白及萃取物的抑菌活性及其二氯甲烷萃取物化學成分分析

吳永祥 - 程滿懷 - 江海濤 - 侯書增 - 萬志兵 -

(1. 黃山學院生命與環(huán)境科學學院，安徽 黃山 245041；2. 黃山學院分析測試中心，安徽 黃山 245041)

白及 [Bletillastriata(Thunb.) Reichb. f.] 又名白根、紫蘭、地螺絲等，為蘭科植物白及的干燥塊莖。白及廣泛分布于中國長江流域，主產于安徽、浙江、江蘇、云南、四川等地，有很高的藥用價值，具有補肺、收斂止血、消腫、生肌等功效，可用于治療肺傷咳血、瘡瘍腫毒、外科創(chuàng)傷、胃及消化道潰瘍疼痛等癥狀[1-2]?，F代藥理研究表明：白及的主要化學成分是聯芐類[3]、菲類及其衍生物[3]、多酚類[4]、黃酮類[5]、多糖[6]等，具有抗腫瘤[7]、抗病毒[8]、抗氧化[9]、抗炎癥[5]、抑制酪氨酸酶[10]及促進創(chuàng)傷愈合[11]等作用。國內外學者對白及的研究主要集中在多糖及其抗氧化方面[6-7,9]，對白及不同極性萃取物抑菌活性的研究仍然缺乏，關于白及活性成分分離與化學成分分析的研究尚未見報道。

隨著對羥基苯甲酸丙酯 (Propylparaben, PP)、苯甲酸、苯甲酸鈉鹽等食品防腐劑在食品工業(yè)的廣泛應用，雖然在抑制微生物生長，防止食品品質劣變等方面有顯著效果，但是這些人工合成的防腐劑對人體存在著潛在的危害，甚至引發(fā)癌癥[12-13]。研究開發(fā)安全、高效、天然抑菌劑的形勢日趨緊迫。本研究以白及為原料，采用甲醇回流提取，并依次用正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水對其進行萃取，得到5種不同極性萃取物，探討各萃取物的抑菌效果，采用GC-MS研究抑菌活性最顯著萃取物的化學成分，挖掘白及作為新的抗菌藥物的開發(fā)潛力，旨在為其在食品和藥品方面的研究與應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

白及：2016年10月于安徽省黃山市祁門縣采集；

大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)：武漢大學微生物保藏中心；

蛋白胨、牛肉膏、瓊脂等生物試劑：北京陸橋技術有限責任公司；

二甲基亞砜、甲醇、正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇等：分析純，南京化學試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

氣相色譜—質譜聯用儀：Agilent HP7890-5975C型，美國Agilent公司；

全波長酶標儀：SpectraMax-190型，美國Molecular Devices公司；

旋轉蒸發(fā)儀：EV341型，北京萊伯泰科儀器有限公司；

超純水儀：Sartorius arium comfort II型，德國賽多利斯集團；

超凈工作臺：DL-CJ-1N型，北京東聯哈爾儀器制造有限公司；

不銹鋼立式電熱蒸汽消毒器：YM50Z型，上海三申醫(yī)療器械有限公司。

1.2 方法

1.2.1 白及各萃取物的制備 將新鮮白及洗凈晾干，于60 ℃ 烘干至恒重，粉碎過80目篩，得白及粉末。稱取白及粉末，按照料液比1∶10 (g/mL)加入甲醇，60 ℃恒溫回流提取3 h，重復3次，抽濾后經旋轉蒸發(fā)濃縮，得到白及甲醇提取物。將甲醇提取物以1∶10 (g/mL)混懸于蒸餾水中，依次用等體積正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取3次，經旋轉蒸發(fā)濃縮，真空冷凍干燥得到正己烷萃取物、二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水層剩余物。準確稱取上述樣品，用二甲基亞砜溶解，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌種活化與菌懸液制備 將受試菌接種到新鮮斜面培養(yǎng)基上進行活化，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。取活化好的菌種用生理鹽水配置成濃度為106～107CFU/mL的菌懸液[14-15]，振蕩搖勻，4 ℃保存待用。

