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    結(jié)核分枝桿菌在不同pH值液體培養(yǎng)基中對吡嗪酰胺敏感度的研究

    2017-03-16 05:52:15鄭惠文逄宇趙雁林
    中國防癆雜志 2017年2期
    關(guān)鍵詞:吡嗪酰胺結(jié)核

    鄭惠文 逄宇 趙雁林

    ·論著·

    結(jié)核分枝桿菌在不同pH值液體培養(yǎng)基中對吡嗪酰胺敏感度的研究

    鄭惠文 逄宇 趙雁林

    目的 研究結(jié)核分枝桿菌在不同pH值液體培養(yǎng)基中對吡嗪酰胺(PZA)敏感度的影響,同時(shí)比較不同pH值下結(jié)核分枝桿菌對吡嗪酰胺的敏感度與測序結(jié)果的一致率,探討最適合對吡嗪酰胺進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)(簡稱“藥敏試驗(yàn)”)的pH值。方法 本研究采用簡單隨機(jī)抽樣法中的直接抽選法,從2007年全國結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查的3929株結(jié)核分枝桿菌菌株中抽取348株;采用BACTEC MGIT 960系統(tǒng)在液體培養(yǎng)基pH值為 5.3、5.5、5.7、5.9和6.1時(shí),分別檢測結(jié)核分枝桿菌對吡嗪酰胺的敏感度;同時(shí)對吡嗪酰胺耐藥的結(jié)核分枝桿菌相關(guān)基因pncA和rpsA進(jìn)行測序,分析其突變特征;采用卡方檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)2種方法檢測吡嗪酰胺耐藥率的差別,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果 在348株結(jié)核分枝桿菌中,用MGITTM960 PZA試劑盒(pH值為5.9)檢測的吡嗪酰胺總耐藥率為14.4% (50/348),DNA測序結(jié)果有43株耐藥,其中有30(69.8%)株檢測到吡嗪酰胺藥物耐藥相關(guān)基因pncA發(fā)生突變, 1株(2.3%)耐藥分離株僅在rpsA有突變。在液體培養(yǎng)基pH值為6.1、5.9、5.7、5.5 和5.3時(shí),DNA測序結(jié)果與所有菌株表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果的一致率分別為94.8% (330/348)、95.1% (331/348)、 96.8% (337/348)、 95.2% (316/332) 和 93.5% (287/307)。并且pH值為5.7時(shí)2種方法的耐藥一致率(92.1%,35/38)明顯高于pH值為5.9(76.0%, 38/50)時(shí)(χ2=3.961,P=0.047);而pH值為6.1 (72.7%,40/55)、pH值為5.5(93.3%,28/30)和pH值為5.3(95.0%, 19/20)時(shí)的耐藥一致率與pH值為5.9時(shí)的耐藥一致率相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.147,P=0.702;χ2=0.366,P=0.545;χ2=3.410,P=0.065)。結(jié)論 液體培養(yǎng)基pH值為5.7時(shí),結(jié)核分枝桿菌對吡嗪酰胺耐藥與遺傳突變檢測結(jié)果有較好的相關(guān)性。

    分枝桿菌,結(jié)核; 吡嗪酰胺; 培養(yǎng)基, 條件性; DNA突變分析; 抗藥性; 判別分析

    結(jié)核病是全世界重要的公共衛(wèi)生問題之一。據(jù)WHO估計(jì),2015年全球約有104萬例新發(fā)結(jié)核病患者,140萬例死于結(jié)核病,中國的新發(fā)結(jié)核病患者例數(shù)僅次于印度和印度尼西亞而位居全球第三位[1]。吡嗪酰胺(PZA)是重要的一線抗結(jié)核藥物,可在酸性環(huán)境中殺死半休眠狀態(tài)的結(jié)核分枝桿菌,使化療療程從既往的9~12個(gè)月縮短至6個(gè)月[2]。在酸性環(huán)境中(pH=5.5),PZA能夠轉(zhuǎn)化為吡嗪酸(pyrozinoic acid,POA),發(fā)揮殺菌活性[3]。WHO 推薦采用BACTEC MGIT 960系統(tǒng)(簡稱“MGIT 960系統(tǒng)”)在酸性環(huán)境中(pH=5.9)檢測結(jié)核分枝桿菌對PZA的敏感度[4],但不同的pH值將影響吡嗪酰胺酶(pyrazanamidase, PZase)的活性,從而可能對結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生不同的抑制作用。此外,編碼吡嗪酰胺酶的基因pncA和編碼核糖體蛋白質(zhì)S1的基因rpsA突變也與結(jié)核分枝桿菌PZA耐藥有關(guān)[5]。因此,筆者采用MGIT 960系統(tǒng),檢測液體培養(yǎng)基不同pH值情況下結(jié)核分枝桿菌對PZA敏感度的影響,并與DNA測序表型藥物敏感性試驗(yàn)(簡稱“藥敏試驗(yàn)”)結(jié)果進(jìn)行比較,探討最適合進(jìn)行PZA藥敏試驗(yàn)的液體培養(yǎng)基pH值。

