• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    浙江省12個(gè)區(qū)(縣)分枝桿菌菌種鑒定及耐藥相關(guān)基因特征分析

    2017-03-16 05:52:15徐凱進(jìn)嵇仲康胡海洋畢晟胡飛樞鄭琳金秀媛徐文杰王淑婷楊美芳邵俊丹李鵬程黃艷芳盛吉芳李蘭娟
    中國(guó)防癆雜志 2017年2期
    關(guān)鍵詞:個(gè)區(qū)菌種結(jié)核病

    徐凱進(jìn) 嵇仲康 胡海洋 畢晟 胡飛樞 鄭琳 金秀媛 徐文杰 王淑婷 楊美芳 邵俊丹 李鵬程 黃艷芳 盛吉芳 李蘭娟

    ·論著·

    浙江省12個(gè)區(qū)(縣)分枝桿菌菌種鑒定及耐藥相關(guān)基因特征分析

    徐凱進(jìn) 嵇仲康 胡海洋 畢晟 胡飛樞 鄭琳 金秀媛 徐文杰 王淑婷 楊美芳 邵俊丹 李鵬程 黃艷芳 盛吉芳 李蘭娟

    目的 了解浙江省12個(gè)區(qū)(縣)分枝桿菌菌種流行情況及結(jié)核分枝桿菌的INH、RFP耐藥相關(guān)基因特征。方法 收集2012年1月至2016年6月浙江省12個(gè)區(qū)(縣)初診為菌陽(yáng)肺結(jié)核患者的2803株臨床分離菌株標(biāo)本,運(yùn)用基因芯片技術(shù)進(jìn)行菌種鑒定和INH、RFP耐藥檢測(cè)。結(jié)果 2803份菌株中,NTM占7.3% (205株),前6位菌種為:胞內(nèi)分枝桿菌101株,堪薩斯分枝桿菌50株,龜-膿腫分枝桿菌24株,鳥分枝桿菌16株,偶然分枝桿菌4株,淺黃色分枝桿菌1株;2598株MTB中耐INH者占12.5% (326株),耐RFP 者占9.8% (254株),MDR 占6.7% (173株)。425株MTB耐藥突變位點(diǎn)結(jié)果中,katG315位點(diǎn)占INH耐藥突變的81.1% (279/344),rpoB531位點(diǎn)占RFP耐藥突變的56.6% (155/274)。結(jié)論 通過(guò)涂片診斷肺結(jié)核患者中有13.5% (378/2803)為NTM和MDR感染,INH耐藥的主要突變位點(diǎn)是katG315,RFP耐藥的主要突變位點(diǎn)是rpoB531,在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)積極推行分枝桿菌菌種鑒定技術(shù)和耐藥檢測(cè)技術(shù)將有利于加快我國(guó)結(jié)核病疫情控制。

    分枝桿菌, 結(jié)核; 分枝桿菌, 非典型性; 抗藥性, 多種, 細(xì)菌; 基因, MDR; 點(diǎn)突變; 數(shù)據(jù)說(shuō)明, 統(tǒng)計(jì)

    非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria, NTM)是泛指結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex, MTBC)和麻風(fēng)分枝桿菌(Mycobacteriumleprae)以外的分枝桿菌[1-2],抗酸染色呈陽(yáng)性是兩者的共同特征。MTB和 NTM均可引起肺部感染,出現(xiàn)的癥狀和肺部影像學(xué)表現(xiàn)非常相似, 臨床上很難鑒別。與許多發(fā)展中國(guó)家一樣,在中國(guó)痰涂片找抗酸桿菌仍然是許多基層衛(wèi)生機(jī)構(gòu)診斷肺結(jié)核的唯一細(xì)菌學(xué)依據(jù),缺乏MTB培養(yǎng)、菌種鑒定、耐藥檢測(cè)能力。在此狀況下,NTM、耐多藥(multiple drug resistance, MDR) MTB感染均被診斷為肺結(jié)核,并接受國(guó)家推行的標(biāo)準(zhǔn)抗結(jié)核藥物化療方案治療(2H-R-Z-E/4H-R或2H2-R2-Z2-E2/4H2-R2),誤診誤治的結(jié)果導(dǎo)致病情遷移不愈,患者傳染性持續(xù)存在,對(duì)患者與社會(huì)均造成了傷害。

    掌握被基層醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)初診為“肺結(jié)核”的患者中,MDR與NTM感染所占比例,了解NTM的流行情況和INH與RFP相關(guān)耐藥突變基因特征,對(duì)中國(guó)結(jié)核病防控策略的完善與修訂具有現(xiàn)實(shí)意義,對(duì)其他國(guó)家的結(jié)核病防控也有一定的借鑒價(jià)值。筆者對(duì)浙江省12個(gè)縣(市)初診為菌陽(yáng)肺結(jié)核患者的2803份臨床分離菌株標(biāo)本,運(yùn)用基因芯片技術(shù)進(jìn)行菌種鑒定和INH、RFP耐藥檢測(cè),現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

