硫化氫對水稻幼苗葉片中蛋白質(zhì)表達譜的影響

陳露+徐慧芳+孟丹

摘要：硫化氫（H2S）作為重要的信號分子，調(diào)控著植物的生長發(fā)育。應(yīng)用雙向電泳技術(shù)（2-DE）分析了水稻幼苗葉片經(jīng)不同濃度的H2S處理后蛋白質(zhì)表達譜的變化，并獲得29個表達豐度差異2倍以上的蛋白質(zhì)。鑒定的差異蛋白質(zhì)主要涉及到光合作用 （43%），能量代謝 （9%），氧化還原平衡 （13%），蛋白質(zhì)合成、折疊、加工與降解 （19%），信號轉(zhuǎn)導(dǎo) （3%）等。gene ontology（GO）分析發(fā)現(xiàn)，受硫化氫調(diào)控的差異，蛋白主要參與光合作用、防御和非生物脅迫應(yīng)答等過程。表明不同濃度的硫化氫在調(diào)控水稻幼苗的形態(tài)變化方面主要涉及到光合過程和脅迫應(yīng)答。

關(guān)鍵詞：水稻，H2S，蛋白質(zhì)組，雙向電泳

中圖分類號： S511.01 文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）11-0081-04

硫化氫（H2S）是近10年來繼一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）后在生物體內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的第3種內(nèi)源性氣體信號分子[1]，在植物體內(nèi)主要是通過半胱氨酸脫巰基酶（CDes）催化半胱氨酸（Cys）降解生成。相關(guān)研究表明，H2S廣泛參與調(diào)節(jié)植物各種生理過程，如植物細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、促進種子萌發(fā)、調(diào)節(jié)光合作用和根系發(fā)育、參與氣孔運動、緩解逆境脅迫等[2-7]。H2S供體能顯著提高小麥種子內(nèi)β-淀粉酶、酯酶的活性，提供可溶性糖、可溶性蛋白和游離氨基酸，為小麥種子的萌發(fā)提供良好的環(huán)境從而促進其發(fā)芽[8]，Wang等研究表明，0.01～0.13 mmol/L NaHS均能不同程度地緩解NaCl對小麥種子萌發(fā)率的抑制作用[7]。在干旱脅迫下，王蘭香等發(fā)現(xiàn)H2O2能夠誘導(dǎo)擬南芥L/D-CD基因的表達以提高葉片H2S含量來關(guān)閉氣孔，防止水分蒸發(fā)[9]。方慧慧等研究證明，在植物體內(nèi)H2S和Ca2+信號存在復(fù)雜的關(guān)系，H2S能激活Ca2+信號下游相關(guān)基因的表達，同時Ca2+能增強H2S的產(chǎn)生，并且它們可以通過調(diào)節(jié)重金屬離子轉(zhuǎn)運蛋白增強谷子對Cr6+的耐受性[10]。在緩解銅脅迫造成的傷害中，Shan等研究表明，外源H2S能調(diào)節(jié)植物非酶類抗氧化劑維生素C和還原型谷胱甘肽（GSH）循環(huán)，增加葉片維生素C、GSH 含量，提高GSH、維生素C清除活性氧速率[11]。

相關(guān)研究中我們發(fā)現(xiàn)，不同濃度的H2S對水稻幼苗形態(tài)和生理生化有不同的效應(yīng)，低濃度H2S能顯著促進幼苗生長，而高濃度的H2S對水稻幼苗生長有明顯的抑制作用[12]。為了了解硫化氫影響水稻幼苗生長發(fā)育的分子基礎(chǔ)，本研究通過蛋白質(zhì)組技術(shù)分析了施加不同濃度硫化氫的水稻幼苗葉片蛋白質(zhì)表達譜的變化及其參與的生物學(xué)過程。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

