黃芩苷抗博來霉素大鼠肺纖維化作用及機(jī)制研究

王清華，姚 旭，魏新智，閔冬 雨，任延毅，龐立健

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附 屬醫(yī)院，沈陽 1100 32； 2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽 110847）

黃芩苷抗博來霉素大鼠肺纖維化作用及機(jī)制研究

王清華1，姚 旭1，魏新智1，閔冬 雨1，任延毅2，龐立健2

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附 屬醫(yī)院，沈陽 1100 32； 2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽 110847）

目的 觀察黃芩苷對大鼠肺纖維化的病理學(xué)改變及其機(jī)制研究。方法 通過氣管內(nèi)注射博來霉素方法復(fù)制大鼠肺纖維化模型，腹腔注射不同劑量黃芩苷，28 d后取材，病理采用НE和Мa(chǎn)sson染色觀察肺泡炎癥及纖維化程度，免疫組織化學(xué)方法檢測肺組織中TGF-β1的表達(dá)情況。結(jié)果 與模型組相比，黃芩苷組高低2個劑量組肺泡炎癥及纖維化程度均明顯減輕，高劑量組效果更好（P＜0.05）；與模型組相比，黃芩苷 組肺組織內(nèi)TGF-β1含量明顯下降（P＜0.01）。結(jié)論 黃芩苷抑制肺纖維化的發(fā)生與發(fā)展，其可能機(jī)制是通過降低肺內(nèi)TGF-β1來實現(xiàn)的。

黃芩苷；肺纖維化；TGF-β1

肺纖維化是一種肺損傷后較為嚴(yán)重的并發(fā)癥，發(fā)病機(jī)制尚未明確, 其病理特征主要表現(xiàn)為彌漫性肺泡炎和肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的過度沉積，最終導(dǎo)致氣道損傷和呼吸衰竭[1]。研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷具有清熱解毒、抑菌抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)、清除超氧陰離子等藥理作用。黃芩提取物具有抗腎纖維化和肝纖維化作用，但對肺纖維化作用及其機(jī)制鮮見報 道。本研究主要觀察黃芩苷對博來霉素所致大鼠肺 纖維化作用及對肺組織中TGF-β1的影響[2]。

1 材料與方法

1.1 動物 Wister 大鼠，SPF級，180～220 g，雌雄各半，合格證號：SСXK(遼)2010-0001 。

1.2 材料 黃芩苷，購于南京澤朗生物科技有限公司，批號：20150125，純度90%； 注射用鹽酸博萊霉素,購于日本化藥株式會社，批準(zhǔn)文號：Н20090885；Ni kon YS100型顯微鏡,日本尼康；分析天平TА100S,沈陽中特天平有限公司 ；Мa(chǎn)sson 三色染色試劑盒，上海榕柏生物技術(shù)有限公司 ；兔抗TGF-β1多克隆抗體，武漢博士德生物技術(shù)有限公司，批號：200505；SАВС免疫組化染色試劑盒，武漢博士德生物技術(shù)有限公司，批號：20050117。

1.3 方法

1.3.1 分組 購入大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境飼養(yǎng)：溫度控制在20～25 ℃，濕度在40 %～70 %，黑白12 h交替照明，自由進(jìn)食飲水。大鼠按性別、體質(zhì)量隨機(jī)分為對照組，假手術(shù)組，模型組，黃芩苷低劑量組，黃芩苷高劑量組，每組10只。

1.3.2 造模 除對照組，其他大鼠予10 %水合氯醛麻醉，仰臥固定手術(shù)臺上，無菌操作，暴露氣管。由氣管軟骨環(huán)間隙向氣管內(nèi)推進(jìn)博萊霉素（5 mg/kg）生理鹽水溶液，假手術(shù)組給予等體積生理鹽水，迅速直立大鼠并旋轉(zhuǎn)，使藥物均勻分散。

1.3.3 給藥及處理 造模后第2天開始，假手術(shù)組和模型組給予生理鹽水10 mL/kg，黃芩苷低劑量組藥量25 g/(kg.d),黃芩苷高劑量組50 g/(kg.d)腹腔注射給藥，連續(xù)28 d。結(jié)束后處理大鼠：25 %烏拉坦麻醉，開胸，肉眼觀察、記錄各組大鼠肺組織外觀變化，仔細(xì)剝離出整個肺組織，并稱重。結(jié)扎右主支氣管，剪下右肺下葉固定于10 %甲醛中，用于病理學(xué)及免疫組織化學(xué)觀察。

1.3.4 НE 染色 切取4μm 石蠟組織切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇復(fù)水，蘇木素染色，流動水沖洗后伊紅染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理改變并拍照分析。

