• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    結(jié)核分枝桿菌在不同pH值液體培養(yǎng)基中對吡嗪酰胺敏感度的研究

    2017-03-16 05:52:15鄭惠文逄宇趙雁林
    中國防癆雜志 2017年2期
    關(guān)鍵詞:吡嗪酰胺結(jié)核

    鄭惠文 逄宇 趙雁林

    ·論著·

    結(jié)核分枝桿菌在不同pH值液體培養(yǎng)基中對吡嗪酰胺敏感度的研究

    鄭惠文 逄宇 趙雁林

    目的 研究結(jié)核分枝桿菌在不同pH值液體培養(yǎng)基中對吡嗪酰胺(PZA)敏感度的影響,同時(shí)比較不同pH值下結(jié)核分枝桿菌對吡嗪酰胺的敏感度與測序結(jié)果的一致率,探討最適合對吡嗪酰胺進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)(簡稱“藥敏試驗(yàn)”)的pH值。方法 本研究采用簡單隨機(jī)抽樣法中的直接抽選法,從2007年全國結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查的3929株結(jié)核分枝桿菌菌株中抽取348株;采用BACTEC MGIT 960系統(tǒng)在液體培養(yǎng)基pH值為 5.3、5.5、5.7、5.9和6.1時(shí),分別檢測結(jié)核分枝桿菌對吡嗪酰胺的敏感度;同時(shí)對吡嗪酰胺耐藥的結(jié)核分枝桿菌相關(guān)基因pncA和rpsA進(jìn)行測序,分析其突變特征;采用卡方檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)2種方法檢測吡嗪酰胺耐藥率的差別,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果 在348株結(jié)核分枝桿菌中,用MGITTM960 PZA試劑盒(pH值為5.9)檢測的吡嗪酰胺總耐藥率為14.4% (50/348),DNA測序結(jié)果有43株耐藥,其中有30(69.8%)株檢測到吡嗪酰胺藥物耐藥相關(guān)基因pncA發(fā)生突變, 1株(2.3%)耐藥分離株僅在rpsA有突變。在液體培養(yǎng)基pH值為6.1、5.9、5.7、5.5 和5.3時(shí),DNA測序結(jié)果與所有菌株表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果的一致率分別為94.8% (330/348)、95.1% (331/348)、 96.8% (337/348)、 95.2% (316/332) 和 93.5% (287/307)。并且pH值為5.7時(shí)2種方法的耐藥一致率(92.1%,35/38)明顯高于pH值為5.9(76.0%, 38/50)時(shí)(χ2=3.961,P=0.047);而pH值為6.1 (72.7%,40/55)、pH值為5.5(93.3%,28/30)和pH值為5.3(95.0%, 19/20)時(shí)的耐藥一致率與pH值為5.9時(shí)的耐藥一致率相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.147,P=0.702;χ2=0.366,P=0.545;χ2=3.410,P=0.065)。結(jié)論 液體培養(yǎng)基pH值為5.7時(shí),結(jié)核分枝桿菌對吡嗪酰胺耐藥與遺傳突變檢測結(jié)果有較好的相關(guān)性。

    分枝桿菌,結(jié)核; 吡嗪酰胺; 培養(yǎng)基, 條件性; DNA突變分析; 抗藥性; 判別分析

    結(jié)核病是全世界重要的公共衛(wèi)生問題之一。據(jù)WHO估計(jì),2015年全球約有104萬例新發(fā)結(jié)核病患者,140萬例死于結(jié)核病,中國的新發(fā)結(jié)核病患者例數(shù)僅次于印度和印度尼西亞而位居全球第三位[1]。吡嗪酰胺(PZA)是重要的一線抗結(jié)核藥物,可在酸性環(huán)境中殺死半休眠狀態(tài)的結(jié)核分枝桿菌,使化療療程從既往的9~12個(gè)月縮短至6個(gè)月[2]。在酸性環(huán)境中(pH=5.5),PZA能夠轉(zhuǎn)化為吡嗪酸(pyrozinoic acid,POA),發(fā)揮殺菌活性[3]。WHO 推薦采用BACTEC MGIT 960系統(tǒng)(簡稱“MGIT 960系統(tǒng)”)在酸性環(huán)境中(pH=5.9)檢測結(jié)核分枝桿菌對PZA的敏感度[4],但不同的pH值將影響吡嗪酰胺酶(pyrazanamidase, PZase)的活性,從而可能對結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生不同的抑制作用。此外,編碼吡嗪酰胺酶的基因pncA和編碼核糖體蛋白質(zhì)S1的基因rpsA突變也與結(jié)核分枝桿菌PZA耐藥有關(guān)[5]。因此,筆者采用MGIT 960系統(tǒng),檢測液體培養(yǎng)基不同pH值情況下結(jié)核分枝桿菌對PZA敏感度的影響,并與DNA測序表型藥物敏感性試驗(yàn)(簡稱“藥敏試驗(yàn)”)結(jié)果進(jìn)行比較,探討最適合進(jìn)行PZA藥敏試驗(yàn)的液體培養(yǎng)基pH值。