試驗材料為圣稻16（Oryza sativa Shengdao 16）。挑選顆粒飽滿種子，用0.1% HgCl2消毒10 min，去離子水沖洗數(shù)次，25 ℃恒溫箱黑暗中浸種催芽48 h。萌發(fā)后選取露白一致的種子用鑷子整齊擺放在墊有濾紙的培養(yǎng)皿（直徑12 cm）中，加入適量清水，水量以不浸沒種子為標(biāo)準(zhǔn)，保持皿中水量充足。當(dāng)苗長至1葉1心時，選擇長勢一致的幼苗用海綿松松地包裹，嵌入有孔泡沫板（厚度1.5 cm）中，放在盛有1/2 Hoagland營養(yǎng)液（2 L）塑料箱內(nèi)，置于HP1000GS型智能人工氣候箱中水培。晝、夜溫度分別為28、25 ℃，相對濕度為60%～70%，白天給予光照12 h[1 000 μmol/（m2·s）]。培養(yǎng)箱適應(yīng)生長1 d后，用含有NaHS（H2S的供體）的Hoagland營養(yǎng)液，濃度分別為：0（CK）、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mmol/L培養(yǎng)，每2 d換1次，共處理3次。每個處理135株苗（3箱），3個重復(fù)，每個重復(fù)45株苗（1箱）。于開始處理后7 d，液氮取樣保存，進行各項蛋白質(zhì)組學(xué)指標(biāo)的測定。

1.2 蛋白質(zhì)樣品的制備

采用TCA/丙酮沉淀方法[13]提取水稻葉片總蛋白。首先稱取1 g左右鮮質(zhì)量材料于預(yù)冷研缽中，液氮研磨并加入10%樣品質(zhì)量的聚乙烯吡咯烷酮（PVP），將研磨好的粉末轉(zhuǎn)移至離心管中，1個樣加20 mL-20 ℃預(yù)冷的10%TCA-丙酮，之后渦旋至少1.5 h，-20 ℃靜置沉淀，后12 000 r/min離心30 min去上清液。然后加20 mL丙酮和0.02 g 0.1% DTT 到離心管中，將沉淀搗碎，重復(fù)3次，-20 ℃存放。之后再離心，蓋上濾紙，真空干燥后進行第1次裂解，約2 h，用玻璃棒不定時攪動。樣品溶解在蛋白質(zhì)裂解液中，理論上加入 20 μL/mg 裂解液，其配方為每10 mL裂解液中含4.204 2 g 7 moL/L 尿素，1.522 4 g 2 moL/L硫脲，0.4 g 4% CHAPS，60 μL 0.3%CA，100 μL 100 mmoL/L PMSF，0.0215 6 g 14 mmoL/L DTT。第1次裂解后12 000 r/min離心30 min，取上清液到新的10 mL離心管中，加5倍體積的常溫丙酮，混勻后常溫靜置沉淀，再離心30 min，去除上清液，真空干燥。之后進行第2次裂解2 h，再離心30 min，取上清液50 μL/管分裝，存于-80 ℃。以牛血清白蛋白（BSA）為對照，采用Bradford法[14]測定提取的水稻葉片蛋白提取液的蛋白濃度。

1.3 蛋白質(zhì)的雙向電泳

首先是固相pH值梯度選擇，根據(jù)前期試驗中蛋白分布情況的摸索，使用pH值為4～7的非線性（NL）膠條，水稻根蛋白點可均勻分布在整塊膠上。其次為固相化pH值梯度（IPG）膠條的水化，將IPG膠條膠面朝下置于預(yù)先加好 460 μL 水化液和蛋白樣品液的混合液的聚焦槽中，中間注意不要有氣泡，2 mL礦物油覆蓋后于20 ℃水化13 h，然后進行第一向等電聚焦，設(shè)置等電聚焦時的溫度為20 ℃，每根膠條的極限電流為50 A。等電聚焦結(jié)束后進行IPG膠條的平衡，之后進行第二向SDS-PAGE電泳，電泳時使用低恒功率（2 W），待樣品在完全跑出IPG膠條、溴酚藍(lán)指示劑濃縮成一條線后，再加大功率（25 W），待溴酚藍(lán)指示劑達到底部邊緣2～3 cm時即可停止電泳。電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)進行凝膠染色，后將脫色好的凝膠放置在掃描板上，調(diào)整圖像大小后，對凝膠進行圖像掃描，保存圖像。使用PDQuest 軟件分析圖像。在蛋白質(zhì)表達差異分析方面，對每個處理的3塊重復(fù)膠的蛋白點相對表達量（體積分?jǐn)?shù)，%） 進行比較，根據(jù)單向方差分析（ANOVA）方法驗證差異顯著性。

1.4 蛋白質(zhì)的膠內(nèi)酶解

用剪掉的槍頭將蛋白點從膠上人工切取，放置在1 mL離心管中，通過胰蛋白酶進行膠內(nèi)酶解。酶解后的肽段用MALDI-TOF/TOF MS/MS質(zhì)譜儀進行分析，并通過MASCOT軟件檢索水稻蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫[15]。

