巴沙魚膠原蛋白支架材料的成骨效果評(píng)估

陳 彤，吳 剛，祖麗皮也，朱慶豐，王少海，易楊華

巴沙魚膠原蛋白支架材料的成骨效果評(píng)估

陳 彤1，吳 剛2，祖麗皮也1，朱慶豐1，王少海1，易楊華3

（1.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院口腔科 上海 200433；2.解放軍第八五醫(yī)院口腔科 上海 200052；3.第二軍醫(yī)大學(xué)海洋藥物研究中心 上海 200433）

目的：驗(yàn)證一種來(lái)源于巴沙魚皮的膠原蛋白支架材料作為屏障膜在兔顱骨引導(dǎo)骨再生（Guided Bone Regeneration，GBR）術(shù)中的成骨效果。方法：取新西蘭大白兔12只，分別在其顱頂矢狀縫左側(cè)建立一個(gè)缺損，右側(cè)建立兩個(gè)缺損，缺損為圓形，直徑8mm，共計(jì)36個(gè)骨缺損；然后按觀察時(shí)間隨機(jī)分為8周、12周兩大組，每一大組隨機(jī)分為3個(gè)亞組(n=4)；A組缺損中只植入Bio-Oss骨粉，B組植入Bio-oss骨粉+巴沙魚皮膠原支架材料；C組植入Bio-oss骨粉+Bio-Gide膠原膜。于術(shù)后8、12周處死相應(yīng)組大白兔，切取骨缺損區(qū)標(biāo)本并制作HE染色組織切片，定量分析各組骨缺損區(qū)骨組織再生的情況。結(jié)果：巴沙魚膠原蛋白支架材料在GBR技術(shù)中能發(fā)揮屏障膜作用，引導(dǎo)和促進(jìn)兔顱骨組織再生，其中B組與C組相比，8周時(shí)的成骨效果的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，12周時(shí)C組成骨效果略高于B組（P＜0.05）；而A組在8周和12周時(shí)的成骨效果均顯著低于B、C兩組(P＜0.05)。結(jié)論：巴沙魚皮膠原蛋白支架材料作為屏障膜在兔顱骨缺損修復(fù)中起到了引導(dǎo)骨再生的作用。

引導(dǎo)骨組織再生；魚類膠原蛋白；兔顱骨缺損模型；膠原蛋白支架材料；牙種植術(shù)

引導(dǎo)骨再生技術(shù)(Guided Bone Regeneration,GBR)是基于引導(dǎo)性組織再生(guided tissue regeneration，GTR)技術(shù)提出的一種促進(jìn)骨組織再生的外科治療方法。其原理為在骨缺損區(qū)域與上皮之間放置屏障膜，保護(hù)骨缺損空間，防止纖維結(jié)締組織等的過(guò)快長(zhǎng)入，從而促進(jìn)骨修復(fù)的完成[1-2]。臨床上常利用這種技術(shù)來(lái)解決種植區(qū)骨量不足或因牙周炎而造成重度牙槽骨吸收等問(wèn)題。

在GBR技術(shù)中，屏障膜材料的選擇是決定其引導(dǎo)骨組織再生效果的關(guān)鍵?？晌招阅z原膜是最常見(jiàn)的屏障膜材料之一，其最大的優(yōu)點(diǎn)為可吸收，無(wú)需二次手術(shù)取出降低了感染的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)膠原蛋白又具有低抗原性和創(chuàng)傷修復(fù)的優(yōu)點(diǎn)，有利于機(jī)體的恢復(fù)，膠原蛋白還具有良好的生物相容性和組織親和性，幾乎不會(huì)引起機(jī)體的炎癥或排斥反應(yīng)。但膠原膜也存在著一些缺陷，例如機(jī)械強(qiáng)度差，空間維持能力低等[3]。前人的研究中已經(jīng)證實(shí)膠原膜在GBR過(guò)程中能發(fā)揮良好的屏障作用[4]。大多數(shù)膠原膜的膠原成分來(lái)源于豬或者牛等陸生哺乳動(dòng)物，由于傳染病，口蹄疫等的原因，人們逐漸對(duì)此種來(lái)源的膠原蛋白制品產(chǎn)生了懷疑[5-6]，除此之外，部分地區(qū)的宗教信仰也限制使用豬或者牛等來(lái)源的制品，這使傳統(tǒng)的膠原蛋白制品的使用受到了一定的限制。

