白念珠菌Ras/cAMP/PKA通路的研究進(jìn)展

魯仁義 馬錢瑤 張曉龍 曹永兵 王彥 閻瀾 姜遠(yuǎn)英

(1.中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院新藥研究中心，上海 200433；2.沈陽藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，沈陽 110016)

·綜述·

白念珠菌Ras/cAMP/PKA通路的研究進(jìn)展

魯仁義1馬錢瑤2張曉龍1曹永兵1王彥1閻瀾1姜遠(yuǎn)英1

(1.中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院新藥研究中心，上海 200433；2.沈陽藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，沈陽 110016)

白念珠菌是一種重要的條件致病真菌，Ras/cAMP/PKA信號通路在白念珠菌的多種生理過程中發(fā)揮作用，如形態(tài)轉(zhuǎn)換、黏附、生物被膜形成等，對于維持白念珠菌的毒力以及侵襲能力是十分重要的。對這一信號通路的深入研究有助于更好地了解白念珠菌對人體致病的機制，給抗真菌新藥的研發(fā)提供新的思路。該文重點闡述通路相關(guān)蛋白功能、上下游調(diào)控關(guān)系及機制。

白念珠菌；Ras/cAMP/PKA信號通路；形態(tài)轉(zhuǎn)換

由于器官移植術(shù)后免疫抑制劑的使用，腫瘤放療化療患者的增加，介入治療和駐ICU患者的增加，艾滋病的流行和廣譜抗生素的大量使用等原因，侵襲性真菌感染發(fā)病率呈明顯上升趨勢[1]。

白念珠菌是最常見的機會致病真菌，主要侵襲和感染機體口腔黏膜、消化道、陰道等部位，在免疫力低下人群中易引發(fā)系統(tǒng)性念珠菌感染，累及多個臟器[2]。白念珠菌有酵母態(tài)及菌絲態(tài)兩種形態(tài)，形態(tài)轉(zhuǎn)換對于白念珠菌的致病力是至關(guān)重要的，在機體內(nèi)，菌絲態(tài)的白念珠菌具有更強侵襲性。

菌絲形成、形態(tài)轉(zhuǎn)換、生物被膜形成、甾醇合成、糖酵解等一系列生物和代謝過程對白念珠菌的生長繁殖及致病力都是十分重要的[3-4]，這些過程由多條信號通路參與調(diào)控，其中Ras/cAMP/PKA通路至關(guān)重要[5]，有望從中發(fā)現(xiàn)抗真菌藥物新的重要靶點 (見圖1)。本文綜述了白念珠菌Ras/cAMP/PKA信號通路中各相關(guān)分子的上下游關(guān)系及分子調(diào)控機制，重點闡述通路中關(guān)鍵基因及蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能及表達(dá)調(diào)控機制。

1 Ras、Ira2和Cdc25

Ras是高度保守GTP酶家族中的成員，在許多重要的細(xì)胞生長和分化信號通路中起著重要的“分子開關(guān)”的作用。

圖1 白念珠菌中Ras/cAMP/PKA通路示意圖(黑色箭頭表示激活作用，紅色線表示抑制作用)

Fig.1 Schematic diagram of Ras/cAMP/PKA pathway inCandidaalbicans(Black arrows indicate activation and red lines indicate suppression)

Ras屬于小G蛋白家族 (與普通G蛋白由αβγ三個亞基組成異三聚體不同，以單體分子存在，并且分子量只有20～35 kD)，Ras有GTP結(jié)合的活化狀態(tài)和GDP結(jié)合的非活化狀態(tài)兩種存在形式，當(dāng)其處于活化狀態(tài)時，可使下游的效應(yīng)分子活化，兩者之間的轉(zhuǎn)換依賴于Ras本身具有的GTP酶活性[6]。

