光動力學療法對瘢痕成纖維細胞中轉化生長因子β1的作用

蔡 宏，王毅俠，李 鈾，劉 瑋，孫 平，董 寧

光動力學療法對瘢痕成纖維細胞中轉化生長因子β1的作用

蔡 宏1，王毅俠1，李 鈾1，劉 瑋1，孫 平1，董 寧2

(1.解放軍空軍總醫(yī)院皮膚科 北京 100142; 2.解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院燒傷研究所 北京 100037 )

目的：探討光動力學療法（Photodynamic therapy, PDT）對體外培養(yǎng)瘢痕成纖維細胞（hypertrophic scar fibroblast，HSF）中轉化生長因子β1的影響。方法：將原代培養(yǎng)的HSF分為對照組、HMME-PDT組、單純光敏劑組和單純激光照射組，用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測PDT后HSF分泌至上清液的TGF-β1蛋白表達量，應用Western-Blot觀察PDT對細胞漿內轉化生長因子β1的作用。結果：HSF分泌至細胞上清液的TGF-β1蛋白含量較高，而HMME-PDT后降低；HSF合成的TGF-β1蛋白水平高，HMME-PDT后HSF中的TGF-β1蛋白含量減少。結論：HMME-PDT能夠阻止TGF-β1的信號傳向細胞核，改變TGF-β1在HSF細胞水平的表達，使細胞核內細胞增殖及膠原合成有關的靶基因得不到激活，從而抑制HSF增殖。

光動力學療法；激光；光敏劑；瘢痕成纖維細胞；轉化生長因子β1

血卟啉單甲醚（Hematoporphyrin Monomethyl Ether, HMME）－光動力學療法（Photodynamic therapy, PDT）可以抑制體外培養(yǎng)HSF的增殖，但是，對于該作用機制尚未闡明。HSF作為創(chuàng)傷修復過程中重要的功能細胞和HS組織中主要的細胞成分，其分泌的多種細胞因子對HS的形成和發(fā)展有著重要影響。

目前的研究表明，創(chuàng)傷愈合過程中，生長因子的持續(xù)刺激作用是導致HS形成的重要原因[1]。轉化生長因子β（transforming growth factor-beta, TGF-β）具有調節(jié)細胞增殖、促進細胞外基質的產(chǎn)生、調控細胞的粘附和游走性等功能，它在創(chuàng)傷愈合過程中的效應取決于自身特性、濃度、靶細胞的種類和特性等。在TGF-β超家族中，TGF-β1是與瘢痕過度形成關系最為密切的細胞因子[2]。雖然TGF-β1對成纖維細胞的影響可能是正向的，也可能是負向的，但就總體而言，特別是從大量實驗研究和臨床實踐表明，TGF-β1是促進HS發(fā)生的重要因子。本研究檢測了HSF在經(jīng)過HMME-PDT照射后TGF-β1蛋白的表達情況，并探討了其與HSF增殖的關系。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗標本來源：本實驗所有標本均取自解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院燒傷整形科的HS患者，取材經(jīng)患者本人同意，HS患者共10例，男8例，女2例，年齡15～25歲，病變部位為前胸、背部，均處于增生期，此前未接受過其它治療，均經(jīng)臨床及病理證實診斷。