水生生物體內(nèi)含有豐富的膠原蛋白，且具有著哺乳動(dòng)物膠原不具備的優(yōu)點(diǎn)，如低抗原性、低過(guò)敏性等，另外水生生物膠原蛋白來(lái)源豐富，價(jià)格也相對(duì)低廉，水產(chǎn)加工過(guò)程中產(chǎn)生的魚皮魚鱗魚骨等廢棄物中均含有豐富的膠原蛋白成分。七十年代起，人們就已經(jīng)開始研究從水生生物體內(nèi)提取膠原蛋白來(lái)，并取得了一定的成果，因此水生生物有可能逐步替代陸生動(dòng)物成為膠原制品的主要原料來(lái)源[7-9]。本實(shí)驗(yàn)以巴沙魚皮為原料，制備出了一種富含膠原蛋白的膜狀支架材料。以兔為實(shí)驗(yàn)對(duì)象建立顱頂骨缺損動(dòng)物模型[10-11]，將巴沙魚膠原蛋白支架材料應(yīng)用于動(dòng)物骨缺損GBR技術(shù)中[12-13]，并以屏障效果肯定的膠原膜——Bio-Gide膠原膜作為陽(yáng)性對(duì)照，以驗(yàn)證該新型原料來(lái)源的材料作為屏障膜引導(dǎo)骨組織再生的效果。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料：新西蘭大白兔12只，第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（動(dòng)物使用許可證SYXK（滬）2012-0003）提供；巴沙魚膠原蛋白膜12張（10mm×10mm），第二軍醫(yī)大學(xué)海洋藥物研究中心提供；Bio-Gide膠原膜12張（10mm×10mm）（25mm×25mm，瑞士Geistilich公司）；可吸收骨粉Bio-oss5瓶（0.25g，瑞士Geistilich公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 巴沙魚膠原蛋白膜的制備：速凍巴沙魚皮，常溫解凍后洗凈風(fēng)干至恒重，稱重后依次用0.1%的NaOH溶液和3%的H2O2的溶液浸泡，用于脫色脫脂及去除部分雜蛋白。首次浸泡5h，待H2O2全部被還原，取出洗凈，更換溶液繼續(xù)浸泡24h。再用自來(lái)水沖洗至中性，然后在瀝干水分情況下用適量洗潔精揉搓，再用自來(lái)水清洗。此過(guò)程重復(fù)5次。配置脫色液（甲醇︰乙酸︰水＝250︰80︰670，體積比）進(jìn)行脂脫雜蛋白處理。將材料置于脫色液中浸泡24h后取出，沖洗至中性。瀝干水分的同時(shí)用適量洗潔精清洗5次，再用蒸餾水清洗3次，清洗完畢后置于蒸餾水中浸泡12h，用于去除魚皮中殘留其他物質(zhì)。整個(gè)過(guò)程重復(fù)3次。最后將魚皮取出，瀝干水分，鋪盤冷凍干燥后即可成形。

巴沙魚皮膠原支架材料的熱交聯(lián)方法如下：將上述制備好的巴沙魚膠原支架材料放置于真空干燥箱中，設(shè)置干燥箱溫度為110℃，72h后取出，即可完成交聯(lián)。

該材料呈膜狀，厚薄均勻，厚度為（0.66±0.10）mm。經(jīng)半微量凱氏定氮法可測(cè)得該材料的膠原蛋白含量高達(dá)95.20%。凝膠電泳實(shí)驗(yàn)分析可知該材料主要為I型膠原。

掃描電鏡照片顯示（圖1），該膠原蛋白支架材料的一面較為粗糙（圖1A），可見(jiàn)多孔結(jié)構(gòu)，孔徑大小不一，孔與孔之間相互通連，分布較為均勻。另一面則比較光滑（圖1B），孔隙致密。

