贊皇棗黑腐病菌的生物學特性研究

趙曉霞++王夢亮++高芬

摘要：細極鏈格孢菌（Alternaria tenuissima）是引起山西石樓贊皇棗黑腐病的主要病原菌之一，對該病原菌的主要生物學特性進行了研究。采用菌絲生長速率法、血球計數板觀察法和凹玻片懸滴法，研究不同培養(yǎng)基、碳源、氮源、溫度、pH和光照對該病原菌菌絲生長、分生孢子產量以及孢子萌發(fā)的影響。Alternaria tenuissima的菌絲適宜在PDA、SCS和CZA培養(yǎng)基上生長，其中PDA是最佳的產孢培養(yǎng)基。以CZA為基礎培養(yǎng)基時，葡萄糖和甘油為菌絲生長的最佳碳源，而無碳培養(yǎng)基上產孢量最大；硝酸鈉為氮源時最利于菌絲生長和產孢。菌絲在24～32 ℃生長速度最快，24～28 ℃時產孢量最大；在pH 6～10范圍內菌絲均能良好生長，pH 10時產孢量最大；光照對菌絲生長速率影響不明顯，黑暗條件下產孢量最大。分生孢子在24 h時即可達到基本萌發(fā)，黑暗條件下28 ℃時，pH 6～7為最佳萌發(fā)條件。Alternaria tenuissima對營養(yǎng)利用和環(huán)境條件的適應能力較強，給贊皇棗黑腐病的防治造成了困難。

關鍵詞：贊皇棗；黑腐??；細極鏈格孢菌（Alternaria tenuissima）；生物學特性

中圖分類號：S436.65 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）03-0471-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.03.018

Biological Characteristics of Alternaria Tenuissima， a Pathogenic Bacteria of Black Rot on Zanhuang Jujube

ZHAO Xiao-xia， WANG Meng-Liang， GAO Fen

（Institute of Applied Chemistry， Shanxi University， Taiyuan 030006， China）

Abstract： In order to study the main biological characteristics of the major pathogenic bacteria of black rot on Zanhuang jujube（Alternaria tenuissima），the effects of the medium， the sources of nitrogen and carbon，temperature，pH and illumination under different conditions on the mycelia growth，conidial production and conidial germination of Alternaria tenuissima were studied by the mycelium growth rate，blood cell counting chamber observation and concave slide pendent drop methods. The results showed that，A. tenuissima grew well in PDA，SCS and CZA，in which PDA was the optimal medium for conidial production. When CZA was used as the basic medium，glucose and glycerin were the optimum carbon sources for mycelia growth，and the carbonless medium was the maximum producer of conidia. The sodium nitrate was the beneficial nitrogen sources for mycelia growth and conidial production. The mycelia grew at the fastest rate at 24～32 ℃ and the conidial production was the highest at 24～28 ℃. The mycelia could grow well at pH 6～10 and the conidial production was the highest at pH 10. Illumination had no significant effect on the mycelia growth rate，while darkness was proved the most favorable condition for the conidia production. Normally the conidia could germinate in 24 h，and the optimum conditions for the conidial germination of A. tenuissima were 24 h，darkness，28 ℃ and pH 6～7. A. tenuissima had strong adaptive capacity to the utilization of nutrition and environmental conditions，therefore made difficulties to the prevention and control of black rot on Zanhuang jujube.

