來曲唑治療大鼠子宮內膜異位癥模型異位病灶的作用機制

朱君+張文博+易金玲

[摘要] 目的 研究來曲唑治療大鼠子宮內膜異位癥的作用機制。方法 采用子宮內膜自體移植法進行子宮內膜異位癥建模，2015年3月，選擇30只建模成功的大鼠，根據隨機數字表法分為來曲唑組和對照組，各15只。曲唑組大鼠每日給藥來曲唑灌胃，給藥劑量為0.26 mg/kg，1次/d；對照組灌胃等體積的0.9%NaCl注射液。采用免疫組織化學法對異位病灶組織中細胞間黏附因子（ICAM-1）、基質金屬蛋白酶9（MMP-9）、血管內皮生長因子（VEGF）的表達情況。逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測病灶中白細胞介素6（IL-6）mRNA、腫瘤因子（TNF）αmRNA，NF-κB mRNA，細胞色素芳香化酶（P450 arom）mRNA，環(huán)加氧酶2（COX-2）mRNA的表達。 結果 治療后來曲唑組子宮異位內膜體積較對照組顯著降低[（158±23）mm3 vs （28±3）mm3]，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。來曲唑組雌二醇、孕酮水平均顯著低于對照組[（30.5±1.6）ng/L vs （38.6±1.9） ng/L，（60±6）μg/L VS （37±3）μg/L]，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；來曲唑組大鼠睪酮、促卵泡生成素和促黃體生成素水平均顯著高于對照組[（523±65） ng/L vs （1982±271）ng/L，（5.13±0.18） U/L vs （6.42±0.23） U/L，（4.71±0.28）U/L vs （5.91±0.31）U/L]，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。來曲唑組大鼠異位子宮內膜組織中的ICAM-1、MMP-9和VEGF的表達水平均顯著低于對照組[（23.6±2.3）vs（40.8±2.9），（22.7±1.8）vs（39.6±2.8），（28.4±1.8）vs（45.3±1.9）]，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。來曲唑組IL-6 mRNA，TNF-αmRNA和NF-κB mRNA表達水平均顯著低于對照組[（0.281±0.021）vs（0.805±0.012），（0.434±0.011）vs（0.981±0.013），（0.403±0.014）vs（0.972±0.015）]，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。來曲唑組大鼠異位病灶中P450arom mRNA和COX-2 mRNA表達量顯著低于對照組[（0.257±0.024）VS（0.465±0.022），（0.364±0.024）vs（0.471±0.031）]，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論 來曲唑對子宮內膜異位癥模型大鼠異位病灶具有明顯的抑制作用，其作用機制可能是來曲唑能夠降低ICAM-1、MMP-9、VEGF、IL-6 mRNA、TNF-αmRNA和NF-κB mRNA等細胞因子的轉錄水平以及降低P450arom和COX-2等催化酶水平抑制雌激素合成有關。

[關鍵詞] 子宮內膜異位癥；來曲唑；大鼠；作用機制

[中圖分類號] R711 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2017）01（b）-0005-05

