基因編輯技術(shù)簡介

陳兆亮+康珍

摘 要 基因編輯技術(shù)是對基因組進行精確定點改造的一項新技術(shù)，同時也是研究基因生物功能的一個有力工具。經(jīng)過數(shù)年的發(fā)展，目前主要有鋅指核酸酶、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶和RNA引導(dǎo)的CRISPR/Cas核酸酶技術(shù)三種新型的基因編輯技術(shù)。綜述了三種技術(shù)的結(jié)構(gòu)原理和作用機理，并對基因編輯技術(shù)進行了展望。

關(guān)鍵詞 基因編輯 鋅指核酸酶 轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶 CRISPR/Cas9核酸酶

中圖分類號 Q-49 文獻標(biāo)志碼 E

基因編輯是指對基因組進行定點修飾的一項新技術(shù)。利用該技術(shù)，可以精確地定位到基因組的某一位點上，在這位點上剪斷靶標(biāo)DNA片段并插入新的基因片段。此過程既模擬了基因的自然突變，又修改并編輯了原有的基因組，真正達成了“編輯基因”。

1 研究背景

近年來，隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，研究人員正通過定點突變的方法使目的基因完全失活來研究特定基因的功能，這是一種最直接有效的研究方法。隨著高特異性及更具操作性的人工核酸酶的出現(xiàn)和技術(shù)體系的完善，基因編輯技術(shù)獲得了飛速發(fā)展，并將靶向基因操作推向高潮，使得定點基因敲除、敲入變得更為簡單且高效。與傳統(tǒng)的以同源重組和胚胎干細胞（ES）技術(shù)為基礎(chǔ)的基因打靶技術(shù)相比，基因編輯新技術(shù)保留了可定點修飾的特點，并應(yīng)用到更多的物種上，效率更高，構(gòu)建時間更短，成本更低。

2 基因編輯原理

現(xiàn)代基因編輯技術(shù)的基本原理是相同的，即借助特異性DNA雙鏈斷裂（DSB）激活細胞的天然修復(fù)機制，包括非同源末端連接（NHEJ）和同源重組修復(fù)（HDR）兩條途徑。

2.1 非同源末端連接

非同源末端連接是一種低保真度的修復(fù)過程，斷裂的DNA修復(fù)重連的過程中會發(fā)生堿基隨機地插入或丟失，造成移碼突變，使基因失活，實現(xiàn)目的基因敲除。如果一個外源性供體基因序列存在，NHEJ機制會將其連入雙鏈斷裂DSB位點，從而實現(xiàn)定點的基因敲入。

2.2 同源重組修復(fù)

同源重組修復(fù)是一種相對高保真度的修復(fù)過程，在一個帶有同源臂的重組供體存在的情況下，供體中的外源目的基因會通過同源重組過程完整地整合到靶位點，不會出現(xiàn)隨機的堿基插入或丟失。若在一個基因兩側(cè)同時存在DSB及同源供體的情況下，可以進行原基因的替換。

3 基因編輯技術(shù)的種類

目前主要有3種基因編輯技術(shù)，分別為人工核酸酶介導(dǎo)的鋅指核酸酶（ZFN）技術(shù)；轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（TALEN）技術(shù)；RNA引導(dǎo)的CRISPR/Cas核酸酶技術(shù)（CRISPR/Cas RGNs）。

3.1 ZFN基因組編輯技術(shù)

ZFN技術(shù)是第一代基因編輯技術(shù)，是基于鋅指蛋白發(fā)展起來的。1986年，Diakun等首先在真核生物轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合區(qū)域發(fā)現(xiàn)了Cys2/His2鋅指模塊。1996年，Kim等首次人工連接了鋅指蛋白與核酸內(nèi)切酶。2005年，Urnov等發(fā)現(xiàn)一對由4個鋅指連接而成的ZFN，可識別24 bp的特異性序列，由此揭開了ZFN在基因編輯中的應(yīng)用。

ZFN由鋅指蛋白（ZFP）和FokⅠ核酸內(nèi)切酶組成。其中，由ZFP構(gòu)成的DNA識別域能識別DNA特異位點并與之結(jié)合，而由FokⅠ構(gòu)成的切割域能執(zhí)行剪切功能，兩者結(jié)合可使靶位點的雙鏈DNA斷裂。于是，細胞可以通過同源重組修復(fù)機制和非同源末端連接修復(fù)機制來修復(fù)DNA。HDR修復(fù)有可能會對靶位點進行恢復(fù)修飾或者插入修飾，而NHEJ修復(fù)極易發(fā)生插入突變或缺失突變。兩者都可造成移碼突變，由此達到基因敲除的目的。

ZFN誘導(dǎo)的基因編輯技術(shù)可應(yīng)用于很多物種及基因位點的編譯，具有較好的發(fā)展?jié)摿?。但是目前?個缺陷制約了該技術(shù)的推廣：① 以現(xiàn)有的策略設(shè)計高親和性的ZFN，需投入大量的工作和時間；② 在細胞中持續(xù)表達ZFN對細胞有毒性；③ 雖然三聯(lián)體設(shè)計具有一定特異性，但仍存在不同程度的脫靶效應(yīng)。