Key words： Zanhuang jujube； black rot； Alternaria tenuissima； biological characteristics

贊皇棗（Zanhuang jujube）原產河北省贊皇縣，是中國700多個棗品種中惟一的自然三倍體，素以整齊個大、皮薄肉厚盛譽天下[1]。贊皇棗在全國各地均有引種栽培，目前已是山西省的主栽優(yōu)良品種之一。近年隨著栽培面積的迅速發(fā)展，黑腐病的發(fā)生愈來愈重，在中國北方地區(qū)，流行年份病果率可達50%以上，重者甚至絕收[2，3]。2011-2013年，山西省石樓縣贊皇棗種植區(qū)的病果率達50%～60%，致使產量和品質急劇下降，成為生產上亟待解決的難題。前期研究表明，細極鏈格孢菌（Alternaria tenuissima）是引起該地區(qū)贊皇棗黑腐病的主要病原菌之一[4]。本文針對該病菌的生物學特性進行系統(tǒng)研究，以期全面了解黑腐病的發(fā)生規(guī)律，進而為科學防治提供依據。

鏈格孢屬（Alternaria Nees）真菌為世界性分布，具腐生、內生和致病性[5]，能侵染危害多種農作物，且作為棗果致病菌多有報道，可單獨致病，也可與其他菌一起混合侵染宿主。如A. tenuissima（Fr.） Wiltshire可引起冬棗黑斑病[6]，而A. alternata（Fries） Keissler除引起壺瓶棗褐斑病[7]外，也是冬棗黑點病的致病菌之一[8]，同時，還可與Irpex lacteus、Penicillium expansum、Cladosporium tenuissimum復合侵染導致壺瓶棗縮果病[9]，與Phoma destructive Plowr、Fusicoccum sp.復合侵染導致棗鐵皮病[10]。

鏈格孢屬真菌適應性強、種級特征變異較大，其致病機理因侵染方式及所處生態(tài)環(huán)境不同又有差異，致使病害防治十分困難。了解致病菌的生物學特性有助于掌握發(fā)病規(guī)律，從而采取合理的防治措施。目前，關于鏈格孢菌生物學特性的研究報道較多，但不同種間呈現一定差別。例如引起新疆棗縮果病的A. alternata （Fr.）Keissler菌絲生長適宜溫度為25～30 ℃，適宜pH為6～10；分生孢子萌發(fā)最適溫度為28 ℃，pH為10，且隨濕度增加，分生孢子萌發(fā)率上升[11]。引起紅棗葉斑病的A. tenuissima和A. alternata的菌絲生長適宜溫度為25～30 ℃，適宜pH為7～9[12]。毛葉棗黑斑病菌A. alternaria生長和產孢的溫度范圍為10～35 ℃，適宜溫度25～30 ℃；pH 3～11時均能生長和產孢，pH 6～7時最適生長，pH 5時最適產孢；孢子萌發(fā)率在25 ℃和pH 7時最高，且在飽和濕度再加水滴的條件下孢子才能很好萌發(fā)[13]。目前，國內外尚沒有針對贊皇棗黑腐病菌A. tenuissima進行生物學特性研究的報道。本文通過測定不同培養(yǎng)基、碳源和氮源，以及溫度、酸堿度、光照對該病菌菌絲生長、產孢量和孢子萌發(fā)的影響，以明確其生物學特性，為深入了解贊皇棗黑腐病的多病菌侵染機理和發(fā)生規(guī)律，并根據不同致病菌的特點開發(fā)有效生防制劑，并制定合理有效的防控技術提供依據。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離及鑒定

供試病果于2013年8月采集自山西省石樓縣贊皇棗種植基地，按常規(guī)組織分離法進行病原菌分離，經菌絲尖端純化法獲得純培養(yǎng)菌株，按照柯赫氏法則回接證病，該病菌單獨侵染可導致棗果發(fā)病，說明其是引起贊皇棗黑腐病的病原菌。經形態(tài)學和ITS rDNA分子鑒定相結合鑒定該病原菌為 A. tenuissima，常規(guī)保存用于生物學特性測定。

1.2 營養(yǎng)條件對菌絲生長和產孢量的影響

孢子懸液制備：將A. tenuissima菌株轉接于PDA斜面，28 ℃活化培養(yǎng)5 d后，用無菌水洗脫孢子，調節(jié)濃度為30～40個/視野（150×），置4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

菌餅制備：取孢子懸液0.2 mL均勻涂布在PDA平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)2 d后，用無菌打孔器制備菌餅（d=7 mm），待用。