1.2.3 濾紙片法測定各萃取物的抑菌作用 在超凈工作臺中，將滅菌好的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，冷卻凝固后，吸取制備好的菌懸液100 μL于培養(yǎng)皿上，均勻涂布。用移液槍于無菌直徑6 mm的濾紙片中央加入10 μL濃度為10 mg/mL的白及各萃取物，以二甲基亞砜為空白對照組 (control)，以對羥基苯甲酸丙酯為陽性對照組 (positive control, PP)。將處理好的培養(yǎng)皿倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)后用游標卡尺采用十字交叉法測定抑菌圈直徑(mm)，結果重復3次，取平均值。

1.2.4 最小抑菌濃度測定 將白及的甲醇提取物、正己烷和二氯甲烷萃取物分別配制成2，5，10，15，20 mg/mL不同濃度的樣品溶液，然后參照文獻[16～17]的方法，觀察各平板抑菌圈的有無，首次出現抑菌圈所對應的二氯甲烷萃取物的濃度即為MIC。

1.2.5 GC-MS化學成分分析 色譜條件：色譜柱為HP-5 MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm) 的彈性石英毛細管柱；色譜柱初始溫度60 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升至280 ℃，保持10 min；載氣為高純氦氣 (99.999%)，載氣流速1.0 mL/min；無分流進樣，進樣量0.5 μL。 質譜條件：離子源為EI，離子源溫度230 ℃；四級桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；質量掃描范圍35～450 amu；采用NIST08標準譜庫進行檢索。

1.3 統計學分析

采用SPSS 18.0統計分析軟件對數據進行單因素方差分析 (One-way ANOVA)，利用Duncan’s多重比較法分析樣本間的差異顯著性，P<0.05認為樣本間具有顯著性差異。所有試驗重復3次，結果表示為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 白及不同極性萃取物的抑菌效果

由表1可知，除乙酸乙酯、正丁醇和水萃取物無明顯抑制作用外，白及的甲醇提取物、正己烷和二氯甲烷萃取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和綠膿桿菌均有較強的抑制作用，以二氯甲烷萃取物的抑菌活性最顯著(P<0.05)。當二氯甲烷萃取物濃度為10 mg/mL時，對受試菌的抑菌圈直徑分別為大腸桿菌 (13.00±0.71) mm，金黃色葡萄球菌 (10.13±0.48) mm，枯草芽孢桿菌 (12.75±0.50) mm，綠膿桿菌 (12.88±0.25) mm。 陽性對照組PP 在濃度為1 mg/mL條件下，對受試菌的抑菌圈直徑分別為大腸桿菌 (11.50±0.82) mm，金黃色葡萄球菌 (11.13±0.48) mm，枯草芽孢桿菌 (12.38±0.25) mm，綠膿桿菌 (12.00±0.71) mm。由此可知，二氯甲烷萃取物和陽性對照PP對4種受試菌均具有顯著的抑制作用，其中白及二氯甲烷萃取物對革蘭氏陰性細菌的抑制效果優(yōu)于革蘭氏陽性細菌。

表1 白及不同極性萃取物對4種菌的抑菌圈直徑?

? 萃取物濃度為10 mg/mL；同列不同上標字母表示在統計學上具有顯著差異(P<0.05)。

2.2 白及活性萃取物的最小抑菌濃度

為了定量研究白及活性萃取物對食品中常用菌的抑制效果，本試驗進一步測定了其最小抑菌濃度(MIC)，其中不同濃度的甲醇提取物、正己烷和二氯甲烷萃取物對4種受試菌的抑制效果見圖1。由圖1可知，白及活性萃取物對4種受試菌的抑菌圈直徑與濃度呈顯著正相關，在2～20 mg/mL 時，二氯甲烷萃取物對綠膿桿菌的抑菌圈直徑分別為 (10.88±0.48)，(12.13±1.31)，(12.88±0.25)，(13.75±0.65)，(14.00±0.41) mm。白及甲醇提取物對大腸桿菌、綠膿桿菌的MIC為2 mg/mL，對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的MIC為5 mg/mL；正己烷萃取物對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和綠膿桿菌的MIC為2 mg/mL，對金黃色葡萄球菌的MIC為5 mg/mL；二氯甲烷萃取物對4種受試菌的MIC均為2 mg/mL。表明白及活性萃取物抑菌作用排序為二氯甲烷萃取物>正己烷萃取物>甲醇提取物。