    材料和方法

    一、菌株來源

    本實(shí)驗(yàn)采用簡單隨機(jī)抽樣法中的直接抽選法,從3929株來自于2007年全國結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查的菌株中抽取348株,菌株由中國疾病預(yù)防控制中心國家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室提供。348株菌株經(jīng)對硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羧酸肼(TCH)菌種鑒定實(shí)驗(yàn)證實(shí)為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTBC)。

    二、試劑來源

    本實(shí)驗(yàn)所用改良羅氏培養(yǎng)基購于珠海貝索生物技術(shù)有限公司; MGITTM960 PZA試劑盒購于美國BD公司(貨號(hào)245128,批號(hào)4199861,效期2016年11月26日);2×Taq 預(yù)混液購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;所有引物均由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成。

    三、PZA藥敏試驗(yàn)

    采用WHO推薦的MGIT 960系統(tǒng)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。將結(jié)核分枝桿菌陽性培養(yǎng)物制備成1 mg/ml 菌懸液,稀釋至106菌落形成單位(CFU)/ml,取0.5 ml菌懸液加入進(jìn)行PZA藥敏試驗(yàn)專用的MGIT培養(yǎng)管中(藥物濃度100 μg/ml),將菌懸液1∶10稀釋后加入不含PZA的培養(yǎng)管中,作為生長對照管。采用結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv(ATCC 27249)作為質(zhì)控菌株。此外,用磷酸將液體培養(yǎng)基的pH值 (5.9)調(diào)節(jié)到5.3、5.5和5.7,用碳酸氫鈉將液體培養(yǎng)基pH值調(diào)到6.1。液體培養(yǎng)基的pH值用pH計(jì)進(jìn)行檢測。然后置于MGIT 960系統(tǒng)中,根據(jù)分枝桿菌生長情況比對自動(dòng)報(bào)告藥物敏感度結(jié)果。

    四、基因組DNA提取

    采用簡單水煮法提取MTB基因組DNA,使用接種環(huán)從改良羅氏培養(yǎng)基斜面刮取MTB菌落,將菌落轉(zhuǎn)移至含有1 ml生理鹽水的無菌Eppendorf 離心管中,85 ℃ 30 min滅活,12 000×g離心5 min,棄上清。菌體用500 μl TE (Tris-EDTA) 緩沖液(pH=8.0)充分懸浮,100 ℃沸水浴30 min,12 000×g離心5 min,將上清轉(zhuǎn)移至無菌離心管中用于基因擴(kuò)增模板。

    五、基因擴(kuò)增和測序

    擴(kuò)增對PZA耐藥的相關(guān)基因pncA和rpsA, 引物序列分別為F1,5′-TGCCACTCGCCGGTAACCGG-3;F2,5′-GGTGGCCGCCGCTCAGCTGG-3′,用于擴(kuò)增pncA全基因;F3,5′-GGCCGCAGCTG-GGACGCGGC-3′; F4, 5′-CGGTCCAGCGCTCC-GTCTGC-3′,用于擴(kuò)增rpsA全基因。擴(kuò)增體系如下:2×Taq 預(yù)混液25 μl, 上游引物0.2 μmol, 下游引物0.2 μmol,基因組DNA 5 μl,使用雙蒸水(ddH2O)補(bǔ)平到總體積50 μl。PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性94 ℃ 5 min; 94 ℃ 1 min, 58 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min, 35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min?;驍U(kuò)增產(chǎn)物送北京擎科生物技術(shù)有限公司測序。測序結(jié)果采用BioEdit 軟件與標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv基因序列進(jìn)行比對。

    六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用SPSS 11.5 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,藥物敏感性結(jié)果與測序結(jié)果一致率之間的比較采用χ2檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    一、pncA和rpsA突變結(jié)果分析

    348株MTBC中,220株(63.2%)為敏感株,128株(36.8%)為耐藥菌株,其中MDR 33株,XDR 2株(表1)。MGITTM960 PZA試劑盒(pH=5.9)檢測的50株P(guān)ZA耐藥株中,測序結(jié)果有43株耐藥,其中30株pncA發(fā)生突變,突變率達(dá)69.8%(30/43)。其中23株(76.7%)為氨基酸替換突變,6株(20.0%)為堿基插入或缺失引起的氨基酸移碼突變,1株(1/30)在啟動(dòng)子區(qū)-11位堿基發(fā)生A→C突變。除了pncA基因外,1株(2.3%)PZA耐藥分離株僅在rpsA有突變。此外,1株P(guān)ZA敏感株分別在pncA的40位密碼子和rpsA的497位密碼子檢測出突變(表2)。