菌絲生長測定：接種菌餅于各處理培養(yǎng)基平板中央，28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，隔天采用十字交叉法[14]測量菌絲生長速率，并觀察記錄菌落顏色及長勢。菌絲生長速率（mm/d）=（菌落直徑-菌餅直徑）/t。每個處理均重復3 次。

產孢量測定：測定菌絲生長速率的同時，在第六天采用血球計數板法[14]測定產孢量。方法如下：將在不同處理下生長形成的菌落，分別打取5塊菌餅（d=7 mm），放入裝有2 mL無菌水的試管中，充分振蕩制成菌懸液，用血球計數板在顯微鏡下直接計數。每處理5次重復，每重復觀察10個視野。

1.2.1 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、玉米粉培養(yǎng)基（SCS）、查氏培養(yǎng)基（CZA）、合成真菌培養(yǎng)基（CDA）、燕麥瓊脂培養(yǎng)基（OMA）和玉米吐溫80瓊脂培養(yǎng)基（CMA）。

1.2.2 碳源 以CZA為基礎，分別用葡萄糖、蔗糖、甘露醇、檸檬酸三鈉和甘油代替葡萄糖為碳源，制備培養(yǎng)基。用量以30 g葡萄糖中的含碳量為標準進行換算[15]，以不加碳源的CZA為對照。

1.2.3 氮源 以CZA為基礎，分別用硝酸鈉、尿素、硝酸銨、硫酸銨和氯化銨代替硝酸鈉為氮源[15]，制備培養(yǎng)基。用量以3 g硝酸鈉中的含氮量為標準進行換算，以不加氮源的CZA為對照。

1.3 培養(yǎng)條件對菌絲生長和產孢量的影響

培養(yǎng)方法、重復次數、對菌絲生長和產孢量的測量和計算方法同“1.2”。

1.3.1 溫度 設20、24、28、32和36℃ 5個梯度。

1.3.2 初始pH 用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl調節(jié)PDA培養(yǎng)基的pH分別至5、6、7、8、9和10。

1.3.3 光照 設24 h全光照（40 W日光燈，2 300 lx）、12 h光照/12 h黑暗交替和24 h全黑暗3種光照條件。

1.4 培養(yǎng)條件對分生孢子萌發(fā)的影響

萌發(fā)率測定：在不同條件下采用凹玻片懸滴法培養(yǎng)并觀察[16]，孢子濃度為20～30個/視野（400×）；以芽管長度超過孢子短半徑一半作為萌發(fā)標準，在顯微鏡下檢查、記錄分生孢子萌發(fā)數（檢查數>500個），計算萌發(fā)率。孢子萌發(fā)率 =（孢子萌發(fā)數/已查孢子總數）×100%。

1.4.1 時間 分別于3、6、9、12、24和36 h鏡檢，確定最佳萌發(fā)時間。

1.4.2 溫度 將孢子懸液分別置于20、24、28、32和36 ℃下培養(yǎng)，在最佳萌發(fā)時間鏡檢并統(tǒng)計萌發(fā)率。

1.4.3 初始pH 用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl調節(jié)孢子懸液pH為3、4、5、6、7、8、9、10，置最適溫度下培養(yǎng)，并在最佳萌發(fā)時間鏡檢和統(tǒng)計。

1.4.4 光照 設置24 h全光照（40 W日光燈，2 300 lx）、12 h光照/12 h黑暗交替和24 h全黑暗3種光照條件，置于最適溫度和pH下培養(yǎng)，在最佳萌發(fā)時間觀察和統(tǒng)計。

1.5 數據分析

運用SPSS 17.0軟件對數據進行差異顯著性分析，用Origin8.0軟件進行圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 營養(yǎng)條件對A. tenuissima菌絲生長和產孢量的影響

