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    浙江省12個(gè)區(qū)(縣)分枝桿菌菌種鑒定及耐藥相關(guān)基因特征分析

    2017-03-16 05:52:15徐凱進(jìn)嵇仲康胡海洋畢晟胡飛樞鄭琳金秀媛徐文杰王淑婷楊美芳邵俊丹李鵬程黃艷芳盛吉芳李蘭娟
    中國(guó)防癆雜志 2017年2期
    關(guān)鍵詞:個(gè)區(qū)菌種結(jié)核病

    徐凱進(jìn) 嵇仲康 胡海洋 畢晟 胡飛樞 鄭琳 金秀媛 徐文杰 王淑婷 楊美芳 邵俊丹 李鵬程 黃艷芳 盛吉芳 李蘭娟

    ·論著·

    浙江省12個(gè)區(qū)(縣)分枝桿菌菌種鑒定及耐藥相關(guān)基因特征分析

    徐凱進(jìn) 嵇仲康 胡海洋 畢晟 胡飛樞 鄭琳 金秀媛 徐文杰 王淑婷 楊美芳 邵俊丹 李鵬程 黃艷芳 盛吉芳 李蘭娟

    目的 了解浙江省12個(gè)區(qū)(縣)分枝桿菌菌種流行情況及結(jié)核分枝桿菌的INH、RFP耐藥相關(guān)基因特征。方法 收集2012年1月至2016年6月浙江省12個(gè)區(qū)(縣)初診為菌陽(yáng)肺結(jié)核患者的2803株臨床分離菌株標(biāo)本,運(yùn)用基因芯片技術(shù)進(jìn)行菌種鑒定和INH、RFP耐藥檢測(cè)。結(jié)果 2803份菌株中,NTM占7.3% (205株),前6位菌種為:胞內(nèi)分枝桿菌101株,堪薩斯分枝桿菌50株,龜-膿腫分枝桿菌24株,鳥分枝桿菌16株,偶然分枝桿菌4株,淺黃色分枝桿菌1株;2598株MTB中耐INH者占12.5% (326株),耐RFP 者占9.8% (254株),MDR 占6.7% (173株)。425株MTB耐藥突變位點(diǎn)結(jié)果中,katG315位點(diǎn)占INH耐藥突變的81.1% (279/344),rpoB531位點(diǎn)占RFP耐藥突變的56.6% (155/274)。結(jié)論 通過(guò)涂片診斷肺結(jié)核患者中有13.5% (378/2803)為NTM和MDR感染,INH耐藥的主要突變位點(diǎn)是katG315,RFP耐藥的主要突變位點(diǎn)是rpoB531,在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)積極推行分枝桿菌菌種鑒定技術(shù)和耐藥檢測(cè)技術(shù)將有利于加快我國(guó)結(jié)核病疫情控制。

    分枝桿菌, 結(jié)核; 分枝桿菌, 非典型性; 抗藥性, 多種, 細(xì)菌; 基因, MDR; 點(diǎn)突變; 數(shù)據(jù)說(shuō)明, 統(tǒng)計(jì)

    非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria, NTM)是泛指結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex, MTBC)和麻風(fēng)分枝桿菌(Mycobacteriumleprae)以外的分枝桿菌[1-2],抗酸染色呈陽(yáng)性是兩者的共同特征。MTB和 NTM均可引起肺部感染,出現(xiàn)的癥狀和肺部影像學(xué)表現(xiàn)非常相似, 臨床上很難鑒別。與許多發(fā)展中國(guó)家一樣,在中國(guó)痰涂片找抗酸桿菌仍然是許多基層衛(wèi)生機(jī)構(gòu)診斷肺結(jié)核的唯一細(xì)菌學(xué)依據(jù),缺乏MTB培養(yǎng)、菌種鑒定、耐藥檢測(cè)能力。在此狀況下,NTM、耐多藥(multiple drug resistance, MDR) MTB感染均被診斷為肺結(jié)核,并接受國(guó)家推行的標(biāo)準(zhǔn)抗結(jié)核藥物化療方案治療(2H-R-Z-E/4H-R或2H2-R2-Z2-E2/4H2-R2),誤診誤治的結(jié)果導(dǎo)致病情遷移不愈,患者傳染性持續(xù)存在,對(duì)患者與社會(huì)均造成了傷害。