    表1 不同耐藥類型在348株結(jié)核分枝桿菌分離菌株中的分布及耐藥率

    注 H:異煙肼;R:利福平;E:乙胺丁醇;S:鏈霉素;Ofx:氧氟沙星;Km:卡那霉素;MDR:耐多藥;XDR:廣泛耐藥

    二、不同pH值液體培養(yǎng)基的藥敏試驗(yàn)結(jié)果比較

    在液體培養(yǎng)基的pH值為5.5和5.3時(shí),分別有16株(4.6%)和41株(11.8%)在對照管中沒有生長。在液體培養(yǎng)基的pH值為6.1、5.9、5.7、5.5 和5.3時(shí),PZA表型耐藥分離株分別占有藥敏試驗(yàn)結(jié)果菌株的15.8% (55/348)、14.4% (50/348)、10.9% (38/348)、9.0%(30/332)和6.5%(20/307)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明,表型耐藥與基因型耐藥的一致率在培養(yǎng)基的pH值為 5.9時(shí)和pH值為6.1時(shí)分別為76.0% (38/50)、72.7% (40/55),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)

    表2 對PZA耐藥結(jié)核分枝桿菌的pncA和rpsA基因突變情況

    注a:啟動(dòng)子區(qū)無氨基酸變化

    意義(χ2=0.147,P=0.702)。在培養(yǎng)基的pH值為 5.7時(shí),表型耐藥與基因型耐藥藥敏試驗(yàn)結(jié)果的一致率明顯高于pH值為 5.9時(shí),耐藥一致率分別為92.1% (35/38)、76.0%(38/50),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.961,P=0.047)。同樣,pH 值為5.5時(shí)的耐藥一致率(93.3%)明顯高于pH值為 5.9時(shí),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.902,P=0.048)。與DNA測序結(jié)果相比,表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果的一致率在pH值為6.1、5.9、5.7、5.5 和5.3時(shí)分別為94.8%(330/348)、95.1%(331/348)、 96.8%(337/348)、 95.2%(316/332) 和 93.5%(287/307),并且在pH值為5.9時(shí)的一致率明顯低于pH值為5.7時(shí),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.441,P=0.020)(表3)。

    表3 對PZA進(jìn)行表型藥敏試驗(yàn)的結(jié)果與pncA或rpsA基因突變測序結(jié)果的一致率

    注 一致率以表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)

    討 論

    PZA可以殺死半休眠狀態(tài)的結(jié)核分枝桿菌,是結(jié)核病短程化療方案的重要組成藥物。研究發(fā)現(xiàn),PZA只有在體外酸性環(huán)境中或巨噬細(xì)胞中才能發(fā)揮抗結(jié)核分枝桿菌作用,它進(jìn)入體內(nèi)后,通過吡嗪酰胺酶轉(zhuǎn)化為吡嗪酸實(shí)現(xiàn)殺菌作用。然而由于PZA體外實(shí)驗(yàn)對培養(yǎng)條件的特殊要求,改良羅氏培養(yǎng)法尚不能檢測PZA耐藥性[6]。MGIT 960系統(tǒng)是WHO推薦的液體藥敏試驗(yàn)檢測系統(tǒng),在液體培養(yǎng)基pH值為5.9時(shí)可用于對PZA的體外敏感度檢測,但該酸度并不能使吡嗪酰胺酶的活性發(fā)揮最大,超過10%的分枝桿菌在pH值為5.5時(shí)不能生長,而此時(shí)PZA在體外的活性最大[7-8]。因此,尋找適合細(xì)菌生長和酶活性的pH值至關(guān)重要。筆者研究發(fā)現(xiàn)液體培養(yǎng)基酸度越大,對PZA耐藥的比例越低。說明低pH值更有利于吡嗪酰胺酶發(fā)揮活性,將PZA轉(zhuǎn)化為吡嗪酸,從而抑制結(jié)核分枝桿菌生長。研究表明,部分菌株、尤其是PZA耐藥菌株在pH值低于5.5的酸性環(huán)境中不能生長[9]。與之前研究類似[9-10],筆者發(fā)現(xiàn)在pH值為5.3時(shí),11.8%的結(jié)核分枝桿菌不能生長;而pH高于5.7時(shí),結(jié)核分枝桿菌的生長并未受到抑制,表明該pH值是結(jié)核分枝桿菌存活的上限。

    結(jié)核分枝桿菌編碼吡嗪酰胺酶的pncA基因發(fā)生突變,導(dǎo)致該酶活性下降,是結(jié)核分枝桿菌對PZA耐藥的主要原因[11]。Chang等[12]分析表明,平均87%的對PZA耐藥的菌株中pncA基因發(fā)生突變。而本研究中只有69.8%的對PZA耐藥的菌株出現(xiàn)pncA突變,與國外報(bào)道的69%~98.8%突變率相似[13-15]。這種不同可能是由于MGIT960系統(tǒng)本身造成的假陽性結(jié)果,包括培養(yǎng)基的pH值、抗生素濃度和接種量[16]。當(dāng)培養(yǎng)基的pH值調(diào)到5.7時(shí),MGIT 960系統(tǒng)檢測的結(jié)核分枝桿菌對PZA的耐藥與基因測序有較好的相關(guān)性。由于pH值為 5.9時(shí),MGIT 960檢測系統(tǒng)可能產(chǎn)生較多的假陽性PZA耐藥株,因此將培養(yǎng)基的pH值降到理想的水平是至關(guān)重要的。

    綜上所述,遺傳突變與液體培養(yǎng)基pH 值為5.7時(shí)的PZA耐藥有較好的相關(guān)性。在對PZA進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)中,液體培養(yǎng)基pH 值為5.7或許是調(diào)節(jié)吡嗪酰胺酶活性和結(jié)核分枝桿菌生長的理想閾值。

    [1] World Health Organization. Global tuberculosis report 2016. Geneva: World Health Organization, 2016.

