苦蕎葉總黃酮提取純化工藝研究

韓雪梅, 許效群，王緣，苗靈香，趙文婷

(山西農業(yè)大學 食品科學與工程學院，山西 太谷 030801)

苦蕎葉總黃酮提取純化工藝研究

韓雪梅, 許效群*，王緣，苗靈香，趙文婷

(山西農業(yè)大學 食品科學與工程學院，山西 太谷 030801)

[目的]合理開發(fā)利用苦蕎麥生物資源，延伸苦蕎產業(yè)鏈，提高其經(jīng)濟效益；探索適合苦蕎葉黃酮工業(yè)化生產的工藝方法。[方法]以盛花期的苦蕎葉為原料，采用超聲波輔助法提取總黃酮，并通過大孔樹脂吸附法進行純化，對提取、純化工藝進行了優(yōu)化。[結果]總黃酮最佳提取工藝為：以60%的乙醇為提取劑，提取溫度為72 ℃，料液比為1∶32 g·mL-1，超聲波處理時間為31 min，超聲波功率為101 W，此工藝條件下苦蕎葉總黃酮得率為10.2523%；AB-8樹脂對苦蕎葉總黃酮純化效果最好，最佳純化工藝為：上樣液pH為5，濃度為1.50 g·L-1，流速為1.00 mL·min-1，上樣量為33 mL·g-1樹脂，洗脫液為75%乙醇，洗脫液pH為5，流速為1.50 mL·min-1，洗脫液用量為10 mL·g-1樹脂，測得苦蕎葉黃酮的回收率為77.01%，黃酮純度為90.6%，是純化前的3.02倍。[結論] 苦蕎葉中總黃酮的含量高，且易純化；該提取、純化工藝可滿足工業(yè)化生產高效益、低成本、簡單易操作的需求，為其工業(yè)化生產提供理論依據(jù)。

苦蕎葉；黃酮化合物； 超聲波； 大孔樹脂； 提取純化工藝

苦蕎(Fagopyrumtataricum(L.) Gaertn)為蓼科雙子葉藥食兼用植物，營養(yǎng)豐富，含有大量的黃酮類化合物(Flavonoids)[1]。黃酮類化合物具有很好的藥理及保健作用[2～6]，在化妝品領域也具有非常大的應用前景[7]。盛花期的苦蕎葉子中黃酮含量極高[8，9]，若能從中提取黃酮類化合物，不僅可以開發(fā)生物黃酮新資源，開發(fā)相關功能性食品、藥品和化妝品，而且可以延伸苦蕎產業(yè)鏈，大大提高苦蕎產業(yè)經(jīng)濟效益。

植物黃酮的提取方法包括回流提取法、超聲提取、微波提取和超臨界流體萃取法等[6,10,11]。綜合考慮，利用超聲波處理，可加快黃酮物質進入溶劑，大大縮短提取時間，減少溶劑用量，并且可以大幅降低提取溫度，避免高溫對黃酮的破壞?？傸S酮粗提物的純化方法有酸堿法、吸附法、色譜法等[6,10]。較其他純化法，樹脂吸附具有生產容量較大、生產周期短、成本低廉、精制效果突出等優(yōu)點，有較高的工業(yè)生產應用價值[8]。已有文獻報道采用超聲波法從五爪金龍葉[12]、菊芋葉[13]、黑果懸鉤子莖、葉[14]等中提取黃酮類物質，采用樹脂吸附法對蛹蟲草[15]、櫻桃葉[16]等植物粗黃酮進行精制，但有關超聲波法提取苦蕎葉總黃酮和樹脂吸附法純化苦蕎葉粗黃酮的研究報道很少。本試驗對苦蕎葉總黃酮的超聲輔助提取工藝及大孔樹脂純化工藝進行了研究，旨在為苦蕎葉總黃酮的工業(yè)化生產提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

苦蕎葉，采自于山西農業(yè)大學，盛花期采摘， 50 ℃下鼓風干燥，粉碎過100目篩，用石油醚脫脂，干燥，裝袋密封，低溫避光保存。

1.2 試劑

標準品蘆?。荷虾＿~坤化工有限公司；大孔吸附樹脂(D-101，AB-8，S-8，HPD600，DA-201)均購自天津歐瑞生物科技有限公司；硝酸鋁、鹽酸、亞硝酸鈉、無水乙醇、氫氧化鈉、石油醚等均為國產分析純。