    材料和方法

    一、菌株來源

    本實(shí)驗(yàn)采用簡單隨機(jī)抽樣法中的直接抽選法,從3929株來自于2007年全國結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查的菌株中抽取348株,菌株由中國疾病預(yù)防控制中心國家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室提供。348株菌株經(jīng)對硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羧酸肼(TCH)菌種鑒定實(shí)驗(yàn)證實(shí)為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTBC)。

    二、試劑來源

    本實(shí)驗(yàn)所用改良羅氏培養(yǎng)基購于珠海貝索生物技術(shù)有限公司; MGITTM960 PZA試劑盒購于美國BD公司(貨號(hào)245128,批號(hào)4199861,效期2016年11月26日);2×Taq 預(yù)混液購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;所有引物均由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成。

    三、PZA藥敏試驗(yàn)

    采用WHO推薦的MGIT 960系統(tǒng)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。將結(jié)核分枝桿菌陽性培養(yǎng)物制備成1 mg/ml 菌懸液,稀釋至106菌落形成單位(CFU)/ml,取0.5 ml菌懸液加入進(jìn)行PZA藥敏試驗(yàn)專用的MGIT培養(yǎng)管中(藥物濃度100 μg/ml),將菌懸液1∶10稀釋后加入不含PZA的培養(yǎng)管中,作為生長對照管。采用結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv(ATCC 27249)作為質(zhì)控菌株。此外,用磷酸將液體培養(yǎng)基的pH值 (5.9)調(diào)節(jié)到5.3、5.5和5.7,用碳酸氫鈉將液體培養(yǎng)基pH值調(diào)到6.1。液體培養(yǎng)基的pH值用pH計(jì)進(jìn)行檢測。然后置于MGIT 960系統(tǒng)中,根據(jù)分枝桿菌生長情況比對自動(dòng)報(bào)告藥物敏感度結(jié)果。

    四、基因組DNA提取

    采用簡單水煮法提取MTB基因組DNA,使用接種環(huán)從改良羅氏培養(yǎng)基斜面刮取MTB菌落,將菌落轉(zhuǎn)移至含有1 ml生理鹽水的無菌Eppendorf 離心管中,85 ℃ 30 min滅活,12 000×g離心5 min,棄上清。菌體用500 μl TE (Tris-EDTA) 緩沖液(pH=8.0)充分懸浮,100 ℃沸水浴30 min,12 000×g離心5 min,將上清轉(zhuǎn)移至無菌離心管中用于基因擴(kuò)增模板。

    五、基因擴(kuò)增和測序

    擴(kuò)增對PZA耐藥的相關(guān)基因pncA和rpsA, 引物序列分別為F1,5′-TGCCACTCGCCGGTAACCGG-3;F2,5′-GGTGGCCGCCGCTCAGCTGG-3′,用于擴(kuò)增pncA全基因;F3,5′-GGCCGCAGCTG-GGACGCGGC-3′; F4, 5′-CGGTCCAGCGCTCC-GTCTGC-3′,用于擴(kuò)增rpsA全基因。擴(kuò)增體系如下:2×Taq 預(yù)混液25 μl, 上游引物0.2 μmol, 下游引物0.2 μmol,基因組DNA 5 μl,使用雙蒸水(ddH2O)補(bǔ)平到總體積50 μl。PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性94 ℃ 5 min; 94 ℃ 1 min, 58 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min, 35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min?;驍U(kuò)增產(chǎn)物送北京擎科生物技術(shù)有限公司測序。測序結(jié)果采用BioEdit 軟件與標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv基因序列進(jìn)行比對。

    六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用SPSS 11.5 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,藥物敏感性結(jié)果與測序結(jié)果一致率之間的比較采用χ2檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    一、pncA和rpsA突變結(jié)果分析

