白念珠菌HSP90的研究進(jìn)展

孟靖順 趙靜 薛偉 吳建華

(1.上海長海醫(yī)院，上海 200433；2.中國科學(xué)院大學(xué)，上海 200031)

·綜述·

白念珠菌HSP90的研究進(jìn)展

孟靖順1趙靜1薛偉2吳建華1

(1.上海長海醫(yī)院，上海 200433；2.中國科學(xué)院大學(xué)，上海 200031)

調(diào)查表明白念珠菌已成為全球第4大致病菌并且有逐年上升的趨勢，較多機(jī)構(gòu)已開展白念珠菌致病機(jī)制的研究。相關(guān)研究表明白念珠菌的熱休克蛋白90 (HSP90)能促進(jìn)白念珠菌的形態(tài)變化以及耐藥形成。本文從蛋白結(jié)構(gòu)、客戶蛋白、輔助因子等方面總結(jié)了白念珠菌HSP90在調(diào)控白念株菌形態(tài)變化以及耐藥性形成方面的研究進(jìn)展。

白念珠菌；HSP90；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)；客戶蛋白；耐藥性

早期的研究發(fā)現(xiàn)，人體內(nèi)的HSP90抑制劑格爾德霉素可以大大提高白念珠菌對抗真菌藥的敏感性，近年來的研究也表明HSP90在真菌的矛盾生長、臨床耐藥以及致病侵襲力方面均具有重要作用[1]。本文中，筆者著重闡述有關(guān)HSP90的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、重要氨基酸位點(diǎn)、調(diào)控HSP90的部分基因序列、HSP90的關(guān)鍵輔助因子、HSP90客戶蛋白的分類以及作用。

1 HSP90蛋白結(jié)構(gòu)的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)

HSP90蛋白的結(jié)構(gòu)變化對HSP90的功能有重要的作用。HSP90蛋白結(jié)構(gòu)主要分為N端、Linker region (CL)、M區(qū)域以及C端。N端呈口袋狀，其具有由α螺旋和β折疊形成的三明治結(jié)構(gòu)的ATP的結(jié)合靶位可與ATP結(jié)合[2-3]。研究表明，N端關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的突變能影響HSP90與ATP的結(jié)合速率 (ATPase cycle)，從而導(dǎo)致HSP90與客戶蛋白 (client protein)結(jié)合強(qiáng)度下降，包括部分耐藥客戶蛋白[4]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在人源HSP90的N端存在部分關(guān)鍵輔助因子與HSP90的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，如耐藥輔助因子sgt1與HSP90結(jié)合的靶位——CS1結(jié)構(gòu)域，其若遭到破壞會影響HSP90與sgt1的結(jié)合，從而導(dǎo)致HSP90失去激活部分耐藥因子的功能[5]。CL則主要是連接N端與中間區(qū)域 (M domain)的部分，其在不同pH值下可改變HSP90自身的結(jié)構(gòu)靈活性，進(jìn)而影響HSP90部分輔助功能，例如HSP90與客戶蛋白的結(jié)合[6-7]。CL部分氨基酸位點(diǎn)的突變能一定程度阻斷HSP90與CPR7的結(jié)合，例如在白念珠菌模式生物釀酒酵母菌中，HSP90的CL部分突變會提高釀酒酵母對唑類藥物的敏感性，但是CPR7參與的相關(guān)耐藥機(jī)制與 CL區(qū)域之間的關(guān)系仍然有待深入研究；M區(qū)域在HSP90的結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮著重要作用，在人體HSP90中，M區(qū)域的α螺旋是HSP90與客戶蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；M164A關(guān)鍵位點(diǎn)的突變可以導(dǎo)致HSP90與蛋白CDC37 的結(jié)合強(qiáng)度下降[8]；C端則對于白念珠菌HSP90二聚體的形成有至關(guān)重要的作用，其不僅包含了大量關(guān)鍵輔助因子靶位，還可能存在與ATP結(jié)合的區(qū)域。CPR7就是通過HSP90的C端末尾MEEVD區(qū)域與HSP90結(jié)合的。C端關(guān)鍵位點(diǎn)的突變可以引起HSP90的二聚體結(jié)構(gòu)向單聚體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。有研究人員通過熱力實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與白念珠菌同源性較高的人體HSP90 中，I692、Y689、L696等C端位點(diǎn)的突變會引起C端熔點(diǎn)下降，從而導(dǎo)致HSP90二聚體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性下降[9]。在人體中，HSP90的C端抑制劑已普遍運(yùn)用在腫瘤治療方面，例如使用抑制劑順鉑治療腫瘤[10]，這也提示HSP90蛋白C端的部分抑制可能在跟白念珠菌耐藥性有關(guān)系。