2.3 白及二氯甲烷萃取物化學成分的GC-MS分析

采用GC-MS對白及不同極性萃取物中抑菌作用最顯著的二氯甲烷萃取物進行化學成分分析，得到二氯甲烷萃取物化學成分的總離子流圖，結果見圖2。各組分峰用NIST08質譜庫進行檢索，從二氯甲烷萃取物中共鑒定出11種化合物，占總峰面積量的94.16%。鑒定匹配度高于80%的化學成分，按峰面積歸一化法計算出各化學成分的相對含量，結果見表2。二氯甲烷萃取物含有芳香族、酯、酮、有機酸、醇類等多種成分，以芳香族、酯、酮、有機酸類為主，其中含有4種芳香族化合物(42.85%)、3種酯類化合物(35.11%)、2種酮類化合物(11.70%)、1種有機酸(3.86%)。二氯甲烷萃取物中含量較高成分有2-甲基-3,4-苯并菲(39.97%)、高香蘭酸乙酯(25.25%)、反式-4′-氟-4-甲硫基查耳酮(9.44%)、癸二酸二異辛酯(7.34%) 和亞油酸(3.86%) 等。

3 結論

經過以上試驗可知，除乙酸乙酯、正丁醇和水萃取物無明顯抑制作用外，白及的甲醇提取物、正己烷和二氯甲烷萃取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌和綠膿桿菌均具有較強的抑制作用，且隨著萃取物濃度的增加，其抑菌作用不斷增強。二氯甲烷萃取物的抑菌活性最顯著，其對4種受試菌的最小抑制濃度均為2 mg/mL。GC-MS分析結果顯示，二氯甲烷萃取物的主要化學成分以芳香族、酯、酮、有機酸類化合物為主，其中含量較高成分有2-甲基-3,4-苯并菲(39.97%)、高香蘭酸乙酯(25.25%)、反式-4′-氟-4-甲硫基查耳酮(9.44%)、癸二酸二異辛酯(7.34%) 和亞油酸(3.86%) 等。研究[18-19]發(fā)現高香蘭酸乙酯、亞油酸等化合物能夠有效地抑制微生物的生長。二氯甲烷萃取物中高含量的芳香族、酯、有機酸類化合物可能是其抑菌活性的物質基礎[20-21]，但未知的是哪種或哪幾種成分發(fā)揮主要作用，需進一步分離純化，以篩選出更加明確有效的抑菌活性成分。本研究表明白及二氯甲烷萃取物有一定的藥學研究價值和作為天然食品防腐抑菌劑的潛能。

圖1 白及活性萃取物對4種菌的抑菌圈直徑

Figure 1 Diameter of inhibitory zone of active fractions ofB.striataagainst four common bacterial strains

圖2 白及二氯甲烷萃取物的GC-MS總離子流圖Figure 2 Total ion chromatogram of dichloromethane fraction of B.striata表2 白及二氯甲烷萃取物的化學成分及其相對含量

Table 2 Chemical constituents and relative contents of dichloromethane fraction ofB.striata

序號保留時間/min化合物相對含量/%130．62832，4?二叔丁基苯酚0．27235．1579β?桉葉醇0．64346．8272亞油酸3．86449．80554?甲氧基苯基磷酸二乙酯2．52550．8899高香蘭酸乙酯25．25651．50734?乙基?2?甲氧基苯酚1．75753．39082?甲基?3，4?苯并菲39．97854．09133?甲基?3，4?苯并菲0．86954．3715反式?4′?氟?4?甲硫基查耳酮9．441055．8865癸二酸二異辛酯7．341156．34835，6，7，8?四氫?2?甲氧基?5，5?二甲基蒽?1，4?二酮2．26

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