    348株MTBC中,220株(63.2%)為敏感株,128株(36.8%)為耐藥菌株,其中MDR 33株,XDR 2株(表1)。MGITTM960 PZA試劑盒(pH=5.9)檢測的50株P(guān)ZA耐藥株中,測序結(jié)果有43株耐藥,其中30株pncA發(fā)生突變,突變率達(dá)69.8%(30/43)。其中23株(76.7%)為氨基酸替換突變,6株(20.0%)為堿基插入或缺失引起的氨基酸移碼突變,1株(1/30)在啟動(dòng)子區(qū)-11位堿基發(fā)生A→C突變。除了pncA基因外,1株(2.3%)PZA耐藥分離株僅在rpsA有突變。此外,1株P(guān)ZA敏感株分別在pncA的40位密碼子和rpsA的497位密碼子檢測出突變(表2)。

    表1 不同耐藥類型在348株結(jié)核分枝桿菌分離菌株中的分布及耐藥率

    注 H:異煙肼;R:利福平;E:乙胺丁醇;S:鏈霉素;Ofx:氧氟沙星;Km:卡那霉素;MDR:耐多藥;XDR:廣泛耐藥

    二、不同pH值液體培養(yǎng)基的藥敏試驗(yàn)結(jié)果比較

    在液體培養(yǎng)基的pH值為5.5和5.3時(shí),分別有16株(4.6%)和41株(11.8%)在對照管中沒有生長。在液體培養(yǎng)基的pH值為6.1、5.9、5.7、5.5 和5.3時(shí),PZA表型耐藥分離株分別占有藥敏試驗(yàn)結(jié)果菌株的15.8% (55/348)、14.4% (50/348)、10.9% (38/348)、9.0%(30/332)和6.5%(20/307)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明,表型耐藥與基因型耐藥的一致率在培養(yǎng)基的pH值為 5.9時(shí)和pH值為6.1時(shí)分別為76.0% (38/50)、72.7% (40/55),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)

    表2 對PZA耐藥結(jié)核分枝桿菌的pncA和rpsA基因突變情況

    注a:啟動(dòng)子區(qū)無氨基酸變化

    意義(χ2=0.147,P=0.702)。在培養(yǎng)基的pH值為 5.7時(shí),表型耐藥與基因型耐藥藥敏試驗(yàn)結(jié)果的一致率明顯高于pH值為 5.9時(shí),耐藥一致率分別為92.1% (35/38)、76.0%(38/50),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.961,P=0.047)。同樣,pH 值為5.5時(shí)的耐藥一致率(93.3%)明顯高于pH值為 5.9時(shí),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.902,P=0.048)。與DNA測序結(jié)果相比,表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果的一致率在pH值為6.1、5.9、5.7、5.5 和5.3時(shí)分別為94.8%(330/348)、95.1%(331/348)、 96.8%(337/348)、 95.2%(316/332) 和 93.5%(287/307),并且在pH值為5.9時(shí)的一致率明顯低于pH值為5.7時(shí),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.441,P=0.020)(表3)。

    表3 對PZA進(jìn)行表型藥敏試驗(yàn)的結(jié)果與pncA或rpsA基因突變測序結(jié)果的一致率

    注 一致率以表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)

    討 論

    PZA可以殺死半休眠狀態(tài)的結(jié)核分枝桿菌,是結(jié)核病短程化療方案的重要組成藥物。研究發(fā)現(xiàn),PZA只有在體外酸性環(huán)境中或巨噬細(xì)胞中才能發(fā)揮抗結(jié)核分枝桿菌作用,它進(jìn)入體內(nèi)后,通過吡嗪酰胺酶轉(zhuǎn)化為吡嗪酸實(shí)現(xiàn)殺菌作用。然而由于PZA體外實(shí)驗(yàn)對培養(yǎng)條件的特殊要求,改良羅氏培養(yǎng)法尚不能檢測PZA耐藥性[6]。MGIT 960系統(tǒng)是WHO推薦的液體藥敏試驗(yàn)檢測系統(tǒng),在液體培養(yǎng)基pH值為5.9時(shí)可用于對PZA的體外敏感度檢測,但該酸度并不能使吡嗪酰胺酶的活性發(fā)揮最大,超過10%的分枝桿菌在pH值為5.5時(shí)不能生長,而此時(shí)PZA在體外的活性最大[7-8]。因此,尋找適合細(xì)菌生長和酶活性的pH值至關(guān)重要。筆者研究發(fā)現(xiàn)液體培養(yǎng)基酸度越大,對PZA耐藥的比例越低。說明低pH值更有利于吡嗪酰胺酶發(fā)揮活性,將PZA轉(zhuǎn)化為吡嗪酸,從而抑制結(jié)核分枝桿菌生長。研究表明,部分菌株、尤其是PZA耐藥菌株在pH值低于5.5的酸性環(huán)境中不能生長[9]。與之前研究類似[9-10],筆者發(fā)現(xiàn)在pH值為5.3時(shí),11.8%的結(jié)核分枝桿菌不能生長;而pH高于5.7時(shí),結(jié)核分枝桿菌的生長并未受到抑制,表明該pH值是結(jié)核分枝桿菌存活的上限。