1.3 儀器與設備

101-3-BS-Ⅱ電熱恒溫鼓風干燥箱：上海躍進醫(yī)療機械廠；高速萬能粉碎機：溫嶺市林大機械有限公司；723可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司； KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；JDG-0.2真空凍干試驗機：蘭州科近真空凍干技術有限公司；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水式真空泵：上海亞榮生化儀器；RE-5203旋轉蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；SHZ-B水浴恒溫振蕩器：上海躍進醫(yī)療機械廠；HL-1數(shù)顯恒流泵：上海瀘西生化儀器廠有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 黃酮標準曲線的繪制

參照文獻[12]繪制標準曲線(圖1)。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 Standard curve of rutin

1.4.2 總黃酮得率的測定

準確稱取樣品2 g進行提取，獲得的提取液經(jīng)減壓抽濾后用60%乙醇定容，510 nm處測定吸光度，計算總黃酮得率。

式中，C為樣液中黃酮的濃度/g·L-1；V為提取液稀釋定容體積/mL；N為提取液測定稀釋倍數(shù)；W為苦蕎葉粉末的質量/g。

1.4.3 總黃酮的提取

1.4.3.1 超聲波輔助提取苦蕎葉總黃酮的單因素試驗

在王麗娟[11]研究的基礎上，考察提取劑濃度、提取溫度、料液比、超聲波輔助提取時間、超聲波功率對苦蕎葉總黃酮得率的影響。

1.4.3.2 Box-Behnken試驗設計

在單因素試驗的基礎上，使用Design Expert 8.0.5.0設計四因素三水平的Box-Behnken響應面試驗，選取提取溫度、時間、料液比、超聲波功率為自變量，以總黃酮得率為響應值，對苦蕎葉總黃酮的提取工藝進行優(yōu)化。試驗因素及水平設計見表1。

1.4.4 黃酮的純化

1.4.4.1 苦蕎葉粗黃酮的制備

苦蕎葉粉末→最佳工藝下提取→減壓抽濾→蒸發(fā)濃縮→真空凍干→裝袋密封，低溫避光保存。

表1 Box-Behnken試驗因素水平表

1.4.4.2 樹脂的篩選

分別稱取AB-8、S-8、D-101、HPD-600、DA-201大孔樹脂2 g，參照文獻[15]確定不同型號樹脂的吸附率、解吸率及黃酮回收率。

回收率/%=吸附率×解吸率×100

1.4.4.3 苦蕎葉黃酮純化工藝的優(yōu)化

考察上樣液pH、上樣液濃度、上樣流速、吸附容量、洗脫液pH、洗脫液濃度、洗脫液流速、 洗脫液用量對苦蕎葉總黃酮純化效果的影響，并確定最佳工藝條件。

2 結果與分析

2.1 苦蕎葉總黃酮提取結果分析

2.1.1 單因素試驗結果分析

從圖2可以看出，乙醇濃度為60%時，黃酮提取得率最大，這與物質極性有關。 當溫度超過70 ℃后，黃酮得率開始降低，這是因為溫度過高其中的活性成分易受到破壞[8]，雜質的溶出量增加。料液比大于1∶30后，黃酮得率不再提高，從提取效益方面考慮，料液比以1∶30為最佳。超聲波處理時間為30 min時，黃酮提取得率達到最大，功率為100 W時最大，故選100 W為最佳。

圖2 乙醇濃度、溫度、料液比、時間和超聲波功率對總黃酮得率的影響Fig.2 The influence of ethanol concentration, temperature, solid-liquid ratio,time and Ultrasonic power on flavonoids yield

2.1.2 Box-Behnken試驗結果分析

2.1.2.1 回歸模型的建立與檢驗

對表2實驗數(shù)據(jù)用多元回歸擬合，得到總黃酮得率(Y)與提取溫度(A)、提取時間(B)、料液比(C)和超聲波功率(D)的回歸方程為：

Y=10.147+0.469A+0.1392B+0.2398C+0.0468D-0.313AB-0.052AC+0.137AD+0.0528BC+0.0983BD-0.0353CD-0.673A2-0.2507B2-0.4642C2-0.3702D2