    [2] Heifets L, Lindholm-Levy P. Pyrazinamide sterilizing activity in vitro against semidormantMycobacteriumtuberculosisbac-terial populations. Am Rev Respir Dis, 1992, 145(5): 1223-1225.

    [3] 羅振華, 錢雪琴, 范齊文, 等. 結(jié)核分枝桿菌吡嗪酰胺耐藥相關(guān)分子特征分析. 中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志, 2015, 35(9): 660-665.

    [4] World Health Orgnization. Guidelines for surveillance of drug resistance in tuberculosis. Geneva: World Health Organization, 2009.

    [5] 胡族瓊, 蔡杏珊, 謝偉勝, 等. 吡嗪酰胺耐藥結(jié)核分枝桿菌pncA及rpsA基因突變特征分析. 中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2014, 37(4): 285-289.

    [6] 張國欽, 商健, 張玉華, 等. 天津市城區(qū)肺結(jié)核患者對吡嗪酰胺耐藥的現(xiàn)狀及特征. 中國防癆雜志, 2015, 37(5): 508-513.

    [7] Zhang Y, Permar S, Sun Z, et al. Conditions that may affect the results of susceptibility testing ofMycobacteriumtuberculosisto pyrazinamide. J Med Microbiol, 2002, 51(1): 42-49.

    [8] Zhang Y, Mitchison D. The curious characteristics of pyrazinamide: a review. Int J Tuberc Lung Dis, 2003, 7(1): 6-21.

    [9] Salfinger M, Heifets LB. Determination of pyrazinamide MICs forMycobacteriumtuberculosisat different pHs by the radiome-tric method. Antimicrob Agents Chemother, 1988, 32(7): 1002-1004.

    [10] Pang Y, Wang Z, Zheng H, et al. Pyrazinamide resistance determined by liquid culture at low pH better correlates with genetic mutations in MDR tuberculosis isolates. J Microbiol Methods, 2015, 119(12): 142-144.

    [11] Hirano K, Takahashi M, Kazumi Y, et al. Mutation in pncA is a major mechanism of pyrazinamide resistance inMycobacteriumtuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis, 1997, 78(2): 117-122.

    [12] Chang KC, Yew WW, Zhang Y. Pyrazinamide susceptibility testing inMycobacteriumtuberculosis: a systematic review with meta-analyses. Antimicrob Agents Chemother, 2011, 55(10): 4499-4505.

    [13] Muthaiah M, Jagadeesan S, Ayalusamy N, et al. Molecular epidemiological study of pyrazinamide-resistance in clinical isolates ofMycobacteriumtuberculosisfrom South India. Int J Mol Sci, 2010, 11(7): 2670-2680.

    [14] Zimic M, Sheen P, Quiliano M, et al. Peruvian and globally reported amino acid substitutions on theMycobacteriumtuberculosispyrazinamidase suggest a conserved pattern of mutations associated to pyrazinamide resistance. Infect Genet Evol, 2010, 10(2): 346-349.

    [15] McCammon MT, Gillette JS, Thomas DP, et al. Detection by denaturing gradient gel electropHoresis of pncA mutations associated with pyrazinamide resistance inMycobacteriumtuberculosisisolates from the United States-Mexico border region. Antimicrob Agents Chemother, 2005, 49(6): 2210-2217.

    [16] Miotto P, Cabibbe AM, Feuerriegel S, et al.Mycobacteriumtuberculosispyrazinamide resistance determinants: a multicenter study. mBio, 2014, 5(5): e01819-14.

    (本文編輯:范永德)

    The effect of pH on the pyrazinamide susceptibility ofMycobacteriumtuberculosis

    ZHENGHui-wen*,PANGYu,ZHAOYan-lin.

    *NationalInstituteforCommunicableDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China