    資料和方法

    一、研究對(duì)象

    2012年1月至2016年6月,浙江省12個(gè)區(qū)(縣)共完成18 722例結(jié)核病疑似患者痰液培養(yǎng),每份痰標(biāo)本分別接種于2支羅氏固體培養(yǎng)基(L?wenstein-Jensen medium,L-J medium ),其中有2803份痰標(biāo)本培養(yǎng)陽(yáng)性并經(jīng)過(guò)萋-尼染色法(Ziehl-Neelsen stain)證實(shí)為抗酸桿菌(acid-fast bacilli)。

    二、 實(shí)驗(yàn)方法

    1. 菌株來(lái)源地情況:浙江省位于中國(guó)東南沿海長(zhǎng)江三角洲南翼,地勢(shì)由西南向東北傾斜,可分為平原、丘陵、盆地、山地、沿海平原及島嶼等地形。選擇浙江省12個(gè)區(qū)(縣),分別為浙江省紹興市柯橋區(qū)(原紹興縣)、桐鄉(xiāng)市、舟山市普陀區(qū)、舟山市臨城新區(qū)、桐廬縣、湖州市吳興區(qū)、湖州市南潯區(qū)、德清縣、安吉縣、三門縣、玉環(huán)縣和仙居縣。上述區(qū)(縣)涵蓋了各種流行病學(xué)特征,不同流行學(xué)水平,高中低經(jīng)濟(jì)發(fā)展程度,山區(qū)、平原、海島不同地形。12個(gè)區(qū)(縣)覆蓋人口582.16萬(wàn)名(2010年數(shù)據(jù)),分別為紹興柯橋區(qū)72.70萬(wàn)名,桐鄉(xiāng)市67.4萬(wàn)名,舟山市普陀32.13萬(wàn)名,舟山定海區(qū)臨城新區(qū)37.59萬(wàn)名,桐廬縣40.25萬(wàn)名,湖州市吳興區(qū)59.85萬(wàn)名,湖州市南潯區(qū)49.06萬(wàn)名,德清縣43萬(wàn)名,安吉縣45.77萬(wàn)名,三門縣42.92萬(wàn)名,玉環(huán)縣41.96萬(wàn)名,仙居縣49.53萬(wàn)名[3]。2012年,在以上區(qū)(縣)實(shí)行結(jié)核病疑似患者[咳嗽、咯痰≥2周,和(或)胸部X線檢查有可疑結(jié)核病灶]分枝桿菌培養(yǎng),并收集所有培養(yǎng)陽(yáng)性的菌株,利用基因芯片技術(shù)進(jìn)行INH、RFP耐藥突變檢測(cè)和分枝桿菌菌種鑒定,分析MDR與NTM感染的現(xiàn)況。

    2. 分枝桿菌菌種鑒定:采用北京博奧生物(CapitalBio)生產(chǎn)的分枝桿菌菌種鑒定試劑盒(mycobacteria identification array kit)進(jìn)行鑒定,該方法包含了17種分枝桿菌特異性的16s RNA探針(結(jié)核分枝桿菌、鳥分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、不產(chǎn)色分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、金色分枝桿菌、土分枝桿菌、戈登分枝桿菌、草分枝桿菌、龜-膿腫分枝桿菌、淺黃色分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、偶然分枝桿菌、蘇爾加分枝桿菌、海-潰瘍分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌),能明確待檢菌株是否為MTB和NTM,如果是NTM可進(jìn)一步鑒定是否為前述的16種NTM之一[4-6]。實(shí)驗(yàn)步驟簡(jiǎn)述如下:用接種環(huán)從羅氏培養(yǎng)基收集菌株,加入核酸提取液,使用Extractor 36核酸快速提取儀振蕩5 min,95 ℃水浴5 min,2348×g離心1 min,取上清液作為模板進(jìn)行PCR,獲得熒光標(biāo)記的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,將PCR產(chǎn)物95 ℃裂解10 min,獲得的單鏈DNA置于冰水混合物中,與雜交緩沖液按比例混合,用微量移液器吹吸2次混勻,經(jīng)蓋片的加樣孔加入雜交反應(yīng)混合物,迅速蓋上雜交盒并密封后放入雜交儀中,計(jì)時(shí)120 min。雜交反應(yīng)結(jié)束后,將雜交盒水平取出拆開(kāi),將芯片取出,用晶芯?SlideWasherTM8芯片洗干儀自動(dòng)洗滌除去非特異性雜交的背景染色。然后于離心機(jī)中60×g離心5 min,甩干后掃描。使用LuxScan 10K-B微陣列芯片掃描儀和相應(yīng)軟件進(jìn)行信號(hào)的讀取及結(jié)果判讀。