2.1.1 培養(yǎng)基 在不同培養(yǎng)基上，A. tenuissima的菌絲生長速率大小依次為：PDA>SCS>CZA>CDA>OMA>CMA（表1），其中在PDA、SCS和CZA培養(yǎng)基上菌絲生長最快，三者間無顯著差異；但菌絲致密度、菌落形態(tài)、顏色等在不同培養(yǎng)基上有一定差別（表1）。PDA培養(yǎng)基上產孢量顯著高于其他處理，與其余5種培養(yǎng)基上的產孢量相比差異顯著。

2.1.2 碳源 A. tenuissima能利用多種碳源（表2），以葡萄糖和甘油為碳源時，氣生菌絲旺盛，生長速度顯著高于其他處理。在以對照的碳源、蔗糖、甘露醇為碳源時，生長速率差異不顯著。碳源為檸檬酸鈉時生長最為緩慢，且菌落形態(tài)不規(guī)則。A. tenuissima在無碳培養(yǎng)基中產孢量最多，與其他碳源差異極顯著；檸檬酸鈉作碳源時不產孢。

2.1.3 氮源 不同氮源對菌絲生長的影響差異明顯（表2）。硝酸鈉和尿素為氮源時A. tenuissima的生長情況最好，且產孢量最大，與其他處理相比差異顯著。不添加氮源的對照培養(yǎng)基中也有孢子生成，產量僅次于硝酸鈉處理。硝酸銨、尿素和硫酸銨作氮源時不產孢。

2.2 培養(yǎng)條件對A. tenuissima菌絲生長和產孢量的影響

2.2.1 溫度 A. tenuissima在24～32 ℃之間，菌絲生長速率快，長勢良好；20 ℃時菌絲生長速度緩慢，氣生菌絲纖細稀疏；36 ℃時菌絲生長受到明顯抑制。該菌在20～32 ℃下均能產孢，最適產孢溫度為24～28 ℃，36 ℃時未見孢子產生（圖1）。

2.2.2 pH 初始pH為5～10的范圍內A. tenuissima均能生長，但在pH 6～10時，生長速度快且菌落致密，處理間差異不顯著。pH 8～10時產孢量較大，pH 10時出現顯著的產孢高峰，pH≤7時不產孢（圖1）。

2.2.3 光照 光照條件對A. tenuissima的生長影響不顯著；但對產孢量的影響較大，全黑暗條件下產孢量最大，且顯著高于全光照和光暗交替處理（圖1）。試驗中還發(fā)現在光暗交替條件下，A. tenuissima的菌落在生長過程中有同心輪紋出現。

2.3 培養(yǎng)條件對A. tenuissima分生孢子萌發(fā)的影響

2.3.1 時間 A. tenuissima的孢子萌發(fā)率隨處理時間的延長而提高，在24 h時為77%，36 h時達到81%，但二者之間差異不顯著。因此可認為24 h是孢子萌發(fā)的最佳時間（圖2）。

2.3.2 溫度 溫度對A. tenuissima的孢子萌發(fā)具有一定影響，20～36 ℃范圍內均能萌發(fā)，但28 ℃時萌發(fā)率最高，為77%，此后隨溫度的升高或降低萌發(fā)率均呈現下降趨勢（圖2）。

2.3.3 pH 酸堿度對A. tenuissima的孢子萌發(fā)影響較大（圖2）。pH 6～7時萌發(fā)情況最佳，且以pH 6時平均萌發(fā)率最高（76%），但二者間差異性不顯著；pH≤5或≥8時孢子萌發(fā)率急劇下降。

2.3.4 光照 不同光照條件對A. tenuissima孢子萌發(fā)也有一定影響，黑暗處理更利于孢子萌發(fā)，且萌發(fā)率顯著高于其他處理（圖2）。

3 討論

鏈格孢屬真菌由于兼有寄生和腐生性，適應環(huán)境能力強，可在田間、運輸及貯存過程中引發(fā)霉變，其生物學特性因宿主所處地理、氣候及生態(tài)環(huán)境不同存在差異。病原物生物學特性的研究，對于研究和掌握病害的發(fā)生、流行等具有重要意義。