    結(jié)核分枝桿菌編碼吡嗪酰胺酶的pncA基因發(fā)生突變,導(dǎo)致該酶活性下降,是結(jié)核分枝桿菌對PZA耐藥的主要原因[11]。Chang等[12]分析表明,平均87%的對PZA耐藥的菌株中pncA基因發(fā)生突變。而本研究中只有69.8%的對PZA耐藥的菌株出現(xiàn)pncA突變,與國外報(bào)道的69%~98.8%突變率相似[13-15]。這種不同可能是由于MGIT960系統(tǒng)本身造成的假陽性結(jié)果,包括培養(yǎng)基的pH值、抗生素濃度和接種量[16]。當(dāng)培養(yǎng)基的pH值調(diào)到5.7時(shí),MGIT 960系統(tǒng)檢測的結(jié)核分枝桿菌對PZA的耐藥與基因測序有較好的相關(guān)性。由于pH值為 5.9時(shí),MGIT 960檢測系統(tǒng)可能產(chǎn)生較多的假陽性PZA耐藥株,因此將培養(yǎng)基的pH值降到理想的水平是至關(guān)重要的。

    綜上所述,遺傳突變與液體培養(yǎng)基pH 值為5.7時(shí)的PZA耐藥有較好的相關(guān)性。在對PZA進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)中,液體培養(yǎng)基pH 值為5.7或許是調(diào)節(jié)吡嗪酰胺酶活性和結(jié)核分枝桿菌生長的理想閾值。

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    (本文編輯:范永德)

    The effect of pH on the pyrazinamide susceptibility ofMycobacteriumtuberculosis

    ZHENGHui-wen*,PANGYu,ZHAOYan-lin.

    *NationalInstituteforCommunicableDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China

    ZHAOYan-lin,Email:zhaoyanlin@chinatb.org

    Objective To evaluate the effect of pH on the pyrazinamide (PZA) susceptibility ofMycobac-teriumtuberculosisstrains in the BACTEC MGIT 960 liquid medium, to demonstrate the relationship between phenotype susceptibility and genetic changes amongM.tuberculosisisolates, and to determine the most suitable pH value for evaluating pyrazinamide susceptibility. Methods A total of 348 isolates were randomly selected from those collected during the national drug resistance baseline survey conducted in 2007, and the PZA susceptibility of eachM.tuberculosisisolate was detected using the BACTEC MGIT 960 automated system at pH 5.3, 5.5, 5.7, 5.9 and 6.1. ThepncAandrpsAgenes from all isolates were sequenced for genetic mutations conferring PZA resistance. The concordance rate between phenotypic DST in different pH environments and genetic changes was evaluated using the Chi-square test,P<0.05 being considered statistically significant. Results Of the 348M.tuberculosisisolates, 50 (14.4%) isolates resistant to PZA were detected using a commercial BACTEC MGIT 960 PZA kit at pH 5.9, and 43 using DNA sequencing, 30 (69.8%) isolates harboringpncAmutations, and 1 (2.3%) isolate harboring mutations only inrpsA. The overall concordance rate between DNA sequencing and phenotypic DST results at different pH values was 94.8% (330/348), 95.1% (331/348), 96.8% (337/348), 95.2% (316/332) and 93.5% (287/307) at pH 6.1, pH 5.9, pH 5.7, pH 5.5 and pH 5.3, respectively. The difference between the pH 5.9 and pH 5.7 groups was statistically significant (χ2=3.961,P=0.047), but that between the pH 6.1, pH 5.5, pH 5.3 and pH 5.9 groups (χ2=0.147,P=0.702;χ2=0.366,P=0.545;χ2=3.410,P=0.065, respectively) was not statistically significant. Conclusion The strongest correlation between genetic changes inM.tuberculosisisolates and PZA resistance was obtained using liquid culture at pH 5.7. Using a pH 5.7 liquid medium may be the best approach to resolve the dilemma between PZase activity and mycobacterial growth during PZA susceptibility testing.

    Mycobacteriumtuberculosis; Pyrazinamide; Culture media, conditioned; DNA mutational analysis; Drug resistance; Discriminant analysis

    10.3969/j.issn.1000-6621.2017.02.009

    “十二五”國家科技重大專項(xiàng)(2014ZX100030002)

    102206 北京,中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所(鄭惠文),結(jié)核病預(yù)防控制中心(逄宇、趙雁林)

    趙雁林,Email:zhaoyanlin@chinatb.org

    2016-11-21)

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