[Abstract] Objective To research the function mechanism of letrozole in treatment of rat endometriosis model ectopic lesions. Methods The model of endometriosis was established by the endometrial auto-transplantation， 30 rats with successful model were selected and randomly divided into two groups with 15 cases in each， the letrozole group adopted letrozole with 0.26 mg/kg once a day for gavage， the control group adopted the 0.9%NaCl injection for gavage， and the expression of ICAM-1， MMP-9 and VEGF in the ectopic lesion tissues was tested by the immunohistochemical method， and the expression of 6（IL-6）mRNA， （TNF）αmRNA， NF-κB mRNA， （P450arom）mRNA and 2（COX-2）mRNA were tested by the RT-PCR. Results After treatment， ectopic endometrial volume in the letrozole group obviously decreased compared with that in the control group[（158±23）mm3 vs （28±3）mm3]， and the difference had statistical significance（P<0.05）， and the estradiol and corporin levels in the Letrozole group were obviously lower than those in the control group [（30.5±1.6）ng/L vs （38.6±1.9）ng/L，（60±6）μg/L vs （37±3）μg/L]， and the difference had statistical significance（P<0.05）， the testoterone， follicle-stimulating hormone and prolan B levels in the letrozole group were obviously higher than those in the control group[（523±65）ng/L vs （1982±271）ng/L，（5.13±0.18）U/L vs （6.42±0.23）U/L，（4.71±0.28）U/L vs （5.91±0.31）U/L]， and the difference had statistical significance（P<0.05）， and the expression level of ICAM-1，MMP-9 and VEGF in the rat ectopic endometrium tissue in the letrozole group was obviously lower than that in the control group[（23.6±2.3）vs （40.8±2.9），（22.7±1.8）vs（39.6±2.8），（28.4±1.8）vs（45.3±1.9）]， and the difference had statistical significance（P<0.05）， and the expression level of IL-6 mRNA，TNF-αmRNA and NF-κB mRNA in the letrozole group was obviously lower than that in the control group[（0.281±0.021） vs （0.805±0.012），（0.434±0.011） vs（0.981±0.013），（0.403±0.014） vs（0.972±0.015）]， and the difference had statistical significance（P<0.05）， and the P450arom mRNA and COX-2 mRNA expression level in the rat ectopic focus in the Letrozole group was obviously lower than that in the control group [（0.257±0.024）vs（0.465±0.022），（0.364±0.024）vs（0.471±0.031）]， and the difference had statistical significance（P<0.05）. Conclusion Letrozole has an obvious restraint effect on the rat endometriosis model ectopic lesions， and the function mechanism may be related to the Letrozole in reducing the transcriptional level of ICAM-1， MMP-9， VEGF， IL-6 mRNA， TNF-αmRNA and NF-κB mRNA and catalase levels such as P450arom and COX-2 used to inhabit the estrogen biosynthesis.

[Key words] Endometriosis uterine； Letrozole； Rat； Function mechanism

子宮內膜異位癥是婦科常見的一種疾病，該病在育齡婦女人群中的發(fā)病率可高達10%，而在不育婦女當中的發(fā)病率為30%～60%，這說明子宮內膜異位癥與婦女不育有著密切關系[1]。近年來關于該病的研究逐漸增多，但其發(fā)病機制仍未能得到合理解釋，Chen等[2]發(fā)現子宮內膜異位癥患者異位病灶局部存在高濃度雌激素，從而認為雌激素合成重要限速酶芳香化酶P450與子宮內膜異位癥的發(fā)生存在密切關系。臨床對該病的治療方式主要有手術和藥物治療，促性腺激素釋放激素激動劑類藥物是目前公認的能夠有效治療子宮內膜異位癥的藥物，臨床應用較多，此外，諸如達那唑、孕激素以及短效口服避孕藥等藥物也可有效緩解患者臨床癥狀[3]。但激素類藥物的使用往往會引起多種并發(fā)癥，近年來關于芳香化酶抑制劑類藥物在子宮內膜異位癥治療中的研究逐漸增多，初步認為其具有較好的臨床療效，但關于其作用機制尚不明確[4]。為此，該研究擬以大鼠為實驗動物，2015年3月，選擇30只大鼠，構建大鼠子宮內膜異位癥模型，旨在探討第三代芳香化酶抑制劑來曲唑對子宮內膜異位癥的作用及其機制，為其臨床推廣提供依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇無特定病原體雌性，性成熟未孕大鼠30只（山東魯抗醫(yī)藥公司實驗動物室，許可證號：SCXK魯20050017），體質量（228.4±10.6）g；來曲唑（生產批號：201411253），0.9%NaCl注射液（生產批號：201410242）。雌二醇放射免疫分析試劑盒，孕酮放射免疫試劑盒，睪酮放射免疫分析試劑盒，人促卵泡生成激素放射免疫試劑盒，人促黃體生成素放射免疫分析試劑盒；基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinases-9，MMP-9）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α），人核轉錄因子κBp65（Human Nuclear transcription factor-κBp65， NFκBp65），檢測試劑盒購；BCA蛋白定量試劑盒，SP免疫組織化學染色試劑盒，3，3-二氨基聯苯胺顯色試劑盒。

1.2 大鼠子宮內膜異位癥模型構建

大鼠購進后適應性飼養(yǎng)1周后開始實驗，每日對大鼠進行陰道圖片檢查，選擇具有連續(xù)2個規(guī)律性較強的動情周期的大鼠，在第3個動情周期時采用子宮內膜自提移植法[5]進行建模，為避免傷口感染，所有操作應在無菌環(huán)境下進行。建模操作完成后第4周在動情期進行開腹檢查，評估模型構建情況，建模成功標準為移植物囊性增大，內包含清亮的囊液，囊壁表面形成血管和少量的結締組織，測量囊腫體積。病理學組織檢查可見間質細胞、腺上皮細胞和腺體。