由表3可知該模型達到極顯著水平(P<0.000 1)，失擬項不顯著(P>0.05)，決定系數(shù)R2為0.995 6，校正決定系數(shù)R2Adj為0.9913，信噪比(Adeq Precision)為52.512>4，表明方程的擬合度和可信度極高，CV=0.53%，表明本試驗有較高的可靠性及精密度。因此，可用該模型來分析和預測苦蕎葉黃酮的提取工藝。且由F檢驗可以得出四因素對黃酮得率的影響為：提取溫度(A)>料液比(C)>提取時間(B)>超聲波功率(D)。

表2 試驗設計與結果

2.1.2.2 兩因素間的交互效應的分析

由回歸模型的方差分析可知，AB、AD和BD之間存在著極顯著的交互作用(P<0.01)，其他因素之間的兩兩交互效應不顯著(P>0.05)， 因此只分析AB、AD和BD的交互作用對苦蕎葉黃酮得率的影響，其響應面圖見圖3～5。AB、AD間交互作用的響應面圖曲面較陡，影響較大，BD的曲面較為平緩，影響小于前兩者。從圖3～5中可以看出，響應值Y(苦蕎葉總黃酮得率)均隨因素變化先增高后降低，在試驗水平范圍內出現(xiàn)了一個最高點，即為苦蕎葉黃酮得率較高點。

圖3 Y=f(A，B)響應面圖Fig.3 Responsive surfaces of Y=f(A，B)

圖4 Y=f(A，D)響應面圖Fig.4 Responsive surfaces of Y=f(A，D)

圖5 Y=f(B，D)響應面圖Fig.5 Responsive surfaces of Y=f(B，D)

變異來源Sourcesofvariation平方和Sumofsquares自由度DF均方和MeansquareFvaluePvalue顯著性Significant模型8.08140.58228.59<0.0001顯著A2.6412.641045.07<0.0001B0.2310.2392.02<0.0001C0.6910.69273.29<0.0001D0.02610.02610.420.0061AB0.3910.39155.16<0.0001AC0.01110.0114.280.0575AD0.07510.07529.72<0.0001BC0.01110.0114.410.0544BD0.03910.03915.290.0016CD4.970E-00314.970E-0031.970.1825A22.9412.941163.06<0.0001B20.4110.41161.42<0.0001C21.4011.40553.42<0.0001D20.8910.89351.98<0.0001殘差0.035142.526E-003失擬項0.030103.027E-0032.380.2097不顯著純誤差5.094E-00341.274E-003總變異8.1228

注：p>0.05，差異不顯著；p<0.05，差異顯著；p<0.01，差異極顯著

Note:p>0.05,the difference was not significant;p<0.05,the difference was significant;p<0.01,the difference was extremely significant

2.1.2.3 最佳工藝參數(shù)的確定及驗證

由軟件分析結果可知，苦蕎葉黃酮的最佳工藝參數(shù)為：乙醇濃度60%，提取溫度71.6 ℃,料液比1∶31.51 g·mL-1，超聲波輔助時間30.65 min，超聲波功率101.3 W，此工藝參數(shù)下預測黃酮得率為10.263 6%。在此條件下確定乙醇濃度60%，提取溫度72 ℃,，料液比1∶32 g·mL-1，超聲波輔助時間31 min，超聲波功率101 W進行驗證試驗，重復三次得平均值為10.252 3%，RSD=0.11%，表明該模型對苦蕎葉總黃酮的提取工藝具有實際應用價值。

2.2 苦蕎葉中總黃酮純化結果分析

2.2.1 樹脂的篩選

從表4可以看出，純化后黃酮回收率AB-8最大，因此選AB-8 樹脂對苦蕎葉黃酮進行純化。

表4 不同樹脂對黃酮的純化效果對比

Table 4 Comparison on purification of total flavones by different kinds of resins

樹脂型號Resintype吸附率/%Adsorptionrate解吸率/%Desorptionrate回收率/%RecoveryrateHPD60083.9285.1171.42DA-20176.5485.5865.50D-10181.4091.7774.70AB-887.0488.476.94S-885.0382.4370.09