圖1 巴沙魚皮膠原膜掃描電鏡圖片（×200）

1.2.2 兔顱頂骨缺損模型的建立：取1～2周齡的健康雄性新西蘭大白兔，12只（體質(zhì)量1.5～2kg），3%戊巴比妥鈉注射液耳緣靜脈注射（1～1.5ml/kg體質(zhì)量）麻醉后，顱頂部術(shù)區(qū)備皮，常規(guī)消毒，并于顱頂部顱中縫上方皮膚作豎型切口，切口長(zhǎng)2～3cm，分離軟組織和骨膜并暴露顱頂骨后，用慢速直機(jī)(卡瓦K4)分別在矢狀縫兩側(cè)與兩眼眶后緣連線一側(cè)后5mm，對(duì)側(cè)后3mm以及13mm處各制備一個(gè)直徑8mm的全層顱骨缺損（見(jiàn)圖2），注意保留完整的硬腦膜及骨膜組織。生理鹽水沖盡骨屑并拭干，按以下分組進(jìn)行相應(yīng)的處理。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組和GBR處理：將上述制備有顱頂骨缺損的12只大白兔按觀察時(shí)間隨機(jī)分為8周、12周兩大組（每組6只，共18個(gè)骨缺損區(qū)）；每一大組的18個(gè)骨缺損區(qū)再按不同處理方法各隨機(jī)分為A、B、C3個(gè)亞組（每組6個(gè)骨缺損區(qū)）。其中A組骨缺損區(qū)植入Bio-Oss骨粉，不覆蓋任何膜，縫合；B組骨缺損區(qū)植入Bio-Oss骨粉，用巴沙魚皮膠原蛋白膜覆蓋；C組骨缺損區(qū)植入Bio-Oss骨粉，用Bio-Gide膜覆蓋，并縫合（見(jiàn)圖3、4）；術(shù)后24～48h肌肉注射10～20萬(wàn)單位的青霉素鈉，連續(xù)注射3d。術(shù)后10d拆線。所有動(dòng)物均于相同條件下飼養(yǎng)。

圖2 建立兔顱骨骨缺損模型

圖3 對(duì)各缺損區(qū)按分組分別進(jìn)行不同處理

圖4 縫合

1.2.4 取材和大體觀察：分別于術(shù)后8周和12周處死相應(yīng)組大白兔，分別截取各缺損區(qū)及其周圍10mm以內(nèi)的全層骨組織，并肉眼觀察各缺損區(qū)愈合情況和屏障膜的降解情況。1.2.5 組織學(xué)觀察：各組顱頂骨標(biāo)本經(jīng)常規(guī)固定后，置于EDTA脫鈣液（500ml，BOSTER）中脫鈣，樹脂包埋，用組織切片機(jī)(Leica RM2235)垂直于骨組織面作水平方向切片（片厚5mm）。后取各標(biāo)本中心層切片，進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察新生骨組織成骨情況、新生組織血管化及纖維組織等其他組織學(xué)變化情況。用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)隨機(jī)采集同一樣本不同成骨區(qū)域在40倍視野下HE染色切片的圖像，各取14張，并用圖像分析軟件IMAGEPRO PLUS 6.0進(jìn)行定量分析，計(jì)算同一圖像下新生骨小梁面積（new bone area，NBA）占圖像骨缺損初始面積（total defect area，TDA）的百分比。取同一樣本所有圖像百分比的均數(shù)作為該樣本新生骨量的百分比（The percentage of new bone，PNB）

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：用SPSS18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)（xˉ±s）進(jìn)行方差分析，兩組間比較使用ANOVA檢驗(yàn)，同組內(nèi)兩兩比較使用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察：觀察期間，各組動(dòng)物進(jìn)食、活動(dòng)均正常，并健康成活至處死；術(shù)后10d拆線，各動(dòng)物的創(chuàng)口愈合情況均良好。GBR術(shù)后8周，骨缺損區(qū)域無(wú)明顯感染，B、C組屏障膜材料基本降解，與骨缺損區(qū)域無(wú)粘連，各組均可見(jiàn)未降解的骨粉顆粒，可探及實(shí)質(zhì)性修復(fù)（見(jiàn)圖5）；GBR術(shù)后12周，骨缺損區(qū)域無(wú)明顯感染，B、C組屏障膜已完全降解，各組均可探及實(shí)質(zhì)性新生骨組織，可見(jiàn)少量散在的骨粉殘余（見(jiàn)圖6）。

圖5 8周時(shí)的骨樣本

圖6 12周時(shí)的骨樣本

2.2 組織學(xué)觀察：8周時(shí)，各組均可見(jiàn)到早期新骨結(jié)構(gòu)的形成（見(jiàn)圖7～8）。其中空白組中可見(jiàn)到較多的纖維結(jié)締組織的長(zhǎng)入，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中則纖維結(jié)締組織較少，各組均可見(jiàn)少量的炎癥細(xì)胞和新生血管的存在，同時(shí)各組還可見(jiàn)未降解的骨粉顆粒組織。12周時(shí)，各組的新生骨小梁結(jié)構(gòu)更為成熟，更多的纖維結(jié)締組織有在向骨質(zhì)分化的趨勢(shì)，可見(jiàn)較多新生血管，炎癥細(xì)胞和未降解的骨粉相比8周時(shí)有所減少（見(jiàn)圖8～10）。

2.3 組織定量學(xué)分析：GBR術(shù)后各組織樣本新生骨量定量分析結(jié)果顯示：8、12周大組內(nèi)，新生骨量均為C組＞B組＞A組（表1）?？梢?jiàn)：B組與C組相比，8周時(shí)的成骨效果的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),12周時(shí)C組成骨效果略高于B組（P＜0.05）；而A組在8周和12周時(shí)的成骨效果均顯著低于