1.3 動物分組及處理

選擇30只建模成功的雌性大鼠，按隨機數表法隨機分為來曲唑組和對照組，各15只，體重218～244 g，平均（231±3）g，曲唑組大鼠每日給藥來曲唑灌胃，給藥劑量為0.26 mg/kg，1次/d；對照組灌胃等體積的0.9%NaCl注射液。兩組大鼠均灌胃給藥3周，停藥后進行開腹。

1.4 樣品采集

以水合氯醛腹腔注射進行麻醉，通過左側股動脈切斷放血法處死試驗動物，在其死亡前采集所需標本。①非抗凝管采集大鼠股動脈血4 mL，凝固后以3 000 r/min離心15 min，離心半徑13.5 cm，分離血清，在4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?4 h以內）。②采用兩腳規(guī)測定異位子宮內膜生長情況 。③完全摘取異位子宮內膜，置于離心管中，放在液氮中保存?zhèn)溆谩＂墚愇徊≡罱M織以甲醛固定，石蠟包埋，用于免疫組織化學檢測各項指標。

1.5 觀察指標及檢測方法

①采用放射免疫法檢測各組大鼠血清中雌二醇，睪酮，促黃體生成素，孕酮，促卵泡生成素水平。②采用免疫組織化學法對異位病灶組織中細胞間黏附因子1（intercellular adhesion factor-1，ICAM-1）、MMP-9、VEGF的表達情況。在光學顯微鏡下分析結果，切片組織或細胞中發(fā)現黃褐色顆粒者為陽性，每張切片選取5個視野，在AHB-2-HL攝像系統(tǒng)提取數據，按平均光密度值定量。③逆轉錄聚合酶鏈式反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測病灶IL-6mRNA、TNF-αmRNA，NF-ΚB mRNA，細胞色素芳香化酶（P450arom）mRNA，環(huán)加氧酶2（cyclo-oxygen-ase-2，COX-2）mRNA的表達。釆用Trizol 一步抽提法抽提組織mRNA；逆轉錄反應參照逆轉錄試劑盒說明書進行；標準PCR反應體系擴增基因；半定量分析法分析目的基因。④分別在造模后第1次開腹及停藥后第2次開腹時測量異位子宮內膜的體積。

1.6 統(tǒng)計方法

應用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件對數據進行分析，計量資料用均值±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組大鼠異位子宮內膜生長情況

治療前兩組大鼠子宮異位內膜體積差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。對照組治療前后子宮異位內膜體積差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；來曲唑組治療后子宮異位內膜體積較治療前顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。治療后來曲唑組子宮異位內膜體積較對照組顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 兩組大鼠血清激素水平比較

來曲唑組大鼠雌二醇，孕酮水平均顯著低于對照組，睪酮，促卵泡生成素和促黃體生成素水平均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3 兩組大鼠異位子宮內膜組織中的ICAM-1，MMP-9和VEGF的表達情況

來曲唑組大鼠異位子宮內膜組織中的ICAM-1，MMP-9和VEGF的表達水平均顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表3。

2.4 兩組大鼠異位內膜組織中IL-6mRNA，TNF-αmRNA和NF-κBmRNA

來曲唑組IL-6mRNA，TNF-αmRNA和NF-κBmRNA表達水平均顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。來曲唑組大鼠異位病灶中P450arom mRNA和COX-2 mRNA表達量顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表4。

3 討論

子宮內膜異位癥是一種雌激素依賴性疾病，機體除卵巢外，脂肪、皮膚以及異位內膜均可分泌雌激素[6]。目前國際認可的治療子宮內膜異位癥的藥物促性腺激素釋放激素雖能取得一定的臨床療效，但其僅能抑制卵巢合成雌激素，而對其他組織分泌雌激素無作用，因此該類藥物臨床療效并不理想，且治療后容易復發(fā)。該研究主要研究藥物來曲唑是第三代芳香化酶抑制劑，研究表明其能有效阻斷卵巢或其他組織中的雄激素轉化為雌激素的途徑，進而降低機體血清和異位病灶局部雌激素水平，從而發(fā)揮治療作用[7-8]。該研究通過用來曲唑干預采用自體移植構建子宮內膜異位癥模型的大鼠，分析其對異位病灶體積的影響評估其臨床療效，同時對多種血清激素水平及多種細胞因子和酶的表達情況進行測定，旨在探討其作用機制，最終為其在臨床推廣應用奠定基礎。