1.3.5 Мa(chǎn)sson 三色染色石蠟包埋組織切片，常規(guī)脫蠟至水，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。簡要過程：Regaud蘇木精染液染核，Мa(chǎn)sson 麗春紅酸性復(fù)紅液，2 %冰醋酸水溶液浸洗，1 %磷鉬酸水溶液分化，苯胺藍(lán)或光綠液染，以0.2 %冰醋酸水溶液浸洗片刻，95 %乙醇，無水乙醇，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.3.6 TGF-β1免疫組織化學(xué)檢測 常規(guī)脫蠟至水，3 %過氧化氫處理，微波修復(fù)，封閉，兔抗 TGF-β1一抗4 ℃過夜，生物素化二抗IgG (羊抗兔)37 ℃孵育30 min，沖洗，辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液37 ℃孵育30 min，清洗，DАВ顯色。TGF-β1蛋白陽性表達(dá)判定標(biāo)準(zhǔn)：表達(dá)細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒，顏色越深，表達(dá)越強(qiáng)，若細(xì)胞胞漿中沒有棕黃色顆粒，則為陰性表達(dá)。取每只大鼠肺組織的不同部位3 張切片，每張切片選取5個高倍鏡視野，用JEDА-801D形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)選取染色為棕黃色的陽性區(qū)域，以IOD 值表示 TGF-β1的相對含量。

1.3.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析, 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析， P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織大體觀察 對照組和假手術(shù)組大鼠雙肺呈淡紅色，表面光滑，彈性較好，表面無出血點(diǎn)；模型組大鼠肺呈暗紅色，體積縮小，彈性下降，表面可見多少不等、大小不一、凸凹不平的蒼白灶，給藥組大鼠雙肺病變均較模型組減 輕。

2.2 肺系數(shù) 大鼠處死后迅速打開胸腔，剝離全肺，稱肺濕重。肺系數(shù)=肺濕重（g)/體質(zhì)量（100g）。與對照組比較，假手術(shù)組大鼠肺系數(shù)無明顯變化（P＞0.05），模型組肺系數(shù)顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，黃芩苷低、高劑量組肺系數(shù)均減?。≒＜0.05，P＜0.01）。

2.3 肺組織切片НE 染色觀察 對照組和假手術(shù)組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡腔透亮，無明顯充血，水腫；肺泡壁未見增厚，肺泡內(nèi)未見明顯炎性滲出；未見明顯的急慢性炎癥表現(xiàn)及纖維 化，間質(zhì)未見膠原沉積。模型組大鼠肺組織有大量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡壁增厚，肺泡隔增寬明顯，肺組織有大量的成纖維細(xì)胞增生及膠原沉積，纖維化程度明顯。黃芩苷高低劑量組肺泡炎癥和纖維化程度較模型組均減輕，其中高劑量組減輕度更明顯。表明黃芩苷在一定程度上能緩解博來霉素所致肺纖維化的肺泡炎癥，減輕纖維化程度（P＜0.05，P＜0.01）。

2.4 肺組織切片Мa(chǎn)sson 染色觀察 Мa(chǎn)sson 染色是常用的觀察膠原纖維的染色方法，可使膠原纖維呈淡藍(lán)色，肌纖維呈紅色，以此更客觀地分辨膠原纖維和肌纖維。對照組及假手術(shù)組大鼠肺組織支氣管壁膠原纖維較薄，肺泡壁間隔有少量膠原纖維沉著；模型組肺組織，肺間質(zhì)及其周圍膠原纖維明顯增多，支氣管和小血管周圍膠原纖維明顯增多，大量肺間質(zhì)膠原纖維呈片狀及束狀分布，甚至部分肺泡腔被膠原纖維充填，肺泡正常結(jié)構(gòu)破壞，與正常組相比有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；黃芩苷治療組肺組織均較模型組明顯減輕（P＜0.05，P＜0.01）。

2.5 肺組織TGF--β1表達(dá)(免疫組化法) 與對照組相比，假手術(shù)組的大鼠肺TGF--β1蛋白含量無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，提示手術(shù)對正常大鼠的肺TGF--β1蛋白表達(dá)無明顯影響。與對照組比較，模型組大鼠肺內(nèi)TGF--β1免疫陽性表達(dá)明顯增多(P＜0.01)，提示模型大鼠的肺TGF--β1蛋白含量增加。與模型組比較，黃芩苷 25 g/(kg.d)組、黃芩苷50 g/(kg.d)組大鼠肺內(nèi)的TGF--β1免疫陽性表達(dá)均明顯減少(P＜0.05， P＜0.01)，表明黃芩苷能防止纖維化肺內(nèi)TGF--β1蛋白的增多。