B、C兩組(P＜0.05)。

圖7 8周A組成骨區(qū)，紅色淡染為纖維結(jié)締組織（黑色箭頭），占了絕大部分（HE×40）

圖8 8周B組成骨區(qū)，新生骨小梁明顯增多?？梢?jiàn)較多新生血管以及骨髓腔（HE×40）

圖9 8周C組成骨區(qū)，可見(jiàn)新生骨小梁以及未降解的骨粉顆粒（黑色箭頭）（HE×40）

圖10 12周A組成骨區(qū)，可見(jiàn)纖維結(jié)締組織在向骨組織分化（HE×40）

圖11 12周B組成骨區(qū)，可見(jiàn)較多成熟的骨組織（HE×40）

圖12 12周C組成骨區(qū)，成熟骨組織數(shù)量增多，新生血管數(shù)量增多，未降解的骨粉減少（HE×40）

3 討論

GBR技術(shù)中，屏障膜的使用是關(guān)鍵,它能夠選擇性阻擋上皮和成纖維細(xì)胞進(jìn)入擬成骨空間，同時(shí)又不會(huì)妨礙組織缺損的自然愈合的過(guò)程[14]。屏障膜一方面可以在局部維持足夠的成骨空間，以利于來(lái)充填足量的人工材料或自體骨；另一方面因其自身具有一定的穩(wěn)定性，可保證有充足的時(shí)間讓成骨細(xì)胞占據(jù)成骨空間，同時(shí)還可在其降解過(guò)程中引導(dǎo)新生血管的長(zhǎng)入，從而促進(jìn)和引導(dǎo)屏障膜兩側(cè)組織的自我修復(fù)過(guò)程。在所有可吸收性膜中，膠原膜因具有很強(qiáng)的生物活性和生物功能、較高的細(xì)胞黏附水平以及一定的生物降解率，同時(shí)具有較弱的抗原性和良好的生物相容性[15]，已經(jīng)成為臨床上最常用的可吸收膜。但由于相關(guān)畜類疾病和某些宗教信仰限制了人們對(duì)陸生哺乳動(dòng)物膠原蛋白及其制品的使用，利用水生生物來(lái)源的膠原蛋白逐漸成為人們研究的熱點(diǎn)。

巴沙魚(Pangasisushaniltoa)是一種優(yōu)質(zhì)的東南亞特產(chǎn)淡水魚類，原產(chǎn)于越南湄公河三角洲和泰國(guó)湄南河流域，資源豐富，加工過(guò)程中產(chǎn)生下腳料如魚皮、魚肚、魚鰭等數(shù)量巨大，原料來(lái)源廣泛。I型膠原纖維為構(gòu)成該種魚膠原蛋白基本骨架的主要成分，其已被證實(shí)具有較低的免疫原性，優(yōu)良的生物相容性以及良好的促進(jìn)細(xì)胞增殖能力[16]。魚I型膠原的主要特征之一為在酸溶液中具有極高的溶解性，因此較鳥類和哺乳類膠原蛋白更易于提取[17-18]。魚類膠原的氨基酸組成也與哺乳動(dòng)物類似[19-23]，這說(shuō)明魚膠原蛋白與哺乳動(dòng)物膠原蛋白具有相似的穩(wěn)定性。在GBR過(guò)程中,以巴沙魚皮膠原蛋白膜作為屏障膜，其空間三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)能夠調(diào)節(jié)、誘導(dǎo)并促進(jìn)宿主細(xì)胞長(zhǎng)入；隨著成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及多種生長(zhǎng)因子的長(zhǎng)入和增殖，便可形成新生骨組織和新生血管，并逐漸將膜內(nèi)物質(zhì)降解、吸收，替換成為有宿主自體特征的細(xì)胞外組織基質(zhì)。

Bio-Gide膠原膜是一種已被實(shí)驗(yàn)證實(shí)能有效發(fā)揮屏障膜作用的膠原膜材料[24],以I型膠原纖維和III型膠原纖維為主要成分，構(gòu)成空間三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),并通過(guò)雙層膜的設(shè)計(jì)而使其能保持較長(zhǎng)時(shí)間的屏障作用，面對(duì)缺損區(qū)的疏松多孔的一面具有聚集黏附成骨因子的作用，可誘導(dǎo)骨基質(zhì)釋放骨形態(tài)發(fā)生蛋白、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等，而面對(duì)結(jié)締組織光滑致密的一面則不會(huì)表現(xiàn)骨誘導(dǎo)性。所以即使膠原本身并沒(méi)有釋放或結(jié)合這些成骨因子的能力，它結(jié)合了對(duì)這些因子具有高結(jié)合能力的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白[25]，就可以使膠原膜聚集骨誘導(dǎo)因子，將先前遷移來(lái)的細(xì)胞分化成具有成骨性能的細(xì)胞，促進(jìn)新骨的生成。同時(shí)，I型膠原蛋白可以在成骨細(xì)胞分化中起到直接和重要的作用[26-27]。同時(shí)，許多臨床醫(yī)生報(bào)道在GBR中使用Bio-Gide膠原膜取得了較高的成功率[4]。