    ZHAOYan-lin,Email:zhaoyanlin@chinatb.org

    Objective To evaluate the effect of pH on the pyrazinamide (PZA) susceptibility ofMycobac-teriumtuberculosisstrains in the BACTEC MGIT 960 liquid medium, to demonstrate the relationship between phenotype susceptibility and genetic changes amongM.tuberculosisisolates, and to determine the most suitable pH value for evaluating pyrazinamide susceptibility. Methods A total of 348 isolates were randomly selected from those collected during the national drug resistance baseline survey conducted in 2007, and the PZA susceptibility of eachM.tuberculosisisolate was detected using the BACTEC MGIT 960 automated system at pH 5.3, 5.5, 5.7, 5.9 and 6.1. ThepncAandrpsAgenes from all isolates were sequenced for genetic mutations conferring PZA resistance. The concordance rate between phenotypic DST in different pH environments and genetic changes was evaluated using the Chi-square test,P<0.05 being considered statistically significant. Results Of the 348M.tuberculosisisolates, 50 (14.4%) isolates resistant to PZA were detected using a commercial BACTEC MGIT 960 PZA kit at pH 5.9, and 43 using DNA sequencing, 30 (69.8%) isolates harboringpncAmutations, and 1 (2.3%) isolate harboring mutations only inrpsA. The overall concordance rate between DNA sequencing and phenotypic DST results at different pH values was 94.8% (330/348), 95.1% (331/348), 96.8% (337/348), 95.2% (316/332) and 93.5% (287/307) at pH 6.1, pH 5.9, pH 5.7, pH 5.5 and pH 5.3, respectively. The difference between the pH 5.9 and pH 5.7 groups was statistically significant (χ2=3.961,P=0.047), but that between the pH 6.1, pH 5.5, pH 5.3 and pH 5.9 groups (χ2=0.147,P=0.702;χ2=0.366,P=0.545;χ2=3.410,P=0.065, respectively) was not statistically significant. Conclusion The strongest correlation between genetic changes inM.tuberculosisisolates and PZA resistance was obtained using liquid culture at pH 5.7. Using a pH 5.7 liquid medium may be the best approach to resolve the dilemma between PZase activity and mycobacterial growth during PZA susceptibility testing.

    Mycobacteriumtuberculosis; Pyrazinamide; Culture media, conditioned; DNA mutational analysis; Drug resistance; Discriminant analysis

    10.3969/j.issn.1000-6621.2017.02.009

    “十二五”國家科技重大專項(xiàng)(2014ZX100030002)

    102206 北京,中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所(鄭惠文),結(jié)核病預(yù)防控制中心(逄宇、趙雁林)

    趙雁林,Email:zhaoyanlin@chinatb.org

    2016-11-21)