RAS1在白念珠菌的形態(tài)轉(zhuǎn)換過程中發(fā)揮著重要的作用[7]，能促進(jìn)菌絲的形成，當(dāng)RAS1基因被敲除后，白念珠菌生長減慢、呈假菌絲樣生長、菌絲形成能力減弱、胞內(nèi)cAMP水平顯著降低，將Ras1第13位的甘氨酸突變成纈氨酸后，Ras1活性顯著增強，胞內(nèi)cAMP含量升高且菌絲形成能力增強[8]。除Ras1外，白念珠菌中還存在另一個非典型的鳥苷酸結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白Ras2，Ras2與Ras1有拮抗作用，RAS2單敲除的菌株增殖速度、cAMP含量以及菌絲生長基本與野生型一致，但RAS1和RAS2雙敲除的菌株中，cAMP的含量是親本菌的30%，但比RAS1單敲除菌株高約6～7倍，且生長速率恢復(fù)到親本菌水平[9]。以上結(jié)果表明RAS1在白念珠菌中cAMP水平調(diào)控、菌絲生長及形態(tài)轉(zhuǎn)換發(fā)揮著重要的作用。另外，最新研究表明，在RAS1缺失菌中，由TORC1介導(dǎo)的核糖體生物合成減少，從而導(dǎo)致了菌株對兩性霉素B耐受性升高[10]。

葡萄糖和血清無法誘導(dǎo)RAS1缺失菌中cAMP生成，RAS1缺失菌形態(tài)轉(zhuǎn)換的缺陷可以通過外源性cAMP解救，這兩種表型在CDC25缺失菌中也能觀察到[11]，表明CDC25和RAS1是在cAMP-PKA通路的上游發(fā)揮作用的。Cdc25是參與Ras1-GTP/GDP轉(zhuǎn)換的鳥苷酸交換因子，能夠激活Ras1，當(dāng)CDC25被敲除后，菌株中Ras1-GTP水平降低并且不能形成菌絲[12]。而Ira2能夠激活Ras1的GTP酶活性，負(fù)性調(diào)控Ras1的活性，使Ras1-GTP分解為Ras1-GDP，IRA2缺失會導(dǎo)致Ras1/cAMP/PKA通路的持續(xù)激活，進(jìn)而增強菌絲生成[13]。此外，Seneviratne等[14]通過篩選單倍體突變文庫，揭示了IRA2還參與了生物被膜的形成，發(fā)揮著正向調(diào)控的作用。最新的研究表明[12]，白念珠菌中Ras1的活性與線粒體活性也密切相關(guān)，線粒體抑制劑能夠顯著減少Ras1與GTP的結(jié)合，并且在其他念珠菌中也能觀察到類似的效應(yīng)。線粒體氧化呼吸活性和Ras1-GTP結(jié)合之間有密切關(guān)系，缺少復(fù)合物I或復(fù)合物IV的菌株在菌絲誘導(dǎo)條件下依然呈酵母狀生長，并且具有較低水平的Ras1-GTP。

2 Cyr1、Srv2、Gpr1和Gpa2

CYR1 (又稱CDC35)在白念珠菌中負(fù)責(zé)編碼腺苷酸環(huán)化酶 (adenylate cyclase，AC)，CYR1缺失菌菌絲形成缺陷，cAMP含量下降。AC在細(xì)胞內(nèi)的的作用是催化ATP生成cAMP，在白念珠菌的凋亡、CO2感知等過程中發(fā)揮重要作用，是Ras1的下游效應(yīng)物。在Fang等[8]的研究中，酵母雙雜交實驗證明Ras1是與Cyr1的RA (Ras-association)結(jié)構(gòu)域相互作用而發(fā)揮激活A(yù)C作用的，當(dāng)Ras1與GTP結(jié)合時，可以與AC上保守的RA結(jié)構(gòu)域結(jié)合，激活A(yù)C的活性提高cAMP的水平。此外，在低pH的環(huán)境下，CYR1的表達(dá)下調(diào)，菌絲生長缺陷，說明CYR1在白念珠菌適應(yīng)不同pH環(huán)境中也發(fā)揮著作用[15]。

Srv2是一個AC相關(guān)蛋白，能夠調(diào)節(jié)AC的活性，參與調(diào)控白念珠菌的形態(tài)轉(zhuǎn)換等生理過程，SRV2在釀酒酵母中的同源基因是CAP1，SRV2缺失菌在小鼠系統(tǒng)性念珠菌感染模型中毒力喪失[16]，像通路中的其他突變體一樣，SRV2缺失菌有形態(tài)轉(zhuǎn)換缺陷，又可以通過添加cAMP或dbcAMP解救。有研究發(fā)現(xiàn)Srv2能夠通過它的N-端和C-端分別連接Cyr1和G-actin，形成一個三聚體，在菌絲生長時起著激活cAMP合成的作用[17]。