2 HSP90中化學(xué)修飾的作用

真菌HSP90的主要化學(xué)修飾 (chemical modification)包括乙酰化 (acetylation)、磷酸化 (phosphorylation)和亞硝酸化。乙?；饕l(fā)生在真菌HSP90的組蛋白和賴氨酸上。HSP90核心組蛋白的去乙?；軌蛴绊慔SP90的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[11]。賴氨酸去乙?；笸ㄟ^改變HSP90與ATP的結(jié)合速率，抑制了HSP90與部分客戶蛋白和輔助因子的結(jié)合。真菌HSP90中部分氨基酸位點(diǎn)的去乙?；饔脤Ω淖冋婢哪退幮杂兄匾饔?，例如釀酒酵母菌HSP90中K27的乙酰化突變能夠提高HSP90對于格爾德霉素的敏感性，煙曲霉HSP90中K27的去乙酰化能提高煙曲霉對于唑類藥物的敏感性。

HSP90的磷酸化和亞硝酸研究仍較局限，目前報道HSP90的磷酸化研究僅限于釀酒酵母和人體中。在釀酒酵母HSP90中S49，S288，T687磷酸化能夠抑制HSP90對客戶蛋白的折疊加工，YL24去磷酸化對HSP90 N端二聚體的形成和ATP速率的改變有重要作用；在人體中，C597的亞硝酸化能夠降低HSP90與ATP的結(jié)合速率。

3 重要基因序列與HSP90的相互作用

基因片段的研究有利于幫助我們更直觀地發(fā)現(xiàn)白念珠菌HSP90的調(diào)控功能及耐藥機(jī)制。近年的研究發(fā)現(xiàn)，與白念珠菌HSP90存在相互作用的基因片段主要有兩個部分。

一部分基因片段為獨(dú)立的片段。通過基因芯片篩選發(fā)現(xiàn)白念珠菌基因庫中有226個獨(dú)立的基因片段與HSP90存在著受不同因素的調(diào)控、影響的相互作用[12]。例如，在高溫高壓下FCP3和HOF可使HSP90的表達(dá)上調(diào)，在耐藥試驗(yàn)中HSP90能使AHR和FCR3的轉(zhuǎn)錄因子大量表達(dá)。其相互的作用機(jī)制主要有兩個：①HSP90通過搬運(yùn)部分基因序列附近的核小體或直接搬運(yùn)基因片段的轉(zhuǎn)錄因子來提高它們的表達(dá)水平。②部分基因片段通過增減HSF1調(diào)控HSP90的表達(dá)水平，或是改變CK2磷酸酶對HSP90的化學(xué)修飾的強(qiáng)弱來影響HSP90與部分關(guān)鍵客戶蛋白的結(jié)合[13]。

另一部分基因片段為HSP90內(nèi)部序列。白念珠菌HSP90啟動子的部分切除或置換能夠影響HSP90的表達(dá)和功能。其切除部位和長度的不同對HSP90的功能和表達(dá)水平的有著不同的影響作用，近100bp的切除可使HSP90表達(dá)量下降，減弱其輔助功能，使得1,3-β-D-葡聚糖和蛋白磷酸酶的水平降低，減輕白念珠菌矛盾性生長和耐藥現(xiàn)象[14]。中間50bp的置換對于HSP90的抑制作用最大，最新研究表明，啟動子的中間50bp的置換使HSP90的表達(dá)大大降低，進(jìn)而抑制了真菌耐藥性的形成，總之基因序列的研究是發(fā)現(xiàn)HSP90引起耐藥方面新途徑的一重要的方法。

