血府逐瘀血清對大鼠背根神經(jīng)元缺氧損傷的保護作用的研究

劉大凱 王罡 趙鋼 遲曉飛

脊髓損傷是周圍神經(jīng)損傷, 是臨床常見病之一, 嚴重影響了人類健康及生活質(zhì)量, 不同程度的的損傷主要由于外傷所致［1］, 目前臨床治療缺乏特效藥物, 加快周圍神經(jīng)再生的速度一直是基礎(chǔ)和神經(jīng)研究工作者的研究目標［2］。血府逐瘀, 湯為活血化瘀中藥, 由桃仁、紅花、當歸、川芎、生地、白芍、丹參、牛膝等構(gòu)成, 宜疏通督脈, 活血化瘀。有研究顯示, 血府逐瘀湯能夠使兔實驗性頸髓急性損傷神經(jīng)元周圍水腫減輕, 白質(zhì)腫脹減輕, 有明顯微血管再通, 細胞凋亡減少作用［3］。本實驗旨在通過研究血府逐瘀湯含藥血清對背根神經(jīng)元的保護作用來探討血府逐瘀湯的作用機理, 為中醫(yī)藥治療脊髓損傷提供可靠地理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 新生24 h的SD大鼠(由實驗動物中心提供)10只, 雌雄不限, 體質(zhì)量為5～8 g。

1.2 主要實驗試劑及設(shè)備 血府逐瘀血清(醫(yī)院自行配置)、蛋白酶(GIBCO公司)、高糖型DMEM/F12培養(yǎng)基、NGF(Invitrogen公司)、鼠尾膠(杭州生友生物技術(shù)有限公司)、胎牛血清(PAA公司)、逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒［寶生物工程(大連)有限公司］。

1.3 方法

1.3.1 背根神經(jīng)元分離及培養(yǎng) 在無菌的狀態(tài)下, 用乙醚將10只大鼠麻醉后, 切開背部皮膚, 打開錐板, 解剖顯微鏡下取出背根神經(jīng), 放于4℃清洗液后, 剪成1 mm3的碎塊, 移入0.25%的胰蛋白酶的離心管中, 37℃培養(yǎng)箱中進行消化,消化15 min后向試管中加入FBS終止消化并吹打成細胞懸液, 離心10 min, 離心速度為1000 r/min后棄上清, 加入培養(yǎng)基, 將細胞懸液移入未包被的25 cm2的培養(yǎng)瓶中, 37℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)1 h。取未貼壁細胞懸液于另一離心試管中,調(diào)節(jié)細胞濃度為2.5×105個/ml, 分別在包被好鼠尾膠原的96孔的細胞板中。24 h后全量換液, 48 h后加入阿糖胞苷,終濃度為2.5 μg/ml, 繼續(xù)培養(yǎng)背根神經(jīng)元。

1.3.2 建立細胞損傷模型 將培養(yǎng)5 d的神經(jīng)元取出, 吸去培養(yǎng)液, 換上亞硫酸鈉(濃度為0.3 mol/L)的培養(yǎng)基, 放置在37℃, 5%的CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h, 復(fù)氧2 h后開始按2、6、12、24、48 h時間點收集細胞上清進行相關(guān)的實驗。

1.3.3 實驗分組及藥物干預(yù) ①空白對照組：正常培養(yǎng)7 d不進行缺氧損傷；②損傷對照組：建立細胞缺氧損傷模型,在缺氧損傷前24 h給予磷酸緩沖試劑(0.01 mol/L)約10 μl；③空白血清組：建立細胞缺氧損傷模型, 細胞種植3 d后入空血清約10 μl, 1%為最終的濃度；④含藥血清組：建立細胞缺氧損傷模型, 在缺氧損傷前24 h均加入含藥血清(最佳濃度為1.0×10-10mol/L)約10 μl ；⑤神經(jīng)營養(yǎng)因子保護組：建立細胞缺氧損傷模型, 在缺氧損傷前24 h均加入NGF (濃度為 1%)約 10 μl。

1.4 觀察指標及評價標準 ①MDA的測定：MDA含量=(測定管吸光度-標準空白管吸光度) ×標準品濃度/(標準管吸光度-標準空白管吸光度), MDA可以反映脂質(zhì)的過氧化程度, 間接反映細胞損傷程度。②SOD的測定：SOD 活力=(對照吸光度值-測定吸光度值)×2×反應(yīng)體系倍數(shù)/對照吸光度值；SOD可以清除超氧陰離子自由基, 保護細胞受損。③LDH的測定：LDH活力=(測定管OD值-測定空管OD值)×標準濃度×2 μmol/ml×1000 ml/(標準管OD值-標準空白管OD值)。LDH生高代表有大量細胞死亡。④MTT法檢測細胞的存活率, 存活率=(每組試驗組光密度值-空白對照組光密度值)/(陰性對照組光密度值-空白對照組光密度值)×100%；MTT法檢測最終產(chǎn)物越少表明細胞死亡或不活躍, 相反說明細胞越活躍。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示, 采用t檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組MDA含量比較 空白對照組MDA在各個時間點的變化不大, 損傷對照組是各組中同時間點MDA含量最高的。12 h后MDA含量含藥血清組明顯低于空白血清組及損傷對照組, 比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；但含藥血清組與神經(jīng)營養(yǎng)因子保護組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