在真核細(xì)胞中，G蛋白偶聯(lián)受體能夠調(diào)控多種信號通路，當(dāng)其與配體結(jié)合后，本身構(gòu)象發(fā)生改變激活效應(yīng)蛋白，將信號傳遞至下游的效應(yīng)器分子，包括腺苷酸環(huán)化酶和磷脂酶C[18]。

Gpr1是真菌細(xì)胞膜上的G蛋白偶聯(lián)受體，由GPR1編碼，在白念珠菌中其真正的配體是什么仍然存在爭議，有研究認(rèn)為是葡萄糖，也有研究認(rèn)為是氨基酸尤其是甲硫氨酸發(fā)揮著與受體結(jié)合的作用[19]。在GPR1缺失菌中，Gα蛋白即Gpa2的組成性激活能夠解救其在菌絲形成中的缺陷至與野生菌一致，說明GPR1在GPA2的上游發(fā)揮作用[11]，Gpa2是由GPA2基因編碼的G蛋白α亞基，與Gpr1能夠相互作用，Gpr1的C端連接Gpa2后，后者能夠激活A(yù)C。在GPR1或者GPA2的缺失菌中，白念珠菌在固體培養(yǎng)基中菌絲形成和形態(tài)轉(zhuǎn)換都有障礙，但是在液體培養(yǎng)基中并沒有缺陷并且毒力保持完整[11,20]。此外，Ballou等[21]發(fā)現(xiàn)當(dāng)白念珠菌暴露于乳酸中時，Gpr1能夠幫助其掩蔽β-葡聚糖從而逃避免疫系統(tǒng)的檢測。

3 Pde2和cAMP

cAMP是生物體內(nèi)重要的第2信使分子，cAMP激活PKA (cAMP依賴性蛋白激酶)，使靶蛋白磷酸化，產(chǎn)生后續(xù)的效應(yīng)，最后cAMP被磷酸二酯酶 (Pde)水解成5'-AMP而失活，發(fā)揮這一作用的主要是由PDE2編碼的磷酸二酯酶2蛋白 (Pde2)。

Jung等[22]發(fā)現(xiàn)白念珠菌PDE2缺失菌表現(xiàn)出細(xì)胞壁和細(xì)胞膜性質(zhì)改變相關(guān)表型，例如對膜干擾劑熒光素白和抗真菌藥物氟胞嘧啶的敏感性增加，同時細(xì)胞壁組成成分中麥角甾醇和葡聚糖的含量也發(fā)生了改變，導(dǎo)致細(xì)胞壁厚度減少了大約25%。PDE2缺失菌對于營養(yǎng)缺失的敏感性顯著升高，37℃下PDE2缺失菌在PBS中4 h后死亡超過50%，而野生菌超過90%依然存活[23]。另外PDE2缺失菌的體外黏附能力和侵襲能力也有所下降[24]。

在白念珠菌出芽過程中，PDE2的高表達(dá)能夠拮抗SRV2激活的cAMP合成，抑制菌絲的生成，在PDE2缺失菌中，觀察到了高水平的cAMP和菌絲的超常生長，但是超常菌絲生長的狀態(tài)和無菌絲狀態(tài)都是毒力缺失的[23]。

在瓊脂培養(yǎng)基上，野生型菌株形成由出芽酵母構(gòu)成的光滑菌落，而在同樣的條件下，純合的PDE2缺失菌表現(xiàn)出皺褶的菌落表型，褶皺的菌落由假菌絲和真菌絲混合而成[23]。綜上，我們可以知道，Pde2對于調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)cAMP水平是必不可少的，PDE2基因缺失后會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cAMP無法降解以及PKA途徑的持續(xù)性激活。

4 PKA和Bcy1

PKA又稱cAMP依賴的蛋白激酶A，它的激活依賴于cAMP，當(dāng)cAMP水平升高后，與PKA的調(diào)節(jié)亞基結(jié)合從而改變構(gòu)象釋放出催化亞基而激活PKA。白念珠菌中PKA的調(diào)節(jié)亞基由BCY1編碼，催化亞基分別由TPK1和TPK2編碼[25]。