1.1.2 實驗試劑和儀器：HMME（上海第二軍醫(yī)大學研制，批號031209）；人轉化生長因子定量酶聯(lián)檢測試劑盒（上海森雄科技公司）；TGFβ1單克隆抗體、FITC標記羊抗鼠/兔IgG（北京中杉金橋生物技術公司）；蛋白定量試劑盒（美國Pierce公司）；630nm半導體紅光激光器（桂林興達光電醫(yī)療器械有限公司）；LM－93II型激光功率計（中國計量院）；Olympus-BH2型生物顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 原代培養(yǎng)：將手術切除的瘢痕組織，在無菌條件下剪成0.5～1.0cm3的小塊，立即投入含100U/ml青、鏈霉素的培養(yǎng)液中。剪除脂肪、表皮及結締組織，D-Hanks液清洗至無油滴，反復剪碎至小于1mm3的小塊，按適當間隔接種于培養(yǎng)瓶壁上，反轉使有組織塊的一面向上，加入含15%FBS的F12/DMEM培養(yǎng)基3ml，置37℃、5% CO2孵箱中孵育4h后，輕輕倒轉，使培養(yǎng)液浸沒組織塊，待培養(yǎng)液變黃后更換。4～10d組織塊周圍萌出細胞并逐漸形成細胞暈，20～30d細胞長滿瓶，形成細胞單層。

1.2.2 傳代培養(yǎng)：用0.25%胰酶消化，吹打，制成單細胞懸液。按1∶2比例傳代，建立HSF的傳代細胞系，實驗用第4～6代細胞，待細胞70%～80%融合時用于后續(xù)實驗。

1.2.3 PDT處理和實驗分組：培養(yǎng)的HSF與4μg/ml的HMME避光孵育4h后行PDT處理。照射波長為630nm，調整功率密度至10mW/cm2，能量密度2.5J/cm2；照光前后均監(jiān)測輸出功率，輸出功率波動范圍＜±5%；PDT后繼續(xù)將細胞放回孵箱中孵育20h，再進行下一步實驗檢測。其中，對照組不給予光敏劑和照光處理。并設立單純光敏劑組（PS：4μg/ml HMME）和單純激光照射組（Laser：波長630nm，功率密度10mW/cm2，能量密度2.5J/cm2）。

1.2.4 ELISA法檢測HSF分泌TGF-β1蛋白水平：檢測步驟按試劑盒說明書進行，試劑盒的敏感性小于16pg/ml。建立標準曲線孔后，在待測品孔中加入已激活的標本，每組每次4孔，重復3次。將反應板置于37℃孵育120min，洗板后加入第一抗工作液，繼續(xù)37℃孵育60min。洗板后加入酶標抗體工作液，37℃孵育60min，再次洗板并加入底物工作液，置37℃反應5～10min后，加入終止液終止反應，在酶聯(lián)儀上492nm處測定吸光值。根據(jù)樣品OD值在標準曲線上查出TGF-β1蛋白含量，并依據(jù)最初稀釋比例計算TGF-β1蛋白濃度值。

1.2.5 蛋白的提取及Western-blot分析：應用蛋白提取試劑盒提取各組細胞總蛋白，12 000g離心15min，將上清轉管后于-80℃凍存。在10%聚丙烯酰胺凝膠上電泳，上樣量為30μg總蛋白。電泳完畢后，使用電轉移儀將樣品轉移至PVDF膜。用5%的脫脂奶粉PBS液室溫封閉1h，在封閉液中分別加入兔抗人Smad3 mAb、磷酸化Smad3 mAb（1:1000）4℃過夜。TBST漂洗后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG（稀釋比例為1:1000）。在暗室中，采用化學發(fā)光反應試劑盒進行檢測。

1.2.6 統(tǒng)計學方法：數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(xˉ±s)表示，采用Chiss軟件進行統(tǒng)計分析，行配對t檢驗，P＜0.05時差異有顯著意義。

2 結果

2.1 HMME-PDT對瘢痕成纖維細胞分泌TGF-β1的影響：經(jīng)過5次重復實驗后，得出HSF對照組中細胞分泌至培養(yǎng)上清中的TGF-β1蛋白為（64.56±14.46）ng/ml，即表示HSF分泌至細胞外的TGF-β1蛋白含量較高。HMME-PDT治療組為（23.94±8.55）ng/ml，與對照組相比，其分泌量顯著降低，二者相比具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）（見圖1）。