1.5 生物信息學(xué)分析

用蛋白質(zhì)功能數(shù)據(jù)庫Pfam對差異表達的蛋白質(zhì)進行功能分類[16]，用PIR數(shù)據(jù)庫進行GO（gene ontology ）分析[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度硫化氫影響水稻幼苗葉片蛋白質(zhì)表達譜的差異分析

通過對水稻葉片蛋白質(zhì)表達譜的分析，每塊二維凝膠圖譜上大約檢測到320個蛋白點。不同濃度的硫化氫供體硫氫化鈉（NaHS）[0（CK）、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mmol/L]對水稻幼苗葉片的蛋白質(zhì)表達的影響見圖1。定量分析發(fā)現(xiàn)在至少1個處理梯度上表達豐度上差異2倍以上的蛋白點29個。利用 MALDI-TOF/MS質(zhì)譜分析結(jié)合水稻蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索，獲得了29個蛋白點的身份（表1）。水稻葉片中在硫化氫影響下共有11個蛋白質(zhì)在至少1個濃度處理下表達增強，有24個蛋白質(zhì)在至少1個濃度處理下表達豐度下調(diào)（圖2）。

2.2 差異表達蛋白的功能分析和GO分析

功能分析發(fā)現(xiàn)這些差異表達的蛋白質(zhì)主要涉及到光合作用（43%）、能量代謝 （9%）、氧化還原平衡 （13%）、蛋白質(zhì)合成、折疊、加工與降解 （19%），信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（3%）（圖3）。GO分析發(fā)現(xiàn)這些蛋白質(zhì)主要涉及到光合過程、防御和非生物脅迫應(yīng)答等生物學(xué)過程（圖4）。

2.3 H2S調(diào)控的差異蛋白的功能相關(guān)性分析

不同濃度的H2S對水稻幼苗葉片的效應(yīng)主要是影響葉片的光合作用，還影響蛋白質(zhì)的合成、折疊，以及植物體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生和清除系統(tǒng)；H2S還影響能量的合成代謝[18]。

與光合作用相關(guān)的蛋白包括1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亞基、二磷酸核酮糖羧化酶大鏈、細(xì)胞色素b6-f復(fù)合體鐵硫亞基、葉綠體磷酸核酮糖激酶、放氧復(fù)合體等。其中細(xì)胞色素b6-f是電子傳遞鏈中的重要電子傳遞體，而1， 5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亞基是羧化酶的活性亞基，3-磷酸甘油醛脫氫酶是CO2還原階段的重要酶，這2個蛋白在植物光合過程中參與CO2的固定和光呼吸的調(diào)節(jié)，并且在凈光合作用的過程中起關(guān)鍵作用，表明信號分子H2S影響了光合作用的電子傳遞及碳同化2個主要過程。同時我們亦發(fā)現(xiàn)部分與光合作用相關(guān)的蛋白表達量在低濃度時上調(diào)，在1.6、3.2 mmoL/L時表達量則下調(diào)，說明低濃度H2S能促進光合作用，而高濃度時則抑制[12]。

3 結(jié)論

通過對硫化氫影響水稻幼苗葉片的差異蛋白質(zhì)表達譜分析，我們發(fā)現(xiàn)硫化氫調(diào)控了光合作用、能量代謝、氧化還原平衡、蛋白質(zhì)合成、折疊、加工與降解、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過程，這些生物學(xué)過程主要參與植物的光合作用、防御，及對非生物脅迫的應(yīng)答等作用。特別是光合作用過程，其正常的運轉(zhuǎn)是植物生長發(fā)育的重要保證，這些蛋白質(zhì)直接影響與光合作用有關(guān)酶的活化、CO2的固定、光系統(tǒng)單位和電子傳遞鏈相關(guān)構(gòu)成來調(diào)節(jié)光合作用，從而影響水稻幼苗的正常代謝而造成的。蛋白質(zhì)是基因表達的產(chǎn)物，對其了解越多，越能客觀準(zhǔn)確地揭示相關(guān)的生命現(xiàn)象，本試驗采用蛋白質(zhì)組學(xué)方面的技術(shù)來研究H2S處理下水稻幼苗葉片中的相關(guān)蛋白，從而有助于了解硫化氫對水稻幼苗生長發(fā)育的影響。

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