在TPK2基因缺失后，細(xì)胞內(nèi)的PKA活性顯著下降，只有野生型的10%，說明PKA的活性主要由Tpk2發(fā)揮[26]。但是，Tpk1在白念珠菌細(xì)胞壁成分的調(diào)控中發(fā)揮著更重要的作用[27]。在TPK2缺失菌中，液體培養(yǎng)基菌絲的生長顯著受阻而在固體培養(yǎng)基中菌絲形成的影響較小，菌株的毒力也部分下降，反之TPK2的過表達(dá)能誘導(dǎo)菌絲的生成并且促進(jìn)瓊脂侵襲[28]；與TPK2缺失菌相反，TPK1缺失菌在固體培養(yǎng)基中表現(xiàn)出菌絲生長的缺陷，而在液體培養(yǎng)基中菌絲形成只受到了輕微的影響[29]，造成這些差異的原因是兩者的N-末端結(jié)構(gòu)域的不同，在N-末端它們大約有80～90個氨基酸的組成不同，Tpk的N-末端結(jié)構(gòu)域雜交實驗表明瓊脂的侵襲是由Tpk2的N-末端結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的，但是Tpk1和Tpk2的催化域是高度同源的。

由于BCY1純合子缺失菌不能存活，所以Cassola等構(gòu)建了BCY1TPK2雜合缺失菌，缺失菌在GlcNac和血清誘導(dǎo)的條件下存在出芽缺陷。另外，通過Tpk1-GFP考察了野生菌、TPK2缺失菌和BCY1TPK2缺失菌細(xì)胞中Tpk1的定位，發(fā)現(xiàn)與野生菌、TPK2缺失菌中，Tpk1主要定位于細(xì)胞核中不同的是BCY1TPK2缺失菌中Tpk1分散于整個細(xì)胞中。另外，免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)Bcy1與Tpk1-GFP有直接作用，說明Bcy1可能在PKA的催化亞基的細(xì)胞核定位中發(fā)揮重要的功能[30]。

5 Efg1和Flo8

多項證據(jù)表明Efg1是PKA的下游元件，TPK2的過表達(dá)不能恢復(fù)EFG1缺失菌的表型，而EFG1的過表達(dá)卻能夠回復(fù)TPK2基因缺失的菌絲生長缺陷；此外血清誘導(dǎo)的形態(tài)轉(zhuǎn)換已知是由PKA途徑介導(dǎo)的，而EFG1在這個過程中是不可或缺的[31-32]。Efg1作為該通路下游重要的轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)節(jié)下游多種基因的表達(dá)，從而調(diào)控白念珠菌中菌絲形成、生物被膜生成等多種生物學(xué)功能。

Efg1是真菌特異性轉(zhuǎn)錄因子APSES (Asm1,Phd1,Sok2,Efg1,StuA)家族的成員，在形態(tài)轉(zhuǎn)換以及能量代謝等許多不同的生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要的作用[33]。APSES家族還包括構(gòu)巢曲霉的StuA和粗糙脈孢菌中的Asm1，以及釀酒酵母中的Phd1和Sok2，所有APSES蛋白共享約100個氨基酸的高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (APSES結(jié)構(gòu)域)，其中心結(jié)構(gòu)域為典型的堿性螺旋-環(huán)-螺旋 (bHLH)結(jié)構(gòu)[34]，在白念珠菌中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了兩種APSES蛋白：Efg1和Efh1。

Efg1中央是堿性螺旋-環(huán)-螺旋 (bHLH)結(jié)構(gòu)域，其側(cè)翼是在真菌APSES蛋白中高度保守的序列，在N-和C-末端有多聚谷氨酰胺的延伸。Efg1的APSES域是真菌菌絲形態(tài)發(fā)生中必需的，而bHLH側(cè)翼序列是維持Efg1穩(wěn)定所必不可少的。Flo8轉(zhuǎn)錄因子與Efg1的結(jié)合不依賴于APSES結(jié)構(gòu)域，而Efg1與MluI細(xì)胞周期盒 (MCB)元件結(jié)合僅需要APSES結(jié)構(gòu)域。這表明Efg1的功能域包括參與DNA結(jié)合的APSES結(jié)構(gòu)域，以及同各種蛋白質(zhì)相互作用和調(diào)節(jié)活性所需的側(cè)翼區(qū)[35]。

EFG1缺失菌在許多誘導(dǎo)條件下菌絲生長缺陷[36]，在液體或固體培養(yǎng)基中添加血清或GlcNAc誘導(dǎo)菌絲形成被完全阻斷，相比之下，在微需氧或包埋條件下，EFG1基因缺失菌菌絲形成不受影響，甚至可能促進(jìn)菌絲的生長[37]。這些結(jié)果表明，在不同的條件下，Efg1既可以發(fā)揮促進(jìn)菌絲形成的作用，也能抑制這一過程。