    3. MTB的耐藥鑒定:采用北京博奧生物生產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測(cè)試劑盒,該方法包含的RFP相關(guān)耐藥突變檢測(cè)位點(diǎn)有rpoB基因的 C531G、C531T、CG531AC、A526C、A526G、A526T、C526A、C526G、C526T、T533C、A516G、A516T、G516T、T511C、T511G、C513A、A513T、C522T;包含的INH相關(guān)耐藥檢測(cè)突變位點(diǎn)有katG基因的 G315A、G315C、G315T、C315及inhA基因的啟動(dòng)子區(qū)(-15)C-T突變型[7]。實(shí)驗(yàn)步驟同菌種鑒定。

    三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    利用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析。

    結(jié) 果

    1.分枝桿菌菌種鑒定結(jié)果:2803份菌株中,MTB有2598株,占92.7%。NTM有205株,占7.3%;前6位菌種:胞內(nèi)分枝桿菌101株,堪薩斯分枝桿菌50株,龜-膿腫分枝桿菌24株,鳥分枝桿菌16株,偶然分枝桿菌4株,淺黃色分枝桿菌1株?;蛐酒瑱z測(cè)結(jié)果提示9株為NTM,但未能分型確定具體的菌種,結(jié)果見(jiàn)表1。

    表1 2803株分枝桿菌的菌種鑒定情況

    注a:為該菌種在所有NTM中所占比例

    2. 耐藥菌株鑒定:2598株MTB中,對(duì)INH、RFP均敏感者有2173株,占83.6%;MDR菌株有173株,占6.7%;單耐INH者有171株,單耐RFP者有81株(表2)。

    對(duì)MTB耐藥突變位點(diǎn)檢測(cè)的結(jié)果提示,katG315是INH耐藥的主要突變位點(diǎn),與其相關(guān)的INH耐藥突變占81.1%(279/344);rpoB531是RFP耐藥的主要突變位點(diǎn),與其相關(guān)的RFP耐藥突變占61.0%(155/254)。254株耐RFP菌株的rpoB基

    表2 2598株MTB對(duì)INH和RFP是否耐藥的檢測(cè)結(jié)果

    因突變位點(diǎn)中,均為點(diǎn)突變,未見(jiàn)插入突變或缺失型突變;單位點(diǎn)突變 234例(92.1%),雙位點(diǎn)突變 20 例(7.9% );常見(jiàn)突變位點(diǎn)為rpoB531者占61.0%(155/254)、rpoB526者占14.2%(36/254)、rpoB516者占13.4%(34/254)、rpoB511者占12.6%(32/254)、rpoB533者占5.1%(13/254)、rpoB513者占1.6%(4/254);MTB耐藥突變位點(diǎn)的分布情況見(jiàn)表3、4。

    表3 254株耐RFP菌株的rpoB基因突變位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果

    表4 344例耐INH菌株基因突變位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果

    討 論

    浙江省12個(gè)區(qū)(縣)收集到的2803份菌株中分離到NTM、MDR共378株,占總菌株的13.5%;這些菌株的感染者如按照經(jīng)驗(yàn)性使用國(guó)家推薦的標(biāo)準(zhǔn)方案(2H-R-Z-E/4H-R或2H2-R2-Z2-E2/4H2-R2)治療,效果是無(wú)效或是效果不佳的[8]。如果能在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)及疾病預(yù)防控制中心采取分枝桿菌菌種鑒定,在診斷初期及時(shí)甄別NTM與MTB感染,可提高結(jié)核病診斷的正確性,及時(shí)獲得MDR感染信息并給予合理的治療;如此就有希望提高結(jié)核病患者的治愈率,對(duì)控制結(jié)核病疫情將有很好的促進(jìn)作用。

    浙江省的狀況在一定程度上反映了中國(guó)現(xiàn)階段結(jié)核病防控方面存在的問(wèn)題。縣級(jí)醫(yī)療機(jī)構(gòu)是中國(guó)結(jié)核病診治工作的主要承擔(dān)者,但目前有大部分的縣級(jí)醫(yī)療機(jī)構(gòu)不具備對(duì)MTB進(jìn)行分離培養(yǎng)的能力,更無(wú)法進(jìn)行MTB耐藥檢測(cè)與分枝桿菌菌種鑒定;由這些機(jī)構(gòu)診斷的肺結(jié)核患者中可能有一部分患者是NTM或MDR感染,在治的化療方案是不合理的[9]。中國(guó)是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家,為加快結(jié)核病疫情的控制,中國(guó)有必要在所有承擔(dān)結(jié)核病診治任務(wù)的基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)規(guī)劃推行分枝桿菌菌種鑒定技術(shù)和耐藥檢測(cè)技術(shù)。

    本研究顯示,擬診為肺結(jié)核的菌陽(yáng)患者中,大約有7.3%的患者實(shí)際是NTM感染,我們應(yīng)該高度重視NTM在結(jié)核病控制中的混雜干擾作用,避免誤診誤治,減少醫(yī)療浪費(fèi),減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。在浙江省,胞內(nèi)分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、龜-膿腫分枝桿菌是最常見(jiàn)的NTM流行菌種,與前期報(bào)道基本一致[10]。類似韓國(guó)、日本、臺(tái)灣[11-13],關(guān)于這些NTM感染患者的治療與預(yù)防知識(shí)對(duì)于大部分臨床醫(yī)生還是很陌生的,加強(qiáng)知識(shí)的普及也是疾病防控工作中的重要環(huán)節(jié)[14]。

