數(shù)字圖像法測定養(yǎng)殖水中的孔雀石綠*

俞巧玲，袁金濤，陳艷萍，周全

(鄭州大學公共衛(wèi)生學院，鄭州 450001)

數(shù)字圖像法測定養(yǎng)殖水中的孔雀石綠*

俞巧玲，袁金濤，陳艷萍，周全

(鄭州大學公共衛(wèi)生學院，鄭州 450001)

建立一種簡單、可靠的養(yǎng)殖水可孔雀石綠的數(shù)字圖像檢測方法。以1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽離子液體富集水樣品，再用手機拍照獲取樣品信息，最后用數(shù)字圖像結(jié)合多層感知器神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)定量分析孔雀石綠的含量。該法測定結(jié)果的相對標準偏差不大于6%（n=5），加標回收率為97.8%～103.0%。該方法可用于養(yǎng)殖水可孔雀石綠的含量測定。

孔雀石綠；數(shù)字圖像法；多層感知器神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)；漁業(yè)養(yǎng)殖水

孔雀石綠具有致突變、致畸和致癌作用［1］，多數(shù)國家已宣布禁止在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用孔雀石綠［2］。自從孔雀石綠被禁用后，水霉病的防治一直沒有較好的替代藥物，而水霉病是我國水產(chǎn)養(yǎng)殖中的一種常見病，可造成較大的損失，因此一些養(yǎng)殖戶不得不用孔雀石綠去防治該?。?］。另外，在孔雀石綠被禁用前，一些養(yǎng)殖場已使用過孔雀石綠，而養(yǎng)殖水體與底泥中的孔雀石綠殘留在較長一段時間內(nèi)保持動態(tài)平衡，即殘留在底泥中的孔雀石綠會少量釋放到水體中，對養(yǎng)殖魚類產(chǎn)生二次污染［4］。除漁業(yè)因使用孔雀石綠污染養(yǎng)殖水體外，作為一種工業(yè)染料，孔雀石綠還易通過工業(yè)廢水的排放直接或間接地污染養(yǎng)殖水。因此建立檢測養(yǎng)殖水體中孔雀石綠微量殘留的方法具有重要意義［5-8］。

作為一項新興檢測技術(shù)，數(shù)字圖像法已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學、交通、航空及軍事等領(lǐng)域，而用于化學定量分析方面的研究還不多［9-11］。簡單、便捷且易推廣的養(yǎng)殖水體檢測方法對養(yǎng)殖戶和監(jiān)測部門具有重要的現(xiàn)實意義。如今的數(shù)碼相機和智能手機攝像頭具有操作簡單、拍攝效果良好等優(yōu)點，但因其不能像分光光度計一樣分光，從而限制了它在分析化學中的應(yīng)用。但根據(jù)三基色(RGB)原理，各種顏色是由紅、綠、藍3色按照不同比例合成產(chǎn)生的，應(yīng)用RGB原理提取溶液照片的紅、綠、藍三種基色的信息后，與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等方法結(jié)合仍可以對測試對象進行分析定量［12］。筆者采用數(shù)字圖像結(jié)合多層感知器神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(Multilayer Perceptron Neural Network，MLP NN)測定養(yǎng)殖水中的孔雀石綠，為孔雀石綠定量分析提供一種快速、簡便、可靠的方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

智能手機：紅米3S型，小米科技有限責任公司；

臺燈：KLT SB-519型，東莞快靈通卡西尼電子科技有限公司；

亞克力板：厚度為3 mm，乳白色；

分析天平：FA1204B型，上海精密科學儀器有限公司天平儀器廠；

玻璃比色皿：光程為1 cm；

Image J軟件：美國國家健康研究所；

1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽(［Hmim］BF4)：國藥集團化學試劑有限公司；

六氟磷酸銨(NH4PF6)：國藥集團化學試劑有限公司；

結(jié)晶紫：天津市眾聯(lián)精細化學品開發(fā)有限公司；

孔雀石綠：天津市致遠化學試劑有限公司；

實驗所用試劑均為分析純；

實驗用水為超純水（Milli-Q超純水系統(tǒng)制得）。

1.2 自制裝置

以家用普通臺燈排列整齊的LED陣列部分（6 cm×6 cm）為光源，在距LED陣列5 cm處放一塊乳白色亞克力板，LED陣列與亞克力板之間用不透光紙板圍成四壁，構(gòu)成一個6 cm×6 cm×5 cm燈箱。玻璃比色皿緊貼亞克力板放置，手機距比色皿12 cm處用默認拍照參數(shù)拍照。