    猜你喜歡
    吡嗪酰胺結(jié)核
    雙酰胺類殺蟲劑Broflanilide
    三氟咪啶酰胺的合成工藝研究
    一度浪漫的結(jié)核
    特別健康(2018年4期)2018-07-03 00:38:26
    層次分析模型在結(jié)核疾病預(yù)防控制系統(tǒng)中的應(yīng)用
    中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核感染的中醫(yī)辨治思路
    濃香型“山莊老酒”中吡嗪類物質(zhì)的分析研究
    中國釀造(2015年4期)2015-01-26 22:50:40
    國外二硝酰胺銨的發(fā)展現(xiàn)狀
    4H,8H-雙呋咱并[3,4-b:3',4'-e]吡嗪的合成及熱性能
    疣狀皮膚結(jié)核1例
    吡嗪-2,3,5,6-四甲酸及4,4′-聯(lián)吡啶與ds-金屬配合物合成、結(jié)構(gòu)及發(fā)光性質(zhì)
    久久人人精品亚洲av| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | av在线老鸭窝| 精品欧美国产一区二区三| 久久人人爽人人爽人人片va| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 亚洲在久久综合| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 69av精品久久久久久| 精品国产三级普通话版| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 免费观看在线日韩| 日韩视频在线欧美| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 深爱激情五月婷婷| 国内揄拍国产精品人妻在线| 国产精品久久久久久久电影| 亚洲人成网站高清观看| 最近2019中文字幕mv第一页| 青青草视频在线视频观看| 成人国产麻豆网| 极品教师在线视频| 久久人人爽人人片av| 好男人在线观看高清免费视频| 国产精品久久久久久精品电影| 亚洲电影在线观看av| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 成人二区视频| 午夜福利在线观看吧| 久久人人爽人人爽人人片va| 免费看a级黄色片| 婷婷精品国产亚洲av| 久久久a久久爽久久v久久| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 国产精品女同一区二区软件| 婷婷色综合大香蕉| 欧美最新免费一区二区三区| 国产色婷婷99| 免费看av在线观看网站| 美女内射精品一级片tv| 久久精品影院6| 一边亲一边摸免费视频| 日本与韩国留学比较| 国产精品一区二区在线观看99 | av天堂中文字幕网| 国产精品电影一区二区三区| 干丝袜人妻中文字幕| 成人无遮挡网站| 久久精品综合一区二区三区| 3wmmmm亚洲av在线观看| 久久精品91蜜桃| 成人一区二区视频在线观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 99久久无色码亚洲精品果冻| 欧美精品国产亚洲| 国产一区二区三区av在线 | 亚洲av一区综合| 成人毛片60女人毛片免费| 晚上一个人看的免费电影| 日本一二三区视频观看| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 搡女人真爽免费视频火全软件| 日本免费一区二区三区高清不卡| 欧美日韩国产亚洲二区| 午夜久久久久精精品| 免费在线观看成人毛片| 国产精品久久视频播放| 久久久久久久午夜电影| 亚洲欧洲国产日韩| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| h日本视频在线播放| 国产激情偷乱视频一区二区| 99久国产av精品| 精品一区二区三区视频在线| 欧美在线一区亚洲| 男女边吃奶边做爰视频| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 校园春色视频在线观看| 亚洲人与动物交配视频| 成人无遮挡网站| 我要搜黄色片| 亚洲精品粉嫩美女一区| 日韩制服骚丝袜av| 只有这里有精品99| 欧美三级亚洲精品| 亚洲在久久综合| 一级毛片aaaaaa免费看小| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 美女内射精品一级片tv| 国产精品女同一区二区软件| 精品午夜福利在线看| 最新中文字幕久久久久| 亚洲综合色惰| 又粗又爽又猛毛片免费看| 在线a可以看的网站| 亚洲欧美成人精品一区二区| 国产日韩欧美在线精品| 特大巨黑吊av在线直播| 简卡轻食公司| 国产成人影院久久av| 日韩成人av中文字幕在线观看| 一边亲一边摸免费视频| www.色视频.com| 亚州av有码| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 国产av麻豆久久久久久久| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 成人鲁丝片一二三区免费| 成人性生交大片免费视频hd| 中国美女看黄片| 国产高清有码在线观看视频| 一区二区三区免费毛片| 男女视频在线观看网站免费| or卡值多少钱| 亚洲av成人av| 色综合亚洲欧美另类图片| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 身体一侧抽搐| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 伦理电影大哥的女人| 91狼人影院| av专区在线播放| 国产色爽女视频免费观看| 人妻少妇偷人精品九色| av在线天堂中文字幕| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 亚洲电影在线观看av| 亚洲av二区三区四区| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 国产精品人妻久久久久久| 黄色欧美视频在线观看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 久久久欧美国产精品| 亚洲在线自拍视频| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产中年淑女户外野战色| 国产老妇伦熟女老妇高清| 好男人视频免费观看在线| 午夜亚洲福利在线播放| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 婷婷色综合大香蕉| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 一区二区三区高清视频在线| 全区人妻精品视频| 亚洲最大成人中文| 天天一区二区日本电影三级| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 成人美女网站在线观看视频| 色尼玛亚洲综合影院| 精品日产1卡2卡| 久久99热6这里只有精品| 久99久视频精品免费| 国产成人aa在线观看| 欧美极品一区二区三区四区| a级毛色黄片| 久久精品国产亚洲网站| 国产成人aa在线观看| 亚洲成人久久爱视频| 给我免费播放毛片高清在线观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 淫秽高清视频在线观看| 日日撸夜夜添| 色综合亚洲欧美另类图片| 成人国产麻豆网| 欧美bdsm另类| 精品久久久久久久久亚洲| 亚洲欧美日韩无卡精品| 