圖1 HMME-PDT對瘢痕成纖維細胞分泌TGF-β1的影響（n=12）

2.2 HMME-PDT對HSF中TGF-β1的影響：與對照組相比，Western-blot結果表明HMME-PDT治療后HSF中TGF-β1蛋白含量減少（0.97±0.12 VS 0.28±0.02, P＜0.05），PS組和Laser組中TGF-β1蛋白表達無顯著改變（0.97±0.12 VS 0.82±0.14, P＞0.05；0.97±0.12 VS 0.86±0.17, P＞0.05）。

3 討論

HS是外傷、燒傷、感染或其它真皮損傷所導致的以膠原等大量結締組織基質的過度產(chǎn)生和沉積為特征的皮膚纖維化疾病。大量研究表明[3]，TGF-β1表達增加與瘢痕的過度形成密切相關，當TGF-β1失去調節(jié)，持續(xù)過表達就會導致皮膚及臟器的纖維化疾病，如硬皮病，肺纖維化以及HS，甚至瘢痕疙瘩等。

TGF-β1是迄今為止人們了解最多、與創(chuàng)傷愈合和瘢痕形成以及多種纖維化疾病關系最密切的細胞因子之一，它還是成纖維細胞和單核細胞的有效趨化劑，是影響創(chuàng)面愈合及HS形成的最重要的生長因子。研究表明在裸鼠皮下注射TGF-β1可致注射局部纖維化，而全身應用可致機體主要臟器（如肺、肝、腎等）纖維化[4]。硬皮病、肺纖維化及HS等纖維化疾病患者可以檢測到病變部位TGF-β1表達增強，這可能是由于TGF-β1促進成纖維細胞合成ECM，抑制膠原酶和纖溶酶原激活物的表達，增加膠原酶抑制物—金屬蛋白酶抑制劑（Tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMP）、纖溶酶原激活物抑制劑（Plasminogen Activator Inhibitor 1, PAI-1）的產(chǎn)生，拮抗某些細胞因子的致絲裂作用等[5]。

圖2 HMME-PDT對HSF中TGF-β1/Smads信號傳導蛋白的影響

本實驗結果表明，HMME-PDT抑制體外培養(yǎng)的HSF合成并分泌TGF-β1蛋白。由于TGF-β超家族成員通過膜綁定異側的絲氨酸/蘇氨酸激酶受體復合體傳遞信號，所以在配體綁定后，受體激活進而導致胞質Smad家族蛋白底物磷酸化[6]。TGF-β1誘導的信號轉導通路可以分為細胞外和細胞內信號轉導兩相，其信號轉導的調控也就體現(xiàn)在不同的水平之上。細胞外部分，包括配體的程序性激活和可控性擴散、配體-受體復合物形成等；細胞內部分由于涉及到細胞信號網(wǎng)絡，相對比較復雜，不僅有TGF-β1自身信號轉導通路每個環(huán)節(jié)的調控，也同時存在其它信號轉導通路的交叉調節(jié)，以及各個通路之間的整合或互相拮抗。因此，TGF-β1信號轉導調控系統(tǒng)是復雜而精密的。正是由于有如此精密的調控系統(tǒng)的存在，才使得TGF-β1能在不同環(huán)境下發(fā)揮它的多種功能，產(chǎn)生各種效應。

正常成纖維細胞合成TGF-β1后并非直接分泌到細胞外發(fā)揮功能，而是與特定的蛋白質相互作用形成復合體，以較大的前體形式存在于細胞中[7]。這些蛋白質包括：LAP（Latency associated peptide, LAP）、LTBP（Latent TGF-β1binding protein）等。它們在復合體中能夠幫助TGF-β1的正確折疊并保持其穩(wěn)定性，并使其易于分泌。本實驗采用ELISA方法檢測HSF分泌到細胞外的TGF-β1水平，表明HSF分泌較多的TGF-β1，這與上述HSF的高代謝、高分泌狀態(tài)相一致。