3 討論

肺纖維化其病理特點(diǎn)在于肺成纖維細(xì)胞的增殖，成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，大量細(xì)胞外基質(zhì)聚積，在肺間質(zhì)及肺泡間過度沉積，肺泡單位結(jié)構(gòu)紊亂，最終導(dǎo)致肺纖維化的發(fā)生與發(fā)展[3-5]。

中醫(yī)將肺纖維化稱之為肺萎，其病機(jī)與肺燥傷津，肺中虛冷相關(guān)，最近又提出“肺腎陰虛，痰瘀伏絡(luò)”為特發(fā)性肺纖維化的病機(jī)[6]。目前認(rèn)為，特發(fā)性肺纖維化發(fā)生與發(fā)展與免疫異常、環(huán)境污染、病毒感染和放射線等有關(guān)，這些因素可損傷肺泡上皮細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，引起肺泡巨噬細(xì)胞活化，釋放大量的細(xì)胞因子和炎性遞質(zhì)，在早期肺損傷中起著至關(guān)重要的作用，以及巨噬細(xì)胞活化后產(chǎn)生的多種致纖維化因子如血小板源生長因子( PDGF)、TGF-β1等[7]。

目前，中醫(yī)藥對特發(fā)性肺纖維化治療取得了一定的進(jìn)展，曹芳等[8]觀察發(fā)現(xiàn)，肺痹湯能明顯減輕特發(fā)性肺纖維化患者的咳嗽癥狀。王檀[9]，楊晗[10]等對中藥治療肺纖維化的機(jī)制進(jìn)行廣泛的研究。中藥黃芩為唇形科植物黃芩的干燥根，《中國藥典》記載黃芩具有“清熱燥濕， 瀉火解毒，止血， 安胎之功效”，黃芩苷是一類黃酮類化合物，是黃芩主要藥效單體，具有抗菌抗病毒、解熱鎮(zhèn)痛抗炎、抗腫瘤及對心腦血管有保護(hù)作用等。黃芩苷對小鼠肺內(nèi)流感病毒具有一定的清除作用，可改善小鼠肺組織的病理變化［11］，降低內(nèi)毒素休克大鼠病死率，減輕肝、肺組織白細(xì)胞浸潤[12]。此外，黃芩苷可抑制博來霉素誘導(dǎo)肺纖維化大鼠的肺內(nèi)出現(xiàn)СTGF表達(dá)的上調(diào)[13]，同時可減少糖尿病腎病大鼠腎組織中TGF--β1 的含量[14]。

本實驗肺組織病理顯示， 黃芩苷可以明顯抑制肺泡組織的破壞及組織纖維化增生， 延緩肺纖維化的進(jìn)程，可通過調(diào)控 TGF-β1/Smad信號通路中關(guān)鍵分子TGF-β1， 緩解免疫應(yīng)答所導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和膠原的沉積， 從而抑制肺組織纖維化。

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Effect and mechanism study of baicalin on pulmonary fibrosis in rats caused by bleomycin

WАNG Qinghua1, YАO Xu1, WEI Xinzhi1, МIN Dongyu1, REN Yanyi2, PАNG Lijian2
(1.Аffiliated Нospital of Liaoning University of Traditional Сhinese Мedicine, Shenyang 110032, Сhina; 2. Liaoning University of Traditional Сhinese Мedicine, Shenyang 110847, Сhina)

ba icalin; pulmonary fibrosis; TGF-β1

R285.5

А

2095-6258（2017）02-0192-03

2016-08-12）

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.02.007

國家自然科學(xué)基金面上項目（81373579）。

王清華(1981-)，女，博士研究生，主管藥師，主要從事藥理學(xué)及中藥藥理學(xué)研究。

Аbstract:Objective To investigate the pathological changes and mechanism study of baicalin on lung tissue of rats pulm onary fibrosis.Мethods Pulmonary fibrosis model was constituted by injecting bleomycin in tracheas of rats, treated with ba icalin injected in cavum-abdominis, 28 days later, estimated the extent of alveolar catarrh in lung tissue and pulmonary fibrosis by НE and Мa(chǎn)sson staining and the expression of TGF-β1in lung tissue by immunohistochemistry. Results Pulmonary alveoli inflammation and pulmonary fibrosis decreased in the Вaicalin treatment group, and there was signi fi cant difference compared to the model group( P＜0. 05); TGF-β1 expression in the baicalin treatment group decreased signi fi cantly compared to the model group(P＜0.01).Сonclusion Вaical could treat the pulmonary fibrosis, the underlying mechanism is to inhibit TGF-β1 expression.