Efg1的DNA結(jié)合域可以與菌絲特異基因HYR1、HGC1和ECE1等相結(jié)合，并且介導(dǎo)它們與菌絲特異性Swi/Snf復(fù)合物的結(jié)合，從而實現(xiàn)靶基因在菌絲生成期間的轉(zhuǎn)錄激活[38]。另外，Efg1通過調(diào)節(jié)細(xì)胞壁相關(guān)蛋白基因 (如HWP1、ALS3)的表達(dá)來調(diào)節(jié)細(xì)胞表面特性。Hwp1在白念珠菌細(xì)胞間相互作用以及生物膜形成中十分重要的，在白念珠菌黏附于上皮細(xì)胞的過程中也是必不可少的[39]；Als3是白念珠菌黏附到多種宿主細(xì)胞表面蛋白所必需的，包括內(nèi)皮細(xì)胞上的N-鈣粘蛋白和口腔上皮細(xì)胞上的E-鈣粘蛋白[40]。Efg1還參與了白念珠菌的代謝，在糖酵解中發(fā)揮著作用，在EFG1缺失菌中，糖酵解相關(guān)基因如FBA1、PFK1和ENO1等轉(zhuǎn)錄水平下降[41]。Efg1還負(fù)責(zé)調(diào)控天冬氨酸蛋白酶家族SAP3、SAP5等的表達(dá)，在EFG1缺失菌中，SAP3和SAP5表達(dá)量明顯降低，菌株毒力下降[42]，天冬氨酸蛋白酶是白念珠菌分泌的關(guān)鍵毒力因子，表明Ras/cAMP/PKA信號通路在毒力因子的控制中也發(fā)揮著重要的作用。

Flo8是一個含有LisH結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，是RAS/cAMP/PKA通路下游的調(diào)節(jié)因子，通過影響白念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)換從而影響其致病性和毒力[43-44]，在生物被膜的形成中也發(fā)揮重要的作用[45]。

白念珠菌中FLO8的缺失完全阻斷菌絲形成和菌絲相關(guān)基因的表達(dá)，并導(dǎo)致系統(tǒng)性念珠菌病模型中毒力的喪失。FLO8和EFG1缺失菌的全基因組轉(zhuǎn)錄分析表明，F(xiàn)lo8特異性調(diào)節(jié)Efg1調(diào)節(jié)基因的子集，主要是菌絲特異性基因，提示Flo8可能在Efg1的下游發(fā)生作用，另外免疫共沉淀實驗表明Flo8與Efg1有直接的相互作用，這些結(jié)果提示我們Efg1/Flo8復(fù)合物可能調(diào)控著眾多RAS/cAMP/PKA通路相關(guān)基因的表達(dá)，如HWP1、HYR1、ECE1、ALS3、IHD1、SAP5和HGC1等[46]。此外，Du等[47]的研究表明Flo8在CO2誘導(dǎo)的灰白轉(zhuǎn)換以及菌絲生長中扮演著關(guān)鍵的角色，并且Flo8的異位表達(dá)能夠顯著提高白念珠菌對CO2的敏感性。

RAS/cAMP/PKA信號通路在白念珠菌中發(fā)揮著十分廣泛且重要的作用，在白念珠菌的生存以及對宿主的感染中都扮演著舉足輕重的角色，對于形態(tài)轉(zhuǎn)換、黏附、侵襲、代謝、耐藥、應(yīng)激反應(yīng)和毒力都是不可或缺的。該通路還有許多新的未知功能的基因等待著被發(fā)掘研究，對這些基因功能的探索將會幫助我們了解RAS/cAMP/PKA通路的調(diào)控及分子機制。隨著白念珠菌中一些重要的毒力因子和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被闡釋清楚，其中一些基因或者蛋白未來或許能夠成為研發(fā)新的抗真菌藥物的靶點。

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[本文編輯] 衛(wèi)鳳蓮

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魯仁義，男 (漢族)，碩士研究生在讀.E-mail:15821695738@163.com

姜遠(yuǎn)英,E-mail:13761571578@163.com;閻瀾,E-mail:ylan20001228@sina.com

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1673-3827(2017)12-0052-06

2017-01-12