Heckenkamp等[8]在抑制靜脈血管再狹窄的研究中發(fā)現(xiàn)，PDT治療后第3和第7天，成纖維細胞的增殖能力分別減少了30%和76%，其所分泌的細胞外基質也分別減少了47%和51%，并推測該效應的產(chǎn)生與TGF-β1mRNA的表達顯著降低密切相關。Gold等[9]已證實TGF-β1能夠在成纖維細胞中大量表達，提示瘢痕形成涉及成纖維細胞向TGF-β1的高敏性轉換和積累，并且這類高敏的成纖維細胞未能及時消亡而且仍然分泌TGF-β1形成正反饋。所以，通過各種方法下調或對抗TGF-β1是目前防治瘢痕的方向之一。

研究表明[10]HMME的主要成分為相對疏水性卟啉，易結合于細胞的內質網(wǎng)、高爾基體、溶酶體等膜性結構。HSF細胞內的內質網(wǎng)豐富，高爾基體發(fā)達，以及線粒體數(shù)目大量增加，HMME進入HSF后以這些細胞器為主要分布位點，經(jīng)激光照射產(chǎn)生反應活性很高的自由基和單線態(tài)氧等ROS，導致亞細胞水平多位點損傷。由于蛋白合成的場所——粗面內質網(wǎng)和核糖體受PDT損傷，從而抑制了細胞合成與分泌TGF-β1等蛋白的能力。本實驗結果亦表明HMME-PDT能夠抑制HSF分泌TGF-β1，其表達水平顯著降低。本實驗采用ELISA的方法檢測到，HMME-PDT組HSF分泌TGF-β1蛋白減少，故筆者推測正是由于HMME-PDT阻滯細胞的高增殖和高分化，導致其自身合成TGF-β1蛋白的能力下降，遞呈給TβRⅠ的信息減少，進一步抑制HSF的增殖。此外，由于HMME易于在細胞膜性細胞器積聚，故推測細胞膜必然也是HMME結合和積聚的位點。經(jīng)PDT治療后必然會損傷細胞膜，分布于細胞膜上的TGF-βR功能亦受損，影響細胞外信號TGF-β1向細胞內有效傳導。

HS的攣縮影響皮膚的正常外觀和功能，在攣縮過程中HSF向肌成纖維細胞（myofibroblast，MFB）分化，它是成纖維細胞在創(chuàng)傷愈合或攣縮過程中的一種終極表型，Adam等在α-SMA基因啟動子序列中發(fā)現(xiàn)了一個TGF-β1調控位點（TGF-β1Control Element，TCE），提出TGF-β1本身可以直接參與到MFB的分化，并認為除了TCE外，TGF-β1還作用于內源性的CArG[CC(A/T)6GG]控制元件調控成纖維細胞的分化。研究發(fā)現(xiàn)[11-12]，抗體靶向光分解(antibodytargeted photolysis, ATPL)對于體外控制FPCLs收縮是一種具有高選擇性和有效的方法，通過改變光敏劑和光劑量等PDT參數(shù)，能減少FPCLs的收縮程度，為調控細胞外基質的產(chǎn)生提供可能。本實驗的研究結果表明，HMME-PDT抑制體外培養(yǎng)的HSF自分泌和合成TGF-β1蛋白，終而可能會通過TCE或其它相關控制元件影響MFB的分化和α-SMA蛋白的表達，發(fā)揮抑制瘢痕攣縮的作用。

[1]Butzelaar L,Ulrich MM,et al.Currently known risk factors for hypertrophic skin scarring: A review[J].J Plast Reconstr Aesthet Surg,2016,69(2):163-169.

[2]Wang X,Gao Z,Wu X,et al.Inhibitory effect of TGF-β peptide antagonist on the fibrotic phenotype of human hypertrophic scar fibroblasts[J].Pharm Biol,2016,54(7):1189-1197.