對贊皇棗黑腐病菌（A. tenuissima）生物學特性的研究表明，該菌在不同培養(yǎng)基條件下均可生長和產孢，但生長速度和產孢量存在差異，說明該菌株對生長條件要求不苛刻。碳源和氮源的種類對菌絲生長和孢子產生有較大的影響。葡萄糖為碳源時，菌絲生長最為旺盛；碳脅迫利于促進孢子產生，這與王義勛等[17]的研究結果基本一致，但與鄭曉蓮等[18]研究的結果不同。硝態(tài)氮為氮源時，菌絲生長狀況最好，但氯化銨對菌絲生長有抑制作用，該結果與席興文等[19]、范文忠等[20]的報道相似，這可能與菌株遺傳特性及氮源不同形式的利用率有關。無碳或無氮條件下，從生長速率看該菌均能正常生長；從菌落形態(tài)看，則菌絲生長稀疏，不茂盛。這一現象在其他Alternaria屬真菌上也有類似情況發(fā)生[13-20]，但對病菌的致病力是否有影響，還有待研究。

山西省石樓縣產棗區(qū)屬于梁峁溝壑區(qū)，受地勢地形影響溫度高、溫差大[21]，每年7～9月上旬為贊皇棗黑腐病的發(fā)病高峰期，此時日最高溫度可達28～30 ℃。黑腐病菌（A. tenuissima）的適生溫度范圍較廣，菌絲生長、產孢及孢子萌發(fā)的最適溫度均為28 ℃，屬于中溫型病原菌，這正好與當地田間的實際發(fā)病規(guī)律相符合。

A. tenuissima的菌絲在pH 6～10時生長速度均較快，pH≥7時產孢量逐漸增加，pH 10時產孢量達高峰，但孢子萌發(fā)率在pH 6～7時最高。上述結果說明，該菌對酸堿度有很強的適應能力，偏堿性環(huán)境更利于A. tenuissima進行生殖生長，產生分生孢子，但中性條件更利于孢子萌發(fā)進行營養(yǎng)生長，該結果與王志霞等[12]的研究基本一致。王宏等[16]報道，病原菌在生長進程中，能分泌產生某些物質，從而改變培養(yǎng)液的pH，使其更利于菌絲生長。Prusky等[22，23]報道，病原菌能調節(jié)寄主植物的pH值作為增加毒力的一個機制，引起柿子黑斑病的A. alternata （Fries） Keiseler，也能改變柿子的pH，且在培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，發(fā)現培養(yǎng)基中氨含量增加，pH升高。本研究中孢子萌發(fā)和產生的最佳pH不同的原因是否在此，還待后續(xù)進行研究。

光照對A. tenuissima的菌絲生長速率影響不明顯，在任何條件下都能正常生長，但A. tenuissima的菌落在光暗交替條件下有同心輪紋出現。鄭曉蓮等[18]也報道，光暗交替可導致A. tenuis的菌落出現同心輪紋狀，輪紋寬度隨光暗間隔的時間而有差異，這一現象可能預示著光照對A. tenuissima生長還存在著一些未知的影響。孢子的產生和萌發(fā)對光照條件比較敏感，黑暗條件下產孢量最大、萌發(fā)率最高，可見黑暗條件可促進該菌分生孢子的產生和萌發(fā)。由此可知，光照雖并非制約病菌侵染的決定性因素，但在連續(xù)陰天、光照強度降低時，更利于病害的流行，同時也暗示了帶菌棗果在貯藏環(huán)境下引發(fā)黑腐病的情況可能更嚴重。

綜上可知，A. tenuissima對營養(yǎng)利用和環(huán)境條件的適應能力均較強，這給贊皇棗黑腐病的防治帶來了一定的困難。因此，針對該菌的生物學特性和當地的氣候條件，采取合理的綜合防治措施，對控制該病的發(fā)生和蔓延至關重要。

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