最好的美女福利视频网| 欧美又色又爽又黄视频| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 精品一区二区三区人妻视频| 精品熟女少妇av免费看| 久久精品91蜜桃| 99视频精品全部免费 在线| 在线a可以看的网站| 国产精品一区二区在线观看99 | 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 亚洲真实伦在线观看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 亚洲精品亚洲一区二区| 男女啪啪激烈高潮av片| 日韩av不卡免费在线播放| 日韩av不卡免费在线播放| 在线观看av片永久免费下载| 一进一出抽搐gif免费好疼| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产成人精品久久久久久| 成年女人看的毛片在线观看| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 免费观看的影片在线观看| 最后的刺客免费高清国语| 性色avwww在线观看| 国产精品伦人一区二区| 久久精品国产亚洲网站| 国产精品一二三区在线看| 免费看av在线观看网站| 免费看日本二区| 亚洲精品456在线播放app| 干丝袜人妻中文字幕| 中出人妻视频一区二区| 人妻久久中文字幕网| 欧美成人免费av一区二区三区| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲不卡免费看| 老女人水多毛片| 成人美女网站在线观看视频| 免费人成在线观看视频色| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 一级黄色大片毛片| 在线观看免费视频日本深夜| 天堂中文最新版在线下载 | 好男人在线观看高清免费视频| 欧美zozozo另类| 国产av不卡久久| 日韩强制内射视频| 搡老妇女老女人老熟妇| 免费人成视频x8x8入口观看| 一区二区三区免费毛片| 毛片女人毛片| 成人av在线播放网站| 国产中年淑女户外野战色| 午夜激情欧美在线| 成人二区视频| 别揉我奶头 嗯啊视频| 青春草视频在线免费观看| 久久久久久久久中文| 欧美激情国产日韩精品一区| 久久久久久久久久久免费av| 神马国产精品三级电影在线观看| 日韩制服骚丝袜av| 国产高清视频在线观看网站| 麻豆国产97在线/欧美| 免费看美女性在线毛片视频| 岛国在线免费视频观看| 欧美成人一区二区免费高清观看| 午夜精品在线福利| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产精品久久久久久久久免| 别揉我奶头 嗯啊视频| 天堂网av新在线| 日韩在线高清观看一区二区三区| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 网址你懂的国产日韩在线| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 国产成人91sexporn| 少妇的逼好多水| 免费看美女性在线毛片视频| 男女视频在线观看网站免费| 日韩亚洲欧美综合| 日本黄色片子视频| 久久久久久久久久久丰满| 99精品在免费线老司机午夜| 欧美激情国产日韩精品一区| 欧美最新免费一区二区三区| 国产精品综合久久久久久久免费| 最好的美女福利视频网| 国产伦精品一区二区三区视频9| АⅤ资源中文在线天堂| 综合色丁香网| 午夜免费激情av| 韩国av在线不卡| 欧美高清性xxxxhd video| 成人欧美大片| 久久鲁丝午夜福利片| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 免费av毛片视频| 色哟哟·www| 天天躁日日操中文字幕| 成人鲁丝片一二三区免费| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 久久久欧美国产精品| 99久久九九国产精品国产免费| 亚洲一区二区三区色噜噜| 蜜臀久久99精品久久宅男| 丰满的人妻完整版| a级毛片a级免费在线| 精品久久久久久久末码| 51国产日韩欧美| 色尼玛亚洲综合影院| 中文字幕av在线有码专区| .国产精品久久| 蜜臀久久99精品久久宅男| 久久久久久久久大av| or卡值多少钱| 插阴视频在线观看视频| 少妇熟女欧美另类| 99久久人妻综合| 久久久久免费精品人妻一区二区| 欧美日韩综合久久久久久| 亚洲成人av在线免费| 日本与韩国留学比较| 久久久成人免费电影| 日本一二三区视频观看| 日本黄色片子视频| 99热这里只有是精品50| 麻豆成人av视频| 高清午夜精品一区二区三区 | 国产片特级美女逼逼视频| 特大巨黑吊av在线直播| 国产精品电影一区二区三区| 国产精品.久久久| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产成人91sexporn| 日韩强制内射视频| 久久久久九九精品影院| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产日韩欧美在线精品| 岛国毛片在线播放| 亚洲av中文av极速乱| 我的女老师完整版在线观看| 嫩草影院新地址| 一进一出抽搐动态| 一本精品99久久精品77| 国产精品99久久久久久久久| 成年女人看的毛片在线观看| 黄片wwwwww| 激情 狠狠 欧美| 午夜精品国产一区二区电影 | 亚洲欧美日韩高清专用| 99热这里只有精品一区| 99久久精品一区二区三区| 欧美最新免费一区二区三区| 久久人人精品亚洲av| 亚洲av成人av| 高清毛片免费观看视频网站| 国产精品久久久久久久久免| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 变态另类丝袜制服| 日韩欧美精品免费久久| 欧美成人免费av一区二区三区| 不卡一级毛片| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 久久热精品热| 日韩欧美三级三区| 久久午夜福利片| 中出人妻视频一区二区| 久久久欧美国产精品| 亚洲精品久久久久久婷婷小说 | 亚洲精品亚洲一区二区| 深夜精品福利| 久久午夜福利片| 成熟少妇高潮喷水视频| 免费av观看视频| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产成人91sexporn| 夜夜爽天天搞| 成人鲁丝片一二三区免费| 中文字幕av在线有码专区| 麻豆久久精品国产亚洲av| 国产精品一及| 美女内射精品一级片tv| 欧美极品一区二区三区四区| 国产成人一区二区在线| 此物有八面人人有两片| 国产av不卡久久| 国产亚洲av嫩草精品影院| 久久久久久久久久久丰满| h日本视频在线播放| 黄片wwwwww| 69人妻影院| 性欧美人与动物交配| 欧美日韩国产亚洲二区| 神马国产精品三级电影在线观看| 国产av不卡久久| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产精品99久久久久久久久| 日日啪夜夜撸| 舔av片在线| 午夜激情福利司机影院| 成人欧美大片| 国产精品综合久久久久久久免费| 亚洲国产欧美在线一区| 亚洲欧美清纯卡通| 一本精品99久久精品77| 国产高清不卡午夜福利| 日韩制服骚丝袜av| 性插视频无遮挡在线免费观看| 晚上一个人看的免费电影| 亚洲最大成人中文| av免费观看日本| 国产黄片视频在线免费观看| 欧美3d第一页| 国产精品99久久久久久久久| 村上凉子中文字幕在线| 青青草视频在线视频观看| 欧美丝袜亚洲另类| 日韩欧美在线乱码| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 