    在MTB耐藥突變位點(diǎn)資料中,所有菌株中存在耐INH位點(diǎn)突變的菌株占12.5%,其中單耐INH的菌株為6.6%;所有菌株中存在耐RFP位點(diǎn)突變的菌種占9.8%,其中單耐RFP的菌株為3.1%;可見(jiàn)RFP耐藥位點(diǎn)突變后進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為MDR菌株的概率要高一些[15],這些信息對(duì)結(jié)核病臨床工作中進(jìn)行耐藥檢測(cè)靶點(diǎn)、耐藥預(yù)測(cè)的把握上有一定的參考價(jià)值。

    [1] El Helou G,Viola GM,Hachem R,et al. Rapidly growing mycobacterial bloodstream infections. Lancet Infect Dis,2013,13(2):166-174.

    [2] Menzies D,Nahid P. Update in tuberculosis and nontuberculous mycobacterial disease 2012. Am J Respir Crit Care Med,2013,188(8):923-927.

    [3] 浙江省統(tǒng)計(jì)局,國(guó)家統(tǒng)計(jì)局浙江調(diào)查總隊(duì).浙江省統(tǒng)計(jì)年鑒(2011).北京:中國(guó)統(tǒng)計(jì)出版社,2011.

    [4] Zhu L,Jiang G,Wang S,et al. Biochip system for rapid and accurate identification of mycobacterial species from isolates and sputum. J Clin Microbiol,2010,48(10):3654-3660.

    [5] Pang Y,Zhou Y,Wang S,et al. Rapid molecular identification of mycobacterial species in positive culture isolates using the biochip test. Int J Tuberc Lung Dis,2011,15(12):1680-1685.

    [6] Liu J,Yue J,Yan Z,et al. Performance assessment of the CapitalBio mycobacterium identification array system for identification of mycobacteria. J Clin Microbiol,2012,50(1):76-80.

    [7] Guo Y,Zhou Y,Wang C,et al. Rapid and accurate determination of MDR inM.tuberculosisisolates and clinical sputum using a biochip system. Int J Tuberc Lung Dis,2009,13(7):914-920.

    [8] Zhao Y, Xu S,Wang L,et al.National survey of drug-resistant tuberculosis in China.N Engl J Med,2012,366(23):2161-2170.

    [9] 全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組,全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查辦公室. 2010年全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告. 中國(guó)防癆雜志,2012,34(8):485-508.

    [10] Xu K,Bi S,Ji Z,et al. Distinguishing nontuberculous mycobacteria from multidrugr resistantMycobacteriumtuberculosis,China. Emerg Infect Dis,2014,20(6):1060-1062.

    [11] Ryoo SW,Shin S,Shim MS,et al. Spread of nontuberculous mycobacteria from 1993 to 2006 in Koreans. J Clin Lab Anal,2008,22(6):415-420.

    [12] Tsukamura M,Kita N,Shimoide H,et al. Studies on the nontuberculous lung mycobacteriosis in Japan. Kekkaku,1988,63(7):493-499.

    [13] Chiang CY,Luh KT,Enarson DA,et al. Accuracy of classification of notified tuberculosis cases in Taiwan. Int J Tuberc Lung Dis,2007,11(8):876-881.

    [14] McGrath EE,McCabe J,Anderson PB. Guidelines on the diagnosis and treatment of pulmonary non-tuberculous mycobacteria infection. Int J Clin Pract,2008,62(12):1947-1955.

    [15] Zumla AI,Gillespie SH,Hoelscher M,et al. New antituberculosis drugs,regimens,and adjunct therapies: needs,advances,and future prospects. Lancet Infect Dis,2014,14(4):327-340.

    (本文編輯:范永德)

    Strain identification and analysis of drug resistance gene characteristics inM.tuberculosisstrains from 12 districts in Zhejiang Province

    XUKai-jin,JIZhong-kang,HUHai-yang,BISheng,HUFei-shu,ZHENGLin,JINXiu-yuan,XUWen-jie,WANGShu-ting,YANGMei-fang,SHAOJun-dan,LIPeng-cheng,HUANGYan-fang,SHENGJi-fang,LILan-juan.