1.3 實驗方法

取50 mL含一定量孔雀石綠標準溶液的樣品或經(jīng)過濾的待測樣品，置于離心管中，加入300 μL［Hmim］BF4和0.65 g NH4PF6后充分振蕩混勻，在轉(zhuǎn)速為4 000 r／min、溫度為5℃的離心機內(nèi)離心10 min，棄去上清液后離子液體富集相用乙腈定容至0.5 mL，最后取澄清溶液于比色皿中，用手機拍照。

1.4 圖像數(shù)據(jù)處理

為避免邊緣部分干擾，截取溶液中心部分圖像（20 px×20 px）提取RGB信息，用Image J軟件讀取每個樣品在R，G和B三個顏色通道的信息，可獲得三個矩陣（20 px×20 px），然后將每個矩陣展開為矢量（1 px×400 px），最后將三個顏色通道矢量按R，G，B順序衍接成一個長矢量（1 px×1 200 px），并用主成分分析法提取主成分。

2 結(jié)果與討論

2.1 數(shù)碼成像三基色與孔雀石綠濃度關(guān)系

孔雀石綠的顏色隨著其濃度增加而變化，且呈現(xiàn)一定的變化趨勢。由于純白色（R，G，B值均為255）背景光源獲得較困難，采用數(shù)字處理扣除背景顏色的干擾，得到相對于0 μg／mL濃度各濃度溶液R，G，B 3種顏色的相對強度值，見圖1。由圖1可見，數(shù)碼成像后的R，G，B相對強度值隨孔雀石綠的質(zhì)量濃度變化而變化，并呈現(xiàn)出一定的變化趨勢，這表明R，G，B相對強度值可以反映孔雀石綠的濃度變化。

圖1 不同濃度孔雀石綠3個顏色通道的相對強度變化

2.2 實驗條件的優(yōu)化

2.2.1 離子液體用量

當孔雀石綠含量較低時，對目標物進行富集是一個關(guān)鍵步驟。本實驗采用親水性離子液體［Hmim］BF4作為萃取劑，NH4PF6作為陰離子配對劑，在溶液中生成疏水性離子液體［Hmim］PF6，用［Hmim］PF6進行萃取。研究發(fā)現(xiàn)［Hmim］BF4和NH4PF6物質(zhì)的量比為1∶3時萃取效果最佳，因此將［Hmim］BF4和NH4PF6物質(zhì)的量比固定為1∶3。［Hmim］BF4的用量分別取200～400 μL，考查不同［Hmim］BF4用量時萃取液的吸光度，結(jié)果如圖2。由圖2可知，萃取液的吸光度隨著［Hmim］BF4用量體積的增大而提高，當［Hmim］BF4的用量由300 μL提高到350 μL時，吸光度基本不變。因此本實驗選擇［Hmim］BF4的用量為300 μL。

圖2 不同［Hmim］BF4用量時的吸光度

2.2.2 網(wǎng)絡(luò)模型參數(shù)確定

以MLP NN建立一個3層的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)［13-14］，包括輸入層、隱含層、輸出層。

按前述圖像處理方法，每個樣品共采集400個數(shù)據(jù)點，這些數(shù)據(jù)中每個顏色通道都有400個數(shù)據(jù)點，冗余信息多，對收集的所有樣本數(shù)據(jù)組成的矩陣進行主成分分析，發(fā)現(xiàn)前3個主成分的特征根貢獻率已達95.3%，因此取前3個主成分作為MLP NN的輸入數(shù)據(jù)，即輸入層節(jié)點數(shù)為3。