男女边吃奶边做爰视频| 国产成人aa在线观看| 日韩一区二区视频免费看| 欧美一区二区精品小视频在线| 一边亲一边摸免费视频| 晚上一个人看的免费电影| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 亚洲成人精品中文字幕电影| 九九热线精品视视频播放| 日韩 亚洲 欧美在线| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 欧美一区二区国产精品久久精品| 在线免费十八禁| 国产在线男女| 99国产极品粉嫩在线观看| 欧美性感艳星| 免费看日本二区| 婷婷亚洲欧美| 国产精品久久久久久精品电影| 我的老师免费观看完整版| 69人妻影院| 中文在线观看免费www的网站| 国产精品久久久久久久电影| 国产成年人精品一区二区| 久久九九热精品免费| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 乱人视频在线观看| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 中国美白少妇内射xxxbb| 成人三级黄色视频| 一区二区三区四区激情视频 | 亚洲自拍偷在线| 国产精品女同一区二区软件| 国产乱人偷精品视频| 欧美最新免费一区二区三区| 久久久久久久久大av| 午夜福利视频1000在线观看| 亚洲在线观看片| 男女啪啪激烈高潮av片| 欧美日韩综合久久久久久| 久久欧美精品欧美久久欧美| 亚洲自偷自拍三级| 成人午夜高清在线视频| 成熟少妇高潮喷水视频| 国产黄片美女视频| 国产精品免费一区二区三区在线| 国产精品久久视频播放| 老女人水多毛片| 久久久久久九九精品二区国产| 亚洲精品国产成人久久av| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲一区二区三区色噜噜| 亚洲内射少妇av| 国产麻豆成人av免费视频| 亚洲欧美成人精品一区二区| 深夜a级毛片| 一边摸一边抽搐一进一小说| 十八禁国产超污无遮挡网站| 精品人妻偷拍中文字幕| 黄色视频,在线免费观看| 国产精品久久久久久久久免| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | av在线播放精品| 内地一区二区视频在线| 亚洲国产高清在线一区二区三| 九色成人免费人妻av| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 久久久久久伊人网av| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲成av人片在线播放无| av免费观看日本| 亚洲精品久久国产高清桃花| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产乱人视频| 最近中文字幕高清免费大全6| 国产av一区在线观看免费| 麻豆久久精品国产亚洲av| 久久综合国产亚洲精品| 国内精品久久久久精免费| 午夜福利在线在线| 欧美激情在线99| 丝袜喷水一区| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| av在线播放精品| 久久久a久久爽久久v久久| 日韩一本色道免费dvd| 搡老妇女老女人老熟妇| 国产在视频线在精品| 久久热精品热| av在线播放精品| 国产成人精品一,二区 | 日本欧美国产在线视频| 成人午夜精彩视频在线观看| 国产 一区精品| 一本久久精品| 在线播放无遮挡| 国产不卡一卡二| 久久久色成人| 亚洲欧美成人精品一区二区| 久久这里只有精品中国| 99久国产av精品国产电影| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 亚洲美女视频黄频| 国产精品一区www在线观看| 国产成人freesex在线| 深夜精品福利| 成人鲁丝片一二三区免费| 在线观看66精品国产| 激情 狠狠 欧美| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 村上凉子中文字幕在线| 一本久久中文字幕| 尾随美女入室| 久久久久久久久大av| 少妇熟女欧美另类| 小说图片视频综合网站| 日韩强制内射视频| 国产av一区在线观看免费| 此物有八面人人有两片| 亚洲高清免费不卡视频| 欧美变态另类bdsm刘玥| 精华霜和精华液先用哪个| 久久久久网色| 日本熟妇午夜| 亚洲18禁久久av| 91精品国产九色| 久久热精品热| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 在线国产一区二区在线| 久久久成人免费电影| 99热全是精品| 成人亚洲欧美一区二区av| 99在线人妻在线中文字幕| 国产精品蜜桃在线观看 | 亚洲18禁久久av| 精品久久久久久成人av| 亚洲真实伦在线观看| 亚洲国产精品成人久久小说 | 精品免费久久久久久久清纯| 日韩一区二区视频免费看| 色吧在线观看| 又爽又黄a免费视频| 国产一区二区三区av在线 | 国产亚洲精品久久久久久毛片| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 免费人成在线观看视频色| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 久久人人爽人人片av| 精品一区二区三区人妻视频| 六月丁香七月| 亚洲一区高清亚洲精品| 成人毛片a级毛片在线播放| 97热精品久久久久久| 大香蕉久久网| 超碰av人人做人人爽久久| 国产探花在线观看一区二区| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 久久久国产成人精品二区| 又粗又爽又猛毛片免费看| 99久国产av精品国产电影| .国产精品久久| av在线播放精品| 久久久久免费精品人妻一区二区| 精品久久久久久久久av| 观看免费一级毛片| 男女下面进入的视频免费午夜| 麻豆乱淫一区二区| 国产精品一区二区性色av| 久久韩国三级中文字幕| 国产精品人妻久久久久久| 国产精品一区二区三区四区久久| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 午夜福利在线在线| 亚洲成人久久爱视频| 九九在线视频观看精品| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 日韩国内少妇激情av| 欧美性猛交黑人性爽| 亚洲在线观看片| 美女国产视频在线观看| 久久草成人影院| 2022亚洲国产成人精品| 午夜福利视频1000在线观看| h日本视频在线播放| 搡老妇女老女人老熟妇| 日韩在线高清观看一区二区三区| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 午夜久久久久精精品| 国产不卡一卡二| 99久国产av精品| 国产精品福利在线免费观看| 国产成人aa在线观看| 国内精品美女久久久久久| 性色avwww在线观看| 伦理电影大哥的女人| 搡老妇女老女人老熟妇| 欧美变态另类bdsm刘玥| 九色成人免费人妻av| 国产成人a区在线观看| 久久久久久久久大av| 成熟少妇高潮喷水视频| 国产精品无大码| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 男女啪啪激烈高潮av片| 日本欧美国产在线视频| 熟女电影av网| 天天躁日日操中文字幕| 三级经典国产精品| 一区二区三区四区激情视频 | 色哟哟·www| 欧美人与善性xxx| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产一区二区在线av高清观看| 日韩大尺度精品在线看网址|