    StateKeyLaboratoryforDiagnosisandTreatmentofInfectiousDiseases,theFirstAffiliatedHospital,SchoolofMedicine,ZhejiangUniversity,CollaborativeInnovationCenterforDiagnosisandTreatmentofInfectiousDiseases,Hangzhou310003,China

    LILan-juan,Email:ljli@zju.edu.cn

    Objective To analyze the epidemiological characteristics of Mycobacterium strains and drug-resistance gene characteristics inMycobacteriumtuberculosisstrains from 12 counties in Zhejiang Province, China. Methods From January, 2012, to June, 2016, a total of 2803 sputum positive samples (positive staining that confirmed growth of acid-fast bacilli) were collected from patients newly diagnosed with TB in Zhejiang Province. Mycobacteria Identification Array Kits andM.tuberculosisDrug Resistance Detection Array Kits were used to further identify and characterize the strains in each sample. Results We identified 2598 of the 2803 strains (92.7%), asMycobacteriumtuberculosisand 205 strains (7.3%) as NTM. NTM strains were further identified as follows:Mycobacteriumintracellulare, 101 isolates;Mycobacteriumkansasii, 50 isolates; Turtle/Mycobacteriumabscessus, 24 isolates;Mycobacteriumavium, 16 isolates;Mycobacteriumfortuitum, 4 isolates;light yellowMycobacterium,1 isolate. Among the 2598M.tuberculosisstrains there were 326 (12.5%) INH-resistant strains, 254 (9.8%) RFP-resistant strains,and 173 (6.7%) MDR TB strains. Among the drug-resistant strains ofM.tuberculosis, 81.1% (279/344) of the INH-resistant mutations were related tokatG315, and 84 (60.0%) of 140 RFP-resistant mutations were associated withrpoB531. Conclusion Among the 2803 strains collected from patients in 12 counties of Zhejiang Province, 378 (13.5%) were designated as either MDR TB or NTM. In addition,katG315 was the main point mutation associated with INH resistance inM.tuberculosisstrains, andrpoB531 was the main point mutation for RFP resistance. Mycobacterium strain identification and drug-resistance testing are important in enhancing regulation and prevention of TB in basic medical institutions.

    Mycobacteriumtuberculosis; Mycobacteria, atypical; Drug resistance, multiple, bacterial; Genes, MDR; Point mutation; Data interpretation, statistics

    10.3969/j.issn.1000-6621.2017.02.010

    “十二五”國(guó)家科技重大專項(xiàng)(2013ZX10004-904;2014ZX10003002);浙江省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015KYA102)

    310003 杭州,浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 傳染病診治國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 感染性疾病診治協(xié)同創(chuàng)新中心

    李蘭娟,Email:ljli@zju.edu.cn

    2016-08-22)