該研究結果表明治療前兩組大鼠異位病灶體積差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），進行3周干預后，來曲唑組大鼠異位病灶體積顯著縮低于對照組（P<0.05），說明來曲唑能夠有效治療大鼠子宮內膜異位癥。這一結果與相關研究[9]應用芳香化酶抑制劑能夠縮小病灶基本相符。上述結果說明芳香化酶抑制劑在治療子宮內膜異位癥方面具有較好的前景。

該研究對兩組大鼠血清激素水平進行分析，結果表明來曲唑組雌二醇（E2），孕酮（P）水平均顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；來曲唑組大鼠T，FSH和LH水平均顯著高于對照組（P<0.05）。出現這種結果的原因可能是由于來曲唑的使用使大鼠體內雌激素水平快速降低，進而激活了下丘腦-垂體-卵巢軸的負反饋作用，繼而使LH和FSH水平上升。

此外，該研究還分析了干預后病灶組織中ICAM-1、MMP-9和VEGF的表達水平，這是因為子宮內膜異位癥的形成需經過“黏附、侵襲和血管形成”3個階段，而上述3種細胞因子經研究發(fā)現在子宮內膜異位癥患者的病灶、血清及腹腔液中均有較高水平的存在，而治療后均顯著降低[10-12]。同時ICAM-1在異位病灶中的存在能夠增強異位內膜的穩(wěn)定性及黏附性，從而促使其在異位部位的生長；MMP-9能夠促進血管內皮細胞出芽形成新血管，增強細胞間黏附，從而促進子宮異位內膜的侵襲和生長；VEGF則能夠增強機體微靜脈、小靜脈的通透性，誘導新血管的形成[13]。該研究結果表明，來曲唑組大鼠異位子宮內膜組織中的ICAM-1、MMP-9和VEGF的表達水平均顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），說明來曲唑可能通過抑制上述細胞因子的表達，降低異位病灶組織的侵襲性和穩(wěn)定性，從而發(fā)揮治療作用。

IL-6是一種重要的多功能細胞因子，其能夠增強腹腔炎癥反應，加快異位灶細胞的增殖、黏附和血管形成；TNF-α則能夠增強子宮內膜基質細胞與細胞外基質之間的黏附力，與子宮內膜異位癥的嚴重程度密切相關[14]；NF-κB則被認為是子宮內膜發(fā)病機制中的樞紐，其能誘導多種致炎因子、趨化因子和黏附因子的表達。該研究結果表明，來曲唑組IL-6mRNA、TNF-αmRNA和NF-κB mRNA表達水平均顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這一結果說明了來曲唑對子宮內膜異位癥治療作用的發(fā)揮與其能夠降低上述因子表達水平密切相關。這與王康等[15]研究表明來曲唑能夠顯著降低IL-6mRNA、TNF-αmRNA和NF-κB mRNA表達，且劑量越高，降低越明顯基本相符。

P450arom是雌激素合成的限速酶，而前列腺素E則是 P450arom 生成的強誘導劑，同時前列腺素E的合成受COX-2限制。該研究結果表明來曲唑組大鼠異位病灶中P450arom mRNA和COX-2 mRNA表達量顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），說明來曲唑通過抑制P450arom和COX-2的表達多途徑抑制雌激素的合成，從而發(fā)揮治療作用。這與宋淑芳等[16]研究認為來曲唑能夠顯著降低P450arom[（44.4±10.08）vs（23.7±3.68）]和COX-2[（40.3±4.00）vs（21.6±3.44）]蛋白表達基本一致。

綜上所述，來曲唑對子宮內膜異位癥模型大鼠異位病灶具有明顯的抑制作用，其作用機制可能是來曲唑能夠降低ICAM-1、MMP-9、VEGF、IL-6、TNF-α和NF-κB 等細胞因子水平以及降低P450arom和COX-2等催化酶水平抑制雌激素合成有關。

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