2.2.2 上樣液pH對吸附率的影響

準確稱取6份2.000 g預處理好的AB-8大孔樹脂，置于250 mL具塞三角瓶中，加入1.00 mg·mL-1的樣液50 mL，依次調節(jié)pH值為3、4、5、6、7、8，放入25 ℃、120 r·min-1的恒溫振蕩水浴鍋中，吸附6 h后測得黃酮吸附率依次為：79.14%、82.92%、85.73%、83.29%、83.1%、80.12%。在pH為5時，吸附效果最好。由此可知，苦蕎葉總黃酮在酸性較弱的環(huán)境中易被樹脂吸附，這可能與黃酮化合物分子中多有酚羥基呈酸性有關。

2.2.3 上樣液濃度對吸附率的影響

將30 g預處理好的AB-8樹脂濕法上柱，將濃度為0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 g·L-1的樣液(pH為5)，以同一流速上柱，測得吸附率依次為：84.73%、86.01%、85.96%、82.55%、78.93%、73.52%。黃酮濃度較低時，未達到吸附所需的密度，增大黃酮濃度，增加了黃酮與樹脂的接觸機會，使得吸附率上升，但當濃度超過某一值時，此時樹脂表面的黃酮分子單分子層吸附飽和，同時濃度過高易出現(xiàn)沉淀等堵塞層析柱，從而降低吸附率。黃酮吸附率在濃度為1.00 g·L-1和 1.50 g·L-1時相差極小，但后者用時較少，綜合考慮，選取1.50 g·L-1為最佳濃度。

2.2.4 上樣流速對吸附率的影響

將1.00 g·L-1的樣液100 mL(pH為4)通過恒流泵分別以0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL·min-1的流速上柱，測得吸附率依次為：86.52%、86.08%、84.72%、80.59%、76%、70.26%。流速加快導致吸附時間減短，吸附不充分。但流速過低使生產周期延長，提高生產的成本，綜合考慮，宜選上樣液流速為1.00 mL·min-1。

2.2.5 吸附容量的確定

將30 g預處理好的AB-8樹脂濕法上柱，將1.00 g·L-1樣液(pH為4)，以1.00 mL·min-1的流速上樣，每100 mL收集1 管，連續(xù)接取。

圖6 AB-8樹脂上樣吸附曲線Fig.6 Adsorption curve of AB-8 macroporous resin

由圖6 知，上樣量在600～1 000 mL時，吸附率保持在較高水平75%以上，增加上樣量至1 000 mL以上時，吸附率出現(xiàn)明顯下降，表明樹脂已接近飽和，吸附能力大大下降。為避免樣液中總黃酮大量流出而降低純化得率，同時考慮經(jīng)濟效益，選取1 000 mL 為最佳上樣量，即33 mL·g-1樹脂。

2.2.6 洗脫液pH對解吸率的影響

按最佳條件上樣吸附后，分別用pH 為3、4、5、6、7、8 的70%乙醇洗脫，測得解吸率依次為：84.35%、86.65%、87.97%、86.43%、83.24%、79.33%。可以看出吸附率在pH為5時達到最大。這與黃酮化合物的弱酸性有關。

2.2.7 洗脫液濃度對解吸率的影響

按最佳條件上樣吸附后，分別用pH 為5的60%、65%、70%、75%、80%、85%的乙醇洗脫，測得解吸率依次為：83.64%、86.03%、87.92%、89.74%、89.28%、87.33%。乙醇濃度為75%和80%時黃酮的解吸率較大，兩者相差極小，前者乙醇用量較少，可降低生產成本，綜合考慮，選75%的乙醇更為合適。

2.2.8 洗脫液流速對解吸率的影響

按最佳條件上樣吸附后，用pH 為5的75%的乙醇分別以0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL·min-1的流速洗脫，測得解吸率依次為：90.03%、89.83%、89.5%、86.85%、83.33%、78.59%。這是因為速度慢時黃酮能從樹脂上被充分的洗脫，當速度加快時有一部分黃酮來不及被洗脫下來。洗脫速率為0.50、1.00、1.50 mL·min-1時三者的解吸率差異極小，洗脫速率為1.5 mL·min-1可大大縮短洗脫時間，節(jié)約成本。