    猜你喜歡
    個(gè)區(qū)菌種結(jié)核病
    世界防治結(jié)核病日
    警惕卷土重來(lái)的結(jié)核病
    螞蟻琥珀中發(fā)現(xiàn)新蘑菇菌種
    軍事文摘(2021年18期)2021-12-02 01:28:04
    算好結(jié)核病防治經(jīng)濟(jì)賬
    手外傷感染的菌種構(gòu)成及耐藥性分析
    食用菌液體菌種栽培技術(shù)的探討
    IL-17在結(jié)核病免疫應(yīng)答中的作用
    α-淀粉酶的基因改造與菌種選育研究進(jìn)展
    精品一区二区三区四区五区乱码 | 国产1区2区3区精品| 成年美女黄网站色视频大全免费| 中文欧美无线码| 亚洲精品国产一区二区精华液| 久久 成人 亚洲| 最近2019中文字幕mv第一页| 日韩精品免费视频一区二区三区| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 99热国产这里只有精品6| 久久久久人妻精品一区果冻| 亚洲熟女毛片儿| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 精品国产露脸久久av麻豆| 操出白浆在线播放| 精品一区二区三区av网在线观看 | 大陆偷拍与自拍| 日本午夜av视频| 两个人看的免费小视频| 久久久久久免费高清国产稀缺| 热99久久久久精品小说推荐| 欧美在线一区亚洲| 亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 韩国精品一区二区三区| 女人久久www免费人成看片| 制服诱惑二区| 丁香六月欧美| 嫩草影视91久久| 欧美激情极品国产一区二区三区| 精品国产一区二区久久| 亚洲国产最新在线播放| 国产精品久久久av美女十八| 男女下面插进去视频免费观看| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 美女大奶头黄色视频| 狂野欧美激情性xxxx| 精品国产国语对白av| www.自偷自拍.com| 亚洲人成77777在线视频| 欧美日韩福利视频一区二区| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲精品国产av蜜桃| 国产探花极品一区二区| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 日日爽夜夜爽网站| 乱人伦中国视频| 女性生殖器流出的白浆| 七月丁香在线播放| 国产老妇伦熟女老妇高清| 欧美av亚洲av综合av国产av | 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 男女无遮挡免费网站观看| 国产成人精品久久二区二区91 | 久久人人97超碰香蕉20202| 欧美激情极品国产一区二区三区| 操出白浆在线播放| 毛片一级片免费看久久久久| 91成人精品电影| 大陆偷拍与自拍| e午夜精品久久久久久久| 久久精品国产综合久久久| 乱人伦中国视频| 色网站视频免费| 操美女的视频在线观看| 日本欧美国产在线视频| 成人午夜精彩视频在线观看| 青草久久国产| 一级爰片在线观看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 在线观看免费午夜福利视频| 亚洲综合精品二区| 赤兔流量卡办理| 1024视频免费在线观看| 一区二区三区四区激情视频| av在线老鸭窝| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 一级毛片我不卡| 丝袜喷水一区| 亚洲av欧美aⅴ国产| 午夜久久久在线观看| 日韩 亚洲 欧美在线| 热99久久久久精品小说推荐| av福利片在线| 中文字幕高清在线视频| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 波多野结衣一区麻豆| 啦啦啦在线免费观看视频4| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产在线免费精品| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 久久国产精品男人的天堂亚洲| 尾随美女入室| 成人黄色视频免费在线看| 性少妇av在线| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产xxxxx性猛交| 中文天堂在线官网| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 国产一区二区三区综合在线观看| 在线观看免费午夜福利视频| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 日韩一区二区视频免费看| 午夜日本视频在线| 国产1区2区3区精品| 97在线人人人人妻| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 秋霞在线观看毛片| 欧美黑人欧美精品刺激| 少妇人妻久久综合中文| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲中文av在线| 色婷婷av一区二区三区视频| 亚洲国产精品成人久久小说| 日本黄色日本黄色录像| 极品人妻少妇av视频| 超碰成人久久| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 精品国产一区二区久久| 曰老女人黄片| 大香蕉久久网| 国产男人的电影天堂91| 国产一级毛片在线| 亚洲中文av在线| 十分钟在线观看高清视频www| 老司机影院成人| 久久久欧美国产精品| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 最近中文字幕2019免费版| 中文字幕色久视频| 亚洲成人一二三区av| 国产精品.久久久| 女人精品久久久久毛片| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 亚洲美女视频黄频| 9热在线视频观看99| 久久亚洲国产成人精品v| 中文字幕人妻熟女乱码| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 久久久欧美国产精品| 国产 一区精品| 中文字幕高清在线视频| 秋霞伦理黄片| 日韩伦理黄色片| 最近手机中文字幕大全| 国产成人一区二区在线| 大码成人一级视频| 亚洲精品国产区一区二| 久久人妻熟女aⅴ| 黄色怎么调成土黄色| 国产麻豆69| 亚洲国产精品一区三区| 国产亚洲一区二区精品| 男女无遮挡免费网站观看| 久久国产精品大桥未久av| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 久久精品国产综合久久久| 乱人伦中国视频| 欧美激情极品国产一区二区三区| 只有这里有精品99| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 亚洲熟女毛片儿| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲一区中文字幕在线| 精品人妻一区二区三区麻豆| a级片在线免费高清观看视频| 男女免费视频国产| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 国产日韩欧美视频二区| 亚洲伊人色综图| 久久久久久久久久久免费av| 成人国语在线视频| 无限看片的www在线观看| 欧美日韩亚洲高清精品| 搡老岳熟女国产| 高清黄色对白视频在线免费看| 国产激情久久老熟女| 欧美精品亚洲一区二区| 青春草视频在线免费观看| 在线看a的网站| 一级毛片电影观看| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| av有码第一页| 亚洲成国产人片在线观看| 水蜜桃什么品种好| 国产不卡av网站在线观看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国产免费福利视频在线观看| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产成人a∨麻豆精品| 激情视频va一区二区三区| 亚洲男人天堂网一区| 亚洲人成电影观看| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 成年女人毛片免费观看观看9 | 久久久精品94久久精品| 亚洲国产精品国产精品| 国产成人精品久久二区二区91 | 婷婷色av中文字幕| 成年人免费黄色播放视频| 成人手机av| 一本久久精品| 黄色一级大片看看| 欧美精品av麻豆av| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产黄频视频在线观看| 老司机亚洲免费影院| 人妻一区二区av| 免费不卡黄色视频| 久久久精品区二区三区| 国产av精品麻豆| 国产片内射在线| www.