4 白念珠菌中HSP90的客戶蛋白分類

HSP90在真菌中主要通過客戶蛋白 (client protein)起作用，研究表明菌中有20%的蛋白組 (proteome)是HSP90的客戶蛋白，在耐藥形成過程中這些客戶蛋白目前主要分為4大類。①耐藥因子：HSP90的耐藥客戶蛋白主要有直接參與耐藥通路的蛋白磷酸酶和Mkc1。HSP90能夠激活蛋白磷酸酶的亞基CNA1、CNA2[15]在耐藥通路中起作用；白念珠菌中，HSP90直接與Mkc1 (見圖1)結(jié)合并通過轉(zhuǎn)運(yùn)以及折疊使Mkc1與swi6相互作用，swi6能夠促使真菌耐藥的形成以及菌絲的生長。研究發(fā)現(xiàn)，蛋白磷酸酶的耐藥通路和Mkc1的耐藥通路間可能存在相互作用和互補(bǔ)，一條通路的抑制能夠增強(qiáng)另外一條通路的活性，研究還表明存在一種未知蛋白連接這兩條通路，未知蛋白的缺失會導(dǎo)致兩條通路的阻斷[16]。②轉(zhuǎn)錄因子：HSF1既是HSP90的客戶蛋白也是HSP90的轉(zhuǎn)錄因子[17]，在高溫環(huán)境下HSF1失去與HSP90的結(jié)合能力會使HSP90的大量轉(zhuǎn)錄而導(dǎo)致真菌形成耐藥，其他轉(zhuǎn)錄因子則通過HSP90的轉(zhuǎn)運(yùn)使真菌更具有活力，如TAC1參與真菌的藥物反應(yīng)，CAP1主要參與的氧化應(yīng)激，APA2參與的細(xì)胞壁的構(gòu)建。③HSP90的調(diào)控蛋白：CK2作為HSP90的客戶蛋白是一種蛋白磷酸酶[18]，它能通過幾個亞基調(diào)控HSP90的功能和表達(dá)轉(zhuǎn)錄水平。如催化亞基Cka1和Cka2起到調(diào)控HSP90轉(zhuǎn)錄表達(dá)的作用，調(diào)節(jié)亞基CKb1和Ckb2能使HSP90發(fā)生磷酸化改變。④RNA：HSP90在人體中對于microRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)折疊加工有重要作用，對于piRNA的募集也有重要作用，研究發(fā)現(xiàn)HSP90的缺失會引起microRNA和piRNA轉(zhuǎn)錄水平的下降，但具體機(jī)制仍需研究。

圖1 白念珠菌HSP90通過Mkc1耐藥機(jī)制模式圖

Fig.1 HSP90 ofCandidaalbicananticipate the resistance mechanism by Mkc1

5 影響客戶蛋白與HSP90相互結(jié)合的因素

目前來說客戶蛋白與HSP90相互作用機(jī)制仍未明了。近年研究表明，主要有4個因素影響了HSP90與客戶蛋白的結(jié)合。①結(jié)構(gòu)的完整性：HSP90 M區(qū)域是HSP90與客戶蛋白結(jié)合的主要區(qū)域，M區(qū)域的α螺旋結(jié)構(gòu)的完整性直接影響HSP90與客戶蛋白的結(jié)合，C端部分序列的突變可以影響蛋白二聚體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，而二聚體結(jié)構(gòu)的缺失導(dǎo)致HSP90失去與客戶蛋白的結(jié)合能力。②輔助因子：白念珠菌中輔助因子sgt1能夠使HSP90與客戶蛋白特異性結(jié)合，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)敲除sgt1后HSP90不能與菌絲生長因子cry1結(jié)合[19]。③環(huán)境因素：在不同環(huán)境中HSP90會與不同的客戶蛋白結(jié)合，在熱激環(huán)境下HSP90與Mkc1蛋白結(jié)合[20]，在NaCl高鹽的環(huán)境下HSP90主要主要與HOG1結(jié)合，其內(nèi)在選擇機(jī)制仍有待研究。④ATP：ATP與HSP90的N端結(jié)合，為HSP90與客戶蛋白的結(jié)合提供能量，ATP的代謝對HSP90有重要的作用，若其停止會導(dǎo)致HSP90不能與客戶蛋白結(jié)合，但ATP代謝速率的過慢對于HSP90與客戶蛋白是否起到抑制作用仍需研究。

