌數(shù)交互影響的曲面圖和等高線圖Figure 2 The surface and contour maps of the interaction effects of honey and NaCl on Y2

圖3 糙米和NaCl對活菌數(shù)交互影響的曲面圖和等高線圖Figure 3 The surface and contour maps of the interaction effects of brown rice and NaCl on Y2

2.3.2 重要影響因素最終質(zhì)量濃度的確定及結(jié)果驗證 通過Design Expert.V8.0.6分析可知蜂蜜、糙米和NaCl最佳編碼值分別為0.756，0.198，-0.260，分別對應實際值為3.38，10.71，0.24 g/100 mL，為了驗證模型準確性，采取優(yōu)化后的增殖培養(yǎng)基即蜂蜜3.38 g/100 mL、糙米10.70 g/100 mL、NaCl 0.24 g/100 mL、小麥芽0.25 g/100 mL、大麥芽0.50 g/100 mL、(NH4)2SO40.50 g/100 mL、茶葉粉0.025 g/100 mL 進行混菌發(fā)酵12 h，含有活菌數(shù)為5.35×107CFU/mL，基本與響應面預測的活菌數(shù)(5.21×107CFU/mL)接近，是基礎(chǔ)糙米酵素培養(yǎng)基活菌數(shù)(5.71×106CFU/mL)的9.37倍。

3 結(jié)論

目前糙米酵素大多只采用酵母單菌發(fā)酵且工藝流程相對簡單，難以進行科學量化評價。本試驗在前人探究的基礎(chǔ)上增加了糖化和巴氏滅菌工藝，并對釀酒酵母和植物乳桿菌混合發(fā)酵作了相關(guān)研究，確定蜂蜜、糙米、NaCl、小麥芽、大麥芽、(NH4)2SO4、茶葉粉添加量分別為3.38，10.71，0.24，0.25，0.50，0.50，0.025 g/100 mL。由試驗結(jié)果可知蜂蜜、糙米和NaCl的比例和交互作用對混菌活菌數(shù)影響較大，說明合適的碳氮比，滲透壓以及生長因子的作用是酵母和植物乳桿菌發(fā)酵良好的關(guān)鍵。本研究可為混菌發(fā)酵糙米酵素提供參考，同時為發(fā)酵生產(chǎn)相關(guān)產(chǎn)品提供試驗基礎(chǔ)與理論依據(jù)。

但由于本試驗采用涂布平板進行菌落計數(shù)，操作繁瑣且容錯率低，后續(xù)試驗可考慮采用活菌染色后顯微鏡計數(shù)以加強試驗模型精確度；同時本試驗僅以活菌數(shù)為指標來評價酵素產(chǎn)品發(fā)酵工藝，對得出的產(chǎn)品中生理活性物質(zhì)未進行研究，后續(xù)可對此進行更深入的研究，從而優(yōu)化得到功能性與口感風味兼顧的平衡功能性飲料。

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