    掌握被基層醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)初診為“肺結(jié)核”的患者中,MDR與NTM感染所占比例,了解NTM的流行情況和INH與RFP相關(guān)耐藥突變基因特征,對(duì)中國(guó)結(jié)核病防控策略的完善與修訂具有現(xiàn)實(shí)意義,對(duì)其他國(guó)家的結(jié)核病防控也有一定的借鑒價(jià)值。筆者對(duì)浙江省12個(gè)縣(市)初診為菌陽(yáng)肺結(jié)核患者的2803份臨床分離菌株標(biāo)本,運(yùn)用基因芯片技術(shù)進(jìn)行菌種鑒定和INH、RFP耐藥檢測(cè),現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

    資料和方法

    一、研究對(duì)象

    2012年1月至2016年6月,浙江省12個(gè)區(qū)(縣)共完成18 722例結(jié)核病疑似患者痰液培養(yǎng),每份痰標(biāo)本分別接種于2支羅氏固體培養(yǎng)基(L?wenstein-Jensen medium,L-J medium ),其中有2803份痰標(biāo)本培養(yǎng)陽(yáng)性并經(jīng)過(guò)萋-尼染色法(Ziehl-Neelsen stain)證實(shí)為抗酸桿菌(acid-fast bacilli)。

    二、 實(shí)驗(yàn)方法

    1. 菌株來(lái)源地情況:浙江省位于中國(guó)東南沿海長(zhǎng)江三角洲南翼,地勢(shì)由西南向東北傾斜,可分為平原、丘陵、盆地、山地、沿海平原及島嶼等地形。選擇浙江省12個(gè)區(qū)(縣),分別為浙江省紹興市柯橋區(qū)(原紹興縣)、桐鄉(xiāng)市、舟山市普陀區(qū)、舟山市臨城新區(qū)、桐廬縣、湖州市吳興區(qū)、湖州市南潯區(qū)、德清縣、安吉縣、三門縣、玉環(huán)縣和仙居縣。上述區(qū)(縣)涵蓋了各種流行病學(xué)特征,不同流行學(xué)水平,高中低經(jīng)濟(jì)發(fā)展程度,山區(qū)、平原、海島不同地形。12個(gè)區(qū)(縣)覆蓋人口582.16萬(wàn)名(2010年數(shù)據(jù)),分別為紹興柯橋區(qū)72.70萬(wàn)名,桐鄉(xiāng)市67.4萬(wàn)名,舟山市普陀32.13萬(wàn)名,舟山定海區(qū)臨城新區(qū)37.59萬(wàn)名,桐廬縣40.25萬(wàn)名,湖州市吳興區(qū)59.85萬(wàn)名,湖州市南潯區(qū)49.06萬(wàn)名,德清縣43萬(wàn)名,安吉縣45.77萬(wàn)名,三門縣42.92萬(wàn)名,玉環(huán)縣41.96萬(wàn)名,仙居縣49.53萬(wàn)名[3]。2012年,在以上區(qū)(縣)實(shí)行結(jié)核病疑似患者[咳嗽、咯痰≥2周,和(或)胸部X線檢查有可疑結(jié)核病灶]分枝桿菌培養(yǎng),并收集所有培養(yǎng)陽(yáng)性的菌株,利用基因芯片技術(shù)進(jìn)行INH、RFP耐藥突變檢測(cè)和分枝桿菌菌種鑒定,分析MDR與NTM感染的現(xiàn)況。