本實(shí)驗(yàn)中將巴沙魚皮膠原蛋白支架材料、Bio-Gide膠原膜和人工骨替代物Bio-Oss配合使用。分別于GBR術(shù)后的8、12周時(shí)觀察發(fā)現(xiàn)，B組（巴沙魚皮膠原蛋白膜）和C組（Bio-Gide膠原膜）在組織學(xué)表現(xiàn)上較為類似，8周即可觀察到一定的新生骨小梁并伴有部分未骨化的纖維結(jié)締組織和未完全降解的骨粉顆粒。l2周時(shí)兩組的新生骨小梁數(shù)量均顯著增加。無(wú)論8周還是12周，各組的新生骨量均為C組最高，其次為B組，8周時(shí)，B組與C組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而12周時(shí)，C組成骨量高于B組，兩組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而A組(無(wú)膜覆蓋組)的新生骨量則明顯低于B、C組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。12周與8周相比，各組的新生骨量的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；組織學(xué)觀察顯示，12周時(shí)的所有實(shí)驗(yàn)組仍未形成完全成熟的致密骨板和哈弗系統(tǒng)，僅可見(jiàn)部分骨小梁融合和少量骨髓腔形成，骨粉均未完全降解完。本結(jié)果表明，巴沙魚皮膠原蛋白膜和Bio-Gide膠原膜均能在GBR技術(shù)中發(fā)揮屏障膜作用，并促進(jìn)兔顱骨缺損的骨組織再生和修復(fù)，成骨效果相差不多。但其促進(jìn)和引導(dǎo)缺損區(qū)骨組織修復(fù)的遠(yuǎn)期效果是否存在差異尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)論證。

表1 各組新生骨量百分比比較 （%，xˉ±s）

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Osteogenetic Effects of Collagen Scaffold Material from Basa Fish (Pangasisushaniltoa) Skin on GBR of Rabbit Skull Defect

CHEN Tong1,WU Gang2,Zulpiye·Ablikim1,ZHU Qing-feng1,WANG Shao-hai1,YI Yang-hua3
(1.ChangHai Hospital Department of Stomatology,Shanghai 200433,China; 2.The 85 Hospital of People’s Liberation Army Department of Stomatology,Shanghai 200052, China; 3.School of Pharmacy, The Second Military Medical University,Shanghai 200433,China)

guided bone regeneration;fish collagen;rabbit skull defect models;collagen scaffold material from fish;Dental implants

Q591.2 R782.12

A

1008-6455（2017）02-0076-05

2016-11-12

2017-01-28

編輯/張惠娟

海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201405015；201305013)資助；國(guó)家自然科學(xué)基金（81271177）資助

王少海（1974-），男，教授；研究方向：口腔修復(fù)學(xué)；E-mail：48321987@qq.com

易楊華（1946-），男，教授；研究方向：海洋藥物；E-mail：yiyanghua@126.com

陳彤（1990-），女，碩士研究生；研究方向：口腔修復(fù)材料學(xué)

Abstract: ObjectiveTo research the effects of collagen scaffold material from Basa fish skin on the repair of the rabbit skull defects.MethodsAcycloid skull defect with the diameter of 8mm was made on both sides of the sagittal suture of 12 rabbits.The rabbits were randomly divided in to 3 groups.The skull defects were treated with implantation of Bio-Oss,collagen scaffold material from Basa fish skin+Bio-Oss, Bio-Gide+Bio-Oss, respectively. After 8 and 12 weeks,6 rabbits were sacrificed respectively and the bone samples were examined by HE staining.ResultsCollagen scaffold material from Basa fish skin could play a role as barrier membrane in guiding and promoting osteogenesis in rabbit skull defects. There was no significant difference between group B and group C in promoting osteogenesis at 8 week after treatment(P＞0.05) but both more than group A(P＜0.05).At 12 week, group B is better than group A(P＜0.05)and worse than group C.ConclusionCollagen scaffold material from Basa fish skin can promote osteogenesis in bone defect.