2.2 各組SOD活力比較 空白對照組各個時間點SOD含量變化不大。同時間點含藥血清組SOD含量明顯高于損傷對照組及空白血清組, 比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；同時間點含藥血清組與神經(jīng)營養(yǎng)因子保護組SOD含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表2。

2.3 各組LDH活力比較 損傷后24 h, 含藥血清組LDH含量明顯低于損傷對照組及空白血清組, 比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05), 但與神經(jīng)營養(yǎng)因子保護組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表 3。

表1 各組MDA的含量測定比較(±s, nmol/ml)

表1 各組MDA的含量測定比較(±s, nmol/ml)

注：與含藥血清組比較, aP＜0.05

組別 2 h 6 h 12 h 24 h空白對照組 1.268±0.028 1.284±0.076 1.559±0.009 2.003±0.019含藥血清組 1.249±0.086 1.279±0.102 1.785±0.043 2.865±0.006空白血清組 1.268±0.072 1.320±0.056 2.236±0.072a 3.698±0.048a損傷對照組 1.456±0.069 1.782±0.089 2.863±0.059a 3.765±0.037a神經(jīng)營養(yǎng)因子保護組 1.272±0.043 1.283±0.027 1.630±0.038 2.378±0.081

表2 各組SOD活力比較(±s, U/ml)

表2 各組SOD活力比較(±s, U/ml)

注：與含藥血清組比較, aP＜0.05

組別 2 h 6 h 12 h 24 h空白對照組 75.30±3.28 70.24±2.08 68.68±3.37 65.45±3.05含藥血清組 60.94±3.08 52.24±3.10 38.89±3.39 31.69±3.49空白血清組 41.20±2.32a 26.01±3.25a 20.19±2.01a 18.76±3.95a損傷對照組 35.92±3.69a 22.63±3.01a 18.56±2.89a 16.97±3.23a神經(jīng)營養(yǎng)因子保護組 62.75±4.82 53.35±3.61 39.60±3.00 32.56±3.42

表3 各組LDH活力比較( ±s, U/L)

表3 各組LDH活力比較( ±s, U/L)

注：與含藥血清組比較, aP＜0.05

組別 24 h 48 h空白對照組 375.30±17.68 487.74±17.08含藥血清組 545.34±20.08 892.24±17.90空白血清組 660.20±21.32a 1167.61±23.25a損傷對照組 782.22±20.09a 1152.63±20.01a神經(jīng)營養(yǎng)因子保護組 489.75±18.84 675.35±20.34

2.4 各組 MTT法檢測細胞存活率 空白對照組細胞存活率為(0.624±0.054), 含藥血清組細胞存活率為(0.529±0.010),空白血清組細胞存活率為(0.229±0.038), 損傷對照組細胞存活率為(0.221±0.034)、神經(jīng)營養(yǎng)因子保護組細胞存活率為(0.548±0.056), 含藥血清組細胞存活率明顯高于空白血清組及損傷對照組, 與神經(jīng)營養(yǎng)因子保護組及空白對照組較為接近。

3 討論

脊髓損傷后軸突的再生和修復(fù)是醫(yī)學(xué)界的一大難題。近10年間, 一系列作用于不同發(fā)病環(huán)節(jié)的藥物已經(jīng)相繼用于動物實驗和臨床, 其中部分已被證明有減輕或阻止繼發(fā)損傷、保留和促進脊髓功能恢復(fù)的作用［4］。

中藥治療繼發(fā)脊髓損傷主要以舒筋活血, 扶正固本為主,大致可分為中藥復(fù)方及中藥提取物兩大類。在脊髓損傷早期治宜疏通督脈, 活血化瘀。大量研究表明中藥三七、丹參、人參、黃芪等有助于改善微循環(huán)、抗氧自由基, 減輕脊髓繼發(fā)性損傷, 抑制成纖維細胞增生, 還可興奮脊髓, 促進神經(jīng)細胞和神經(jīng)纖維的再生［5-10］。

本實驗通過測量比較各組MDA含量及SOD、LDH活力, 并采用 MTT法檢測細胞的存活率, 觀察血府逐瘀血清對大鼠背根神經(jīng)元缺氧損傷的保護作用, 結(jié)果顯示, 空白對照組MDA在各個時間點的變化不大, 損傷對照組是各組中同時間點MDA含量最高的。12 h后MDA含量含藥血清組明顯低于空白血清組及損傷對照組, 比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；但含藥血清組與神經(jīng)營養(yǎng)因子保護組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)?？瞻讓φ战M各個時間點SOD含量變化不大。同時間點含藥血清組SOD含量明顯高于損傷對照組及空白血清組, 比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；同時間點含藥血清組與神經(jīng)營養(yǎng)因子保護組SOD含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。損傷后24 h, 含藥血清組LDH含量明顯低于損傷對照組及空白血清組, 比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05), 但與神經(jīng)營養(yǎng)因子保護組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。空白對照組細胞存活率為(0.624±0.054), 含藥血清組細胞存活率為(0.529±0.010), 空白血清組細胞存活率為(0.229±0.038), 損傷對照組細胞存活率為(0.221±0.034)、神經(jīng)營養(yǎng)因子保護組細胞存活率為(0.548±0.056), 含藥血清組細胞存活率明顯高于空白血清組及損傷對照組, 與神經(jīng)營養(yǎng)因子保護組及空白對照組較為接近。說明血府逐瘀血清對大鼠背根神經(jīng)元缺氧損傷具有保護作用, 可以促進神經(jīng)元的生長。

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