    2. 分枝桿菌菌種鑒定:采用北京博奧生物(CapitalBio)生產(chǎn)的分枝桿菌菌種鑒定試劑盒(mycobacteria identification array kit)進(jìn)行鑒定,該方法包含了17種分枝桿菌特異性的16s RNA探針(結(jié)核分枝桿菌、鳥分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、不產(chǎn)色分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、金色分枝桿菌、土分枝桿菌、戈登分枝桿菌、草分枝桿菌、龜-膿腫分枝桿菌、淺黃色分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、偶然分枝桿菌、蘇爾加分枝桿菌、海-潰瘍分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌),能明確待檢菌株是否為MTB和NTM,如果是NTM可進(jìn)一步鑒定是否為前述的16種NTM之一[4-6]。實(shí)驗(yàn)步驟簡(jiǎn)述如下:用接種環(huán)從羅氏培養(yǎng)基收集菌株,加入核酸提取液,使用Extractor 36核酸快速提取儀振蕩5 min,95 ℃水浴5 min,2348×g離心1 min,取上清液作為模板進(jìn)行PCR,獲得熒光標(biāo)記的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,將PCR產(chǎn)物95 ℃裂解10 min,獲得的單鏈DNA置于冰水混合物中,與雜交緩沖液按比例混合,用微量移液器吹吸2次混勻,經(jīng)蓋片的加樣孔加入雜交反應(yīng)混合物,迅速蓋上雜交盒并密封后放入雜交儀中,計(jì)時(shí)120 min。雜交反應(yīng)結(jié)束后,將雜交盒水平取出拆開(kāi),將芯片取出,用晶芯?SlideWasherTM8芯片洗干儀自動(dòng)洗滌除去非特異性雜交的背景染色。然后于離心機(jī)中60×g離心5 min,甩干后掃描。使用LuxScan 10K-B微陣列芯片掃描儀和相應(yīng)軟件進(jìn)行信號(hào)的讀取及結(jié)果判讀。

    3. MTB的耐藥鑒定:采用北京博奧生物生產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測(cè)試劑盒,該方法包含的RFP相關(guān)耐藥突變檢測(cè)位點(diǎn)有rpoB基因的 C531G、C531T、CG531AC、A526C、A526G、A526T、C526A、C526G、C526T、T533C、A516G、A516T、G516T、T511C、T511G、C513A、A513T、C522T;包含的INH相關(guān)耐藥檢測(cè)突變位點(diǎn)有katG基因的 G315A、G315C、G315T、C315及inhA基因的啟動(dòng)子區(qū)(-15)C-T突變型[7]。實(shí)驗(yàn)步驟同菌種鑒定。

    三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    利用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析。

    結(jié) 果

    1.分枝桿菌菌種鑒定結(jié)果:2803份菌株中,MTB有2598株,占92.7%。NTM有205株,占7.3%;前6位菌種:胞內(nèi)分枝桿菌101株,堪薩斯分枝桿菌50株,龜-膿腫分枝桿菌24株,鳥分枝桿菌16株,偶然分枝桿菌4株,淺黃色分枝桿菌1株?;蛐酒瑱z測(cè)結(jié)果提示9株為NTM,但未能分型確定具體的菌種,結(jié)果見(jiàn)表1。

    表1 2803株分枝桿菌的菌種鑒定情況

    注a:為該菌種在所有NTM中所占比例

    2. 耐藥菌株鑒定:2598株MTB中,對(duì)INH、RFP均敏感者有2173株,占83.6%;MDR菌株有173株,占6.7%;單耐INH者有171株,單耐RFP者有81株(表2)。

    對(duì)MTB耐藥突變位點(diǎn)檢測(cè)的結(jié)果提示,katG315是INH耐藥的主要突變位點(diǎn),與其相關(guān)的INH耐藥突變占81.1%(279/344);rpoB531是RFP耐藥的主要突變位點(diǎn),與其相關(guān)的RFP耐藥突變占61.0%(155/254)。254株耐RFP菌株的rpoB基

    表2 2598株MTB對(duì)INH和RFP是否耐藥的檢測(cè)結(jié)果

    因突變位點(diǎn)中,均為點(diǎn)突變,未見(jiàn)插入突變或缺失型突變;單位點(diǎn)突變 234例(92.1%),雙位點(diǎn)突變 20 例(7.9% );常見(jiàn