隱藏層節(jié)點數(shù)在進行模型訓練時確定。為了得到穩(wěn)健的模型，將樣本隨機劃分為訓練集和驗證集，其中15個樣品為訓練集樣本，10個樣品作為預測集。經(jīng)參數(shù)優(yōu)化后，隱含層數(shù)為1，其激活函數(shù)為hyperbolic tangent，輸出層也為1層，激活函數(shù)為identity。學習算法采用gradient descent算法，誤差函數(shù)使用sum of squares函數(shù)。經(jīng)過多次計算，最終應(yīng)用Fast Artifi cial Neural Network (FANN) library建立了一個結(jié)構(gòu)為3-11-1的3層MLP NN模型［15］。

2.3 加標回收試驗與比對試驗

向5個不含孔雀石綠的空白養(yǎng)殖水樣品中加入孔雀石綠標準溶液制成模擬樣品，檢測并計算孔雀石綠的加標回收率，每種濃度的加標樣品溶液同時用手機和分光光度計分別重復測定5次，結(jié)果見表1。由表1可知，采用數(shù)字圖像法測定單個樣品的相對標準偏差為1.4%～6.0%（n=5）內(nèi)，加標回收率為97.8%～103.0%。采用傳統(tǒng)的分光光度計檢測，測定結(jié)果的相對標準偏差為1.4%～6.9%（n=5），加標回收率為96.0%～101.3%（n=5）。經(jīng)配對t檢驗，兩種方法無統(tǒng)計學差異。

表1 模擬樣品中孔雀石綠檢測結(jié)果

2.4 檢測范圍、檢出限和干擾物質(zhì)

應(yīng)用數(shù)字圖像法，孔雀石綠純?nèi)芤簷z測范圍為0～20.0 μg／mL，當含有其它色素成分干擾時，檢測范圍會變窄。利用7個平行空白樣本求得方法檢出限為68.0 ng／mL。試驗了另一種養(yǎng)殖中常用魚藥結(jié)晶紫對孔雀石綠測定結(jié)果的干擾，發(fā)現(xiàn)20倍濃度的結(jié)晶紫對孔雀石綠檢測結(jié)果的影響小于5%。

3 結(jié)語

采用數(shù)字圖像結(jié)合MLP NN法，建立了測定養(yǎng)殖水中孔雀石綠濃度的新方法。本方法采用智能手機獲取樣本信息，經(jīng)過主成分分析后，前3個主成分就可代表樣本的顏色信息，據(jù)此建立一個結(jié)構(gòu)為3-11-1的3層MLP NN模型，該模型對加標樣本回收率達到97.8%～103.0%。上述結(jié)果表明，數(shù)字圖像法結(jié)合主成分分析和MLP NN測定養(yǎng)殖水中的孔雀石綠簡便可行，為孔雀石綠的簡便快速檢測提供了新思路。

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Determination of Malachite Green in Fishing Water by Digital Image Analysis

Yu Qiaoling, Yuan Jintao, Chen Yanping, Zhou Quan
(College of Public Health, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, China)

A simple and stable method for determing malachite green in fishing water was established based on digital image analysis. The fishing water samples were pretreated by ionic liquid of 1-hexyl-3-methyl-imidazolium tetrafluoroborate, and then the sample information was detected from the image taken by cell phone. The concentration of malachite green was determined by digital image analysis and multilayer perceptron neural network. The relative standard deviation for fishing water samples by this method was not more than 6%(n=5), and the average recoveries were in the range of 97.8%-103.0%. This method was suitable for determination of malachite green in fishing water.

malachite green; digital image analysis; multilayer perceptron neural network; fishing water

O657.3

:A

:1008-6145(2017)02-0028-03

10.3969／j.issn.1008-6145.2017.02.007

*鄭州大學大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目

聯(lián)系人：袁金濤；E-mail： jtyuan@zzu.edu.cn

2017-02-16