自偷自拍.com| 日本av免费视频播放| 不卡av一区二区三区| 欧美黄色片欧美黄色片| 国产一区亚洲一区在线观看| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 波野结衣二区三区在线| 校园人妻丝袜中文字幕| 欧美变态另类bdsm刘玥| 一本色道久久久久久精品综合| 另类精品久久| 1024视频免费在线观看| 色婷婷久久久亚洲欧美| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 中国国产av一级| 无遮挡黄片免费观看| av在线观看视频网站免费| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 亚洲第一青青草原| 成人三级做爰电影| 新久久久久国产一级毛片| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 精品久久久精品久久久| 久久久久精品人妻al黑| 久久影院123| videos熟女内射| 超色免费av| 老司机深夜福利视频在线观看 | a级片在线免费高清观看视频| e午夜精品久久久久久久| 热re99久久精品国产66热6| 高清黄色对白视频在线免费看| 一二三四中文在线观看免费高清| 久久亚洲国产成人精品v| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 在线看a的网站| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 日韩一区二区视频免费看| 精品一区二区免费观看| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 中文欧美无线码| 成年人午夜在线观看视频| 大香蕉久久网| 校园人妻丝袜中文字幕| a级片在线免费高清观看视频| 狂野欧美激情性xxxx| 亚洲国产成人一精品久久久| 欧美日韩视频精品一区| 午夜激情av网站| 最近中文字幕2019免费版| 天美传媒精品一区二区| 久久av网站| 啦啦啦在线观看免费高清www| 中文字幕制服av| 老鸭窝网址在线观看| 一区二区三区乱码不卡18| 国产一区二区三区综合在线观看| 久久久久久久久免费视频了| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 精品一区在线观看国产| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 亚洲av男天堂| 亚洲图色成人| 又大又黄又爽视频免费| 婷婷成人精品国产| 免费高清在线观看视频在线观看| 少妇 在线观看| 51午夜福利影视在线观看| 精品少妇内射三级| 亚洲中文av在线| 精品第一国产精品| 国产午夜精品一二区理论片| 日韩av免费高清视频| 亚洲精品一区蜜桃| 人人妻人人澡人人看| 亚洲精品在线美女| av在线观看视频网站免费| 男人爽女人下面视频在线观看| 夫妻性生交免费视频一级片| 高清不卡的av网站| 91精品三级在线观看| 久久ye,这里只有精品| 精品国产一区二区三区四区第35| 中文字幕色久视频| 新久久久久国产一级毛片| 看非洲黑人一级黄片| 麻豆乱淫一区二区| 国产精品国产三级专区第一集| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产成人精品无人区| 一本久久精品| 久久鲁丝午夜福利片| 十分钟在线观看高清视频www| 九色亚洲精品在线播放| 男女床上黄色一级片免费看| 成人影院久久| 国产成人午夜福利电影在线观看| 欧美中文综合在线视频| 久热这里只有精品99| xxx大片免费视频| 乱人伦中国视频| 日韩伦理黄色片| 亚洲精品中文字幕在线视频| 只有这里有精品99| 在线观看www视频免费| 视频在线观看一区二区三区| 一二三四在线观看免费中文在| 亚洲av日韩在线播放| 9191精品国产免费久久| 久久久国产精品麻豆| 久久精品久久精品一区二区三区| 成年人免费黄色播放视频| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 亚洲欧洲日产国产| av视频免费观看在线观看| 亚洲av福利一区| 波多野结衣av一区二区av| 99久久精品国产亚洲精品| 男人舔女人的私密视频| 波多野结衣一区麻豆| 久久精品久久久久久久性| 国产极品天堂在线| 韩国av在线不卡| 交换朋友夫妻互换小说| 欧美精品亚洲一区二区| 这个男人来自地球电影免费观看 | 99精品久久久久人妻精品| 免费看av在线观看网站| 国产熟女午夜一区二区三区| 晚上一个人看的免费电影| 日本色播在线视频| 飞空精品影院首页| bbb黄色大片| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产精品一国产av| 国产成人欧美| 国产精品成人在线| 久久精品久久久久久久性| 久久99精品国语久久久| 亚洲精品国产区一区二| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 久久久久国产精品人妻一区二区| 色精品久久人妻99蜜桃| 一级a爱视频在线免费观看| av.在线天堂| 人妻人人澡人人爽人人| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 成年人午夜在线观看视频| 亚洲一码二码三码区别大吗| av女优亚洲男人天堂| 国产福利在线免费观看视频| 曰老女人黄片| 这个男人来自地球电影免费观看 | 午夜老司机福利片| 男女午夜视频在线观看| 亚洲精品乱久久久久久| 欧美精品高潮呻吟av久久| 日韩中文字幕视频在线看片| 欧美97在线视频| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 国产精品蜜桃在线观看| 欧美日韩福利视频一区二区| 亚洲av在线观看美女高潮| 久久这里只有精品19| av线在线观看网站| 性少妇av在线| 在线观看人妻少妇| 爱豆传媒免费全集在线观看| 成年动漫av网址| 高清av免费在线| 欧美黑人精品巨大| 欧美精品av麻豆av| 国产伦理片在线播放av一区| 国产99久久九九免费精品| 岛国毛片在线播放| 91精品伊人久久大香线蕉| 亚洲av电影在线进入| 亚洲成人手机| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 一本大道久久a久久精品| 久久精品国产亚洲av高清一级| 国产片特级美女逼逼视频| 欧美精品一区二区大全| 国产日韩欧美视频二区| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 欧美亚洲日本最大视频资源| 午夜老司机福利片| 欧美精品高潮呻吟av久久| 午夜激情久久久久久久| 亚洲欧美成人精品一区二区| 