6 HSP90與輔助因子的相互作用

真菌HSP90的輔助因子主要分為兩種作用。一是能夠影響HSP90與ATP的結(jié)合速率。例如，結(jié)合在HSP90 N端的Sba1能夠加快HSP90和ATP的結(jié)合速率[21]，其內(nèi)在機(jī)制可能與結(jié)合的氨基酸位點(diǎn)的作用有關(guān)；CDC37能抑制人源HSP90中ATP口袋的水解環(huán)的形成阻止水解口袋的關(guān)閉影響ATPpase的進(jìn)程[22]，二是影響HSP90與客戶蛋白的結(jié)合，MTaipale團(tuán)隊通過Quantitative Analysis實(shí)驗(yàn)和LUMIER測定證實(shí)了CDC37是HSP90與客戶蛋白結(jié)合的中間橋梁，最后研究還發(fā)現(xiàn)sgt1是幫助HSP90參與耐藥的重要因子，sgt1主要結(jié)合在HSP90的N端后通過增加蛋白磷酸酶亞基Cna1活性來增強(qiáng)耐藥，實(shí)驗(yàn)已證明sgt1的敲除能夠增強(qiáng)真菌對于唑類藥物的敏感性減緩菌絲的生長?？傊谡婢杏懈嗟妮o助因子通過HSP90對白念珠菌的生長耐藥等各方面起到重要作用，我們需要不斷的了解和發(fā)現(xiàn)這些關(guān)鍵的輔助因子。

7 小 結(jié)

我們對于真菌HSP90的研究工作已日益完善，但是仍有一部分HSP90引起的致病機(jī)制尚未清楚。白念珠菌HSP90蛋白水平的化學(xué)修飾對HSP90與其耐藥輔助因子結(jié)合的影響仍未明了。輔助因子在調(diào)控HSP90方面有重要作用，發(fā)現(xiàn)和研究更多有關(guān)耐藥的HSP90輔助因子具有重要意義。客戶蛋白是白念珠菌HSP90在體內(nèi)發(fā)揮作用的重要部分，目前我們對于引起耐藥的客戶蛋白與HSP90的結(jié)合機(jī)制不是很明確。在結(jié)構(gòu)方面HSP90 C端二聚位點(diǎn)的研究仍較局限，C端的深入研究對于了解HSP90結(jié)構(gòu)變化與功能之間的聯(lián)系有重要作用。

[1] Cowen LE.The fungal Achilles' heel:targeting Hsp90 to cripple fungal pathogens[J].Curr Opin Microbiol,2013,16(4):377-384.

[2] Taipale M,jarosz DF,Lindquist S.HSP90 at the hub of protein homeostasis:emerging mechanistic insights[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2010,11(7):515-528.

[3] Blacklock K，Verkhivker GM.Computational modeling of allosteric regulation in the hsp90 chaperones:a statistical ensemble analysis of protein structure networks and allosteric communications[J].PLoS Comput Biol,2014，10(6):e1003679.

[4] Leach MD,Klipp E,Cowen LE,et al.Fungal Hsp90:a biological transistor that tunes cellular outputs to thermal inputs[J].Nat Rev Microbiol,2012,10(10):693-704.

[5] Blacklock K，Verkhivker GM.Allosteric regulation of the Hsp90 dynamics and stability by client recruiter cochaperones:protein structure network modeling[J].PLoS One,2014,9(1):e86547.