[3]Ihn H.Autocrine TGF-beta signaling in the pathogenesis of systemic sclerosis[J].J Dermatol Sci,2008,49(2):103-113.

[4] Momtazi M, Kwan P, Ding J, Anderson CC,et al. A nude mouse model of hypertrophic scar shows morphologic and histologic characteristics of human hypertrophic scar[J]. Wound Repair Regen,2013,21(1):77-87.

[5]Simon F,Bergeron D,Larochelle S,et al.Enhanced secretion of TIMP-1 by human hypertrophic scar keratinocytes could contribute to fibrosis[J]. Burns,2012,38(3):421-427.

[6]He T,Bai X,Yang L,et al.Loureirin B Inhibits Hypertrophic Scar Formation via Inhibition of the TGF-β1-ERK/JNK Pathway[J].Cell Physiol Biochem,2015,37(2):666-676.

[7]Beaufort N,Scharrer E,Kremmer E,et al.Cerebral small vessel disease-related protease HtrA1 processes latent TGF-β binding protein 1 and facilitates TGF-β signaling[J].Proc Natl Acad Sci USA,2014,111(46):16496-16501.

[8]Heckenkamp J,Aleksic M,Gawenda M,et al.Modulation of human adventitial fibroblast function by photodynamic therapy of collagen matrix[J].Eur J Vasc Endovasc Surg,2004,28(6): 651-659.

[9]Gold LI,Sung JJ,Siebert JW,et al.Type I (RI) and type II (RII) receptors for transforming growth factor-beta isoforms are expressed subsequent to transforming growth factor-beta ligands during excisional wound repair[J].Am J Pathol,1997,150(4): 209-222.

[10]Cai H,Gu Y,Sun Q,et al.Effect of hematoporphyrin monomethyl ethermediated photodynamic therapy on hypertrophic scar fibroblasts[J]. Photodermatol Photoimmunol Photomed,2011,27(2):90-96.

[11]Honardoust D,Kwan P,Momtazi M,et al.Novel methods for the investigation of human hypertrophic scarring and other dermal fibrosis[J].Methods Mol Biol,2013,1037:203-231.

[12]Gauglitz GG.Management of keloids and hypertrophic scars: current and emerging options[J].Clin Cosmet Investig Dermatol,2013,24(6):103-114.

The Investigation of Transforming Growth Factor β1in HSF after HMME-PDT

CAI Hong1,WANG Yi-xia1,LI You1,LIU Wei1,SUN Ping1,DONG Ning2
(1.Department of Dermatology, The General Hospital of Air Force, Beijing 100142, China;2. Burns Institute, the First Hospital Affiliated to the Chinese PLA General Hospital, Beijing 100037,China)

ObjectiveTo investigate the response of TGF-β1after PDT which induced by hematoporphyrin monomerthyl ether (HMME) in human fibroblasts from hypertrophic scar (HSF).MethodsFibroblasts were cultured from nontreated hypertrophic scars, and cells were divided into 4 groups: control (untreated), HMME-PDT, HMME and Laser. The expression of TGF-β1in supernatant of HSF was detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The expression of TGF-β1was analyzed by Western blot.ResultsHMME-PDT down-regulated the protein level of TGF-β1both in supernatant of HSF and in HSF.ConclusionHMME-PDT decreased TGF-β1activation. It inhibited the proliferation of HSF through decreased the activation of taget gene.

Photodynamic therapy; laser; Photosensitizer; hypertrophic scar fibroblast; TGF-β1

R619+.6

A

1008-6455（2017）02-0005-04

2016-07-19

2016-11-23

編輯/張惠娟

本研究受國家自然科學基金資助（光動力學療法作用于瘢痕疙瘩成纖維細胞 TGF-β1/Smad3 信號通路的分子機制：編號81301386）

劉瑋，教授，主任醫(yī)師，地址：北京海淀區(qū)阜成路30號，郵編：100142；E-mail：lwei5811@126.com