亚洲色图综合在线观看| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 亚洲精品国产av成人精品| 男女免费视频国产| 在线免费观看不下载黄p国产| 亚洲av中文av极速乱| 久久久精品区二区三区| 人人妻人人澡人人看| 国产日韩欧美亚洲二区| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 黄色毛片三级朝国网站| 免费观看av网站的网址| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 老鸭窝网址在线观看| 欧美成人午夜精品| 在线观看免费午夜福利视频| 在线观看人妻少妇| 国产精品欧美亚洲77777| 亚洲第一青青草原| 卡戴珊不雅视频在线播放| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 不卡av一区二区三区| 伊人亚洲综合成人网| 亚洲三区欧美一区| 欧美日韩福利视频一区二区| 午夜福利视频在线观看免费| 国产视频首页在线观看| 熟女av电影| xxxhd国产人妻xxx| 夫妻性生交免费视频一级片| 亚洲一区中文字幕在线| 国产黄频视频在线观看| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 大码成人一级视频| 久久毛片免费看一区二区三区| 综合色丁香网| 国产男女超爽视频在线观看| 五月天丁香电影| 最新的欧美精品一区二区| 国产精品蜜桃在线观看| 日韩大片免费观看网站| 国产精品国产av在线观看| 人人澡人人妻人| 久久久国产精品麻豆| 亚洲四区av| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 看非洲黑人一级黄片| 涩涩av久久男人的天堂| 男女国产视频网站| 国产成人精品福利久久| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 成年人免费黄色播放视频| 亚洲国产最新在线播放| 久久免费观看电影| 久久精品久久久久久久性| 午夜老司机福利片| avwww免费| 久久综合国产亚洲精品| 大陆偷拍与自拍| av女优亚洲男人天堂| 久久性视频一级片| 老熟女久久久| 多毛熟女@视频| 老汉色av国产亚洲站长工具| 一本大道久久a久久精品| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 纯流量卡能插随身wifi吗| 亚洲免费av在线视频| 成人午夜精彩视频在线观看| 中文字幕av电影在线播放| 中文字幕人妻丝袜制服| 99热全是精品| 国产一区二区在线观看av| 日韩精品免费视频一区二区三区| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国产高清不卡午夜福利| a 毛片基地| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 91成人精品电影| av一本久久久久| 伦理电影大哥的女人| 不卡av一区二区三区| 久久99精品国语久久久| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 亚洲精品国产色婷婷电影| 超碰97精品在线观看| 99精品久久久久人妻精品| av在线老鸭窝| 欧美精品av麻豆av| 女人久久www免费人成看片| 在现免费观看毛片| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 精品人妻一区二区三区麻豆| 国产视频首页在线观看| 亚洲av电影在线进入| 97人妻天天添夜夜摸| 99精品久久久久人妻精品| 国产日韩欧美在线精品| 黄色怎么调成土黄色| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 亚洲国产av影院在线观看| 国产淫语在线视频| 日本av手机在线免费观看| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 一边摸一边做爽爽视频免费| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 考比视频在线观看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 欧美精品一区二区大全| 亚洲精品国产av蜜桃| 国产亚洲欧美精品永久| 不卡视频在线观看欧美| 国产精品嫩草影院av在线观看| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 亚洲成人免费av在线播放| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 黑丝袜美女国产一区| 97人妻天天添夜夜摸| 99热国产这里只有精品6| 亚洲国产看品久久| 丁香六月欧美| 日韩人妻精品一区2区三区| 999久久久国产精品视频| 国产激情久久老熟女| 国产一区二区激情短视频 | 婷婷色综合www| 国产精品成人在线| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 亚洲成人av在线免费| 狂野欧美激情性bbbbbb| 成人国产麻豆网| 精品一品国产午夜福利视频| 丰满迷人的少妇在线观看| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 色婷婷久久久亚洲欧美| av福利片在线| 人妻 亚洲 视频| 日日爽夜夜爽网站| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 亚洲精品国产色婷婷电影| 色网站视频免费| 国产精品一二三区在线看| 亚洲国产av新网站| 蜜桃在线观看..| 亚洲欧美清纯卡通| 青草久久国产| 免费黄频网站在线观看国产| 久久久久久久精品精品| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 999久久久国产精品视频| 一级毛片电影观看| 99国产综合亚洲精品| 亚洲国产看品久久| 国产1区2区3区精品| av网站免费在线观看视频| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 一级毛片电影观看| 叶爱在线成人免费视频播放| 性色av一级| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 亚洲国产日韩一区二区| 国产精品免费视频内射| 国产成人免费观看mmmm| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 在线 av 中文字幕| 亚洲美女视频黄频| 蜜桃在线观看..| 国产精品久久久久成人av| 欧美日韩一级在线毛片| 午夜福利一区二区在线看| 99久久99久久久精品蜜桃| 一级片免费观看大全| 亚洲精品一区蜜桃| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 大话2 男鬼变身卡| www.自偷自拍.com| 两个人看的免费小视频| 男女下面插进去视频免费观看| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 成人漫画全彩无遮挡| 国产福利在线免费观看视频| 韩国精品一区二区三区| 9色porny在线观看| 天天操日日干夜夜撸| 晚上一个人看的免费电影| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 国产免费又黄又爽又色| 中国国产av一级| 亚洲成色77777| 国产精品免费视频内射| 操出白浆在线播放| 亚洲精品一二三| 在线 av 中文字幕| 亚洲伊人久久精品综合| 亚洲在久久综合| 久热爱精品视频在线9| 七月丁香在线播放| 欧美日本中文国产一区发布| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 久久久久视频综合|