3.2 TALEN基因組編輯技術(shù)

2009年，研究者在植物病原體黃單胞菌中發(fā)現(xiàn)一種轉(zhuǎn)錄激活子樣因子效應(yīng)物，是特異識別DNA序列的基礎(chǔ)。TALEN識別模塊一般由34個氨基酸組成，其中第12、13位氨基酸高度可變，被稱為重復(fù)可變的雙氨基酸殘基（RVD）。RVD決定了對特異性核苷酸的識別，其與A、G、C、T有恒定的對應(yīng)關(guān)系，如即NI識別A，NG識別T，HD識別C，NN識別G。隨后，TALEN特異識別DNA序列的特性被用來取代ZFN技術(shù)中的鋅指蛋白。它的可設(shè)計性更強，不受上下游序列的影響，具備比ZFN更廣闊的應(yīng)用潛力。

TALEN包含2個TALEN蛋白，每個TALEN都是由TALE array與FokⅠ融合而成。在進行基因編輯時，其中一個TALEN靶向正義鏈上的靶位點，另一個則靶向反義鏈上的靶位點。然后FokⅠ形成二聚體，在靶向序列中間的spacer處切割DNA，造成雙鏈DNA斷裂，隨后細胞啟動DNA損傷修復(fù)機制，F(xiàn)okⅠ針對不同的TALEN骨架，其最適宜的spacer長度不同，其長度范圍一般為12～20 bp。實驗結(jié)果表明，TALEN在靶向DNA時，第一個堿基為T時其結(jié)合效果更佳。

目前，TALEN已經(jīng)成功應(yīng)用于酵母、哺乳動物和植物的特異性位點來進行基因打靶，與鋅指核酸酶系統(tǒng)相比有較大的應(yīng)用優(yōu)勢，但仍然有些問題需要解決，例如脫靶效應(yīng)、TALEN與基因組進行特異結(jié)合受鄰近序列影響等。

3.3 CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)是最近生命科學(xué)領(lǐng)域的一個熱點話題，該項技術(shù)的興起使基因編輯領(lǐng)域得到飛躍發(fā)展。CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)源于對細菌與古生菌的研究。早在1987年，日本的研究人員發(fā)現(xiàn)E.coli中存在一些29 bp的重復(fù)序列，但他們當(dāng)時并不清楚這些序列的具體功能，經(jīng)過幾十年的研究，在2007年終于證明這種重復(fù)序列與細菌的獲得性免疫有關(guān)。

2002年，Jansen等將這些間隔排列的重復(fù)序列命名為CRISPR，并且鑒定出了與CRISPR序列位于同一基因簇的CRISPR相關(guān)蛋白Cas，同時將CRISPR基因簇分為三個不同的類型（Ⅰ型、Ⅱ型與Ⅲ型），在三種不同類型的CRISPR系統(tǒng)中，Ⅱ型CRISPR/Cas9系統(tǒng)最為簡單。

CRISPR/Cas9為一種可編輯的短RNA介導(dǎo)的DNA核酸內(nèi)切酶，由Cas9核酸內(nèi)切酶與sgRNA構(gòu)成。轉(zhuǎn)錄的sgRNA折疊成特定的三維結(jié)構(gòu)后與Cas9蛋白形成復(fù)合體，指導(dǎo)Cas9核酸內(nèi)切酶識別特定靶位點，在間隔序列毗鄰區(qū)（PAM）序列上游切割DNA，造成雙鏈DNA斷裂，并啟動DNA損傷修復(fù)機制。

經(jīng)研究，從不同菌種中分離的CRISPR/Cas系統(tǒng)，其CrRNA（或者是人工構(gòu)建的sgRNA）靶向序列的長度不同，PAM序列也可能不同。

4 基因編輯技術(shù)的展望

隨著越來越多物種基因組測序的完成，基因功能的研究成為后基因時代的重點。基因編輯技術(shù)既可以用正?；蛱娲蛔兓蜻M行性狀改良和基因治療，也可以用突變基因代替正?；蜻M行基因功能的研究。與傳統(tǒng)的基因打靶技術(shù)相比，基因編輯技術(shù)擺脫了對ES細胞的限制，可以應(yīng)用于更多的物種，且定向修飾更加精確，效率更高，所需時間更短，得到的突變可以通過種系遺傳。其中，CRISPR系統(tǒng)可以同時進行多靶點的切割，易于得到純合子突變體。

伴隨基因編輯技術(shù)的發(fā)展，與之相關(guān)的多基因連接策略，表達調(diào)控策略等配套技術(shù)體系正在形成，為今后大規(guī)模，多基因動物的改良奠定了基礎(chǔ)。更多基因組編輯畜禽的出現(xiàn)會給畜牧業(yè)經(jīng)濟，人類營養(yǎng)水平和生活質(zhì)量帶來革命性地影響?？梢灶A(yù)見，以基因編輯技術(shù)為核心的現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)將進入黃金時期。

總之，基因編輯技術(shù)的研發(fā)還處于起步階段，但其已表現(xiàn)出的相對于基因打靶技術(shù)的優(yōu)勢已十分明顯。在未來的發(fā)展中，基因編輯技術(shù)必將成為生命科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域研究與應(yīng)用的重要工具。

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