[6] Jahn M,Rehn A,Pelz B,et al.The charged linker of the molecular chaperone Hsp90 modulates domain contacts and biological function[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2014,111(50):17881-17886.

[7] Zuehlke AD,Johnson JL.Chaperoning the chaperone:a role for the co-chaperone Cpr7 in modulating Hsp90 function inSaccharomycescerevisiae[J].Genetics,2012,191(3):805-814.

[8] Synoradzki K,Bieganowski P.Middle domain of human Hsp90 isoforms differentially binds Aha1 in human cells and alters Hsp90 activity in yeast[J].Biochim Biophys Acta,2015,1853(2):445-452.

[9] Ciqlia E,Verqin J,Reimann S,et al.Resolving hot spots in the C-terminal dimerization domain that determine the stability of the molecular chaperone Hsp90[J].PLoS One,2014,9(4):e96031.

[10] Zhao H,Garq G,Zhao J,et al.Design,synthesis and biological evaluation of biphenylamide derivatives as Hsp90 C-terminal inhibitors[J].Eur J Med Chem,2015,89:442-466.

[11] Veri A,Cowen LE.Progress and prospects for targeting Hsp90 to treat fungal infections[J].Parasitology,2014,141(9):1127-1137.

[12] Diezmann S,Leach MD,Cowen LE.Functional divergence of Hsp90 genetic interactions in biofilm and planktonic cellular states[J].PLoS One,2015,10(9):e0137947.

[13] Khurana N,Bhattacharyya S.Hsp90,the concertmaster:tuning transcription[J].Front Oncol,2015,5:100.

[14] Lamoth F,Juvvadi PR,Gehrke C,et al.Transcriptional activation of heat shock protein 90 mediated via a proximal promoter region as trigger of caspofungin resistance inAspergillusfumigatus[J].J Infect Dis,2014,209(3):473-481.

[15] Singh SD,Robbins N,Zaas AK,et al.Hsp90 governs echinocandin resistance in the pathogenic yeastCandidaalbicansvia calcineurin[J].PLoS Pathog,2009,5(7):e1000532.

[16] LaFayette SL,Colins C,Zaas AK,et al.PKC signaling regulates drug resistance of the fungal pathogenCandidaalbicansvia circuitry comprised of Mkc1,calcineurin,and Hsp90[J].PLoS Pathog,2010,6(8):e1001069.

[17] Leach MD,Budge S,Walker L,et al.Hsp90 orchestrates transcriptional regulation by Hsf1 and cell wall remodelling by MAPK signalling during thermal adaptation in a pathogenic yeast[J].PLoS Pathog,2012,8(12):pe1003069.

[18] Zhao R,Davey M,Kaplanek P,et al.Navigating the chaperone network:an integrative map of physical and genetic interactions mediated by the hsp90 chaperone[J]Cell,2005.120(5):715-727.

[19] Shapiro RS,Zaas AK,Betancourt-Qurioz M,et al.The Hsp90 co-chaperone Sgt1 governsCandidaalbicansmorphogenesis and drug resistance[J].PLoS One,2012,7(9):e44734.

[20] Robbins N,Uppuluri P,Nett J,et al.Hsp90 governs dispersion and drug resistance of fungal biofilms[J].PLoS Pathog,2011.7(9):e1002257.

[21] Graf C,Lee CT,Eva Meier-Andrejszki L,et al.Differences in conformational dynamics within the Hsp90 chaperone family reveal mechanistic insights[J].Front Mol Biosci,2014,1:4.

[22] Smith JR,et al.Restricting direct interaction of CDC37 with HSP90 does not compromise chaperoning of client proteins[J].Oncogene,2013,34(1):15-26.

[本文編輯] 施 慧

973子課題 (2013CB531602)

孟靖順，男 (漢族)，碩士研究生在讀.E-mail:1781069890@qq.com

吳建華,E-mail:wujh_ch@163.com

R 379.4

B

1673-3827(2017)12-0058-04

2016-06-22