2.2.9 洗脫液用量的確定

按最佳條件上樣吸附后，用pH 為5的75%乙醇以1.50 mL·min-1的流速洗脫，每20 mL收集1 管，連續(xù)接取。

由圖7知，乙醇用量達到80 mL時，苦蕎葉黃酮開始被大量洗脫下來，在 140 mL時洗脫量達到最大，乙醇用量達到300 mL 時，樹脂中總黃酮已基本洗脫完全。若繼續(xù)則會使雜質也洗脫出來，影響黃酮純度，且提高成本，因此，選取300 mL 為最佳洗脫液用量，即10 mL·g-1樹脂。

圖7 AB-8樹脂洗脫曲線Fig.7 Elution curve of AB-8 macroporous resin

2.2.10 AB-8最佳工藝的驗證

按以上所得最佳工藝條件進行吸附，解吸，濃縮凍干，測得苦蕎葉黃酮的純度為90.6%，是純化前的3.02倍，黃酮回收率為77.01%。

3 結論與討論

超聲法提取苦蕎葉中總黃酮的最佳提取工藝為：以60%的乙醇為提取劑，提取溫度為72 ℃，料液比為1∶32 g·mL-1，超聲波處理時間為31 min，超聲波功率為101 W，此工藝用時短、效率高、方法簡便、易于操作、可大量提取，且乙醇作為提取劑可

回收再利用，成本較低，可滿足工業(yè)化生產需求，該條件下苦蕎葉總黃酮得率高達10.2523%。

AB-8大孔吸附樹脂對苦蕎葉黃酮有較好的純化效果，其最佳純化工藝為：上樣液pH為5，濃度為1.50 g·L-1，流速為1.00 mL·min-1，上樣量為33 mL·g-1樹脂，洗脫液為75%乙醇，洗脫液pH為5，流速為1.50 mL·min-1，洗脫液用量為10 mL·g-1樹脂，測得苦蕎葉黃酮的回收率為77.01%，黃酮純度為90.6%，是純化前的3.02倍。AB-8大孔樹脂用于苦蕎葉黃酮的純化，除去了大量的多糖、蛋白質、色素等物質，僅吸附-洗脫一步工藝即可得到純度高達90.6%的苦蕎葉總黃酮，且收效高、成本低、操作簡便、洗脫液可再生，適于工業(yè)化規(guī)模生產，為工業(yè)純化苦蕎葉黃酮提供理論依據(jù)。

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(編輯：馬榮博)

Study on the extraction and purification of total flavonoids from leaves ofFagopyrumtataricum(L.) Gaertn

Han Xuemei, Xu Xiaoqun*, Wang Yuan, Miao Lingxiang, Zhao Wenting

(CollegeofFoodScienceandEngineering，ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China)

[Objective]In order to develop and useFagopyrumtataricum(L.)Gaertnwisely, improve its economic value, explore the industrialization technology for extraction and purification of total flavones from leaves ofFagopyrumtataricum(L.) Gaertn,.[Methods]The full flowering leaves which contained the hightest flavonoids as the materials, use the Ultrasonic technology to extract flavonoids and Macroporous resin adsorption method to purify.[Results]The optimum extraction conditions were: using 60% ethanol solution as extract, temperature was 72 ℃, liquid to solid ratio of 1∶32 g·mL-1, extraction time was 31 min, ultrasonic power was 101W,the extraction yield was 10.2523%. the AB-8 resin in the purification of flavonoids had good effect. The optimum purification conditions were: sample pH was 5, sample concentration was 1.50 g·L-1, flow rate of sample was 1.00 mL·min-1, sample volume was 33 mL·g-1resin, eluted by75% ethanol, eluent pH was 5, flow rate of elution was 1.50 mL·min-1, eluent volume was 10 mL·g-1resin. The recovery rate of flavonoids is 77.01%.The purity of flavonoids in the purified product was 90.6%.It was 3.02 times of the raw material.[Conclusion]The leaves has high content of flavonoids which was easy to be puritied. The technology can meet the requirements of high benefit, low cost and easy-to-handle in industrialized production, It can provide theoretical basis for its industrialized production.

Leaves ofFagopyrumtataricum(L.)Gaertn， Flavonoids， Ultrasonic technology， Macroporous resin， Extraction and purification

2016-07-11

2016-10-19

韓雪梅(1990-)，女(漢)，山西呂梁人，碩士研究生，研究方向：糧油食品科學

*通信作者：許效群，副教授，碩士生導師。Tel:0354-6288325；E-mail：13935447190 @163.com

TS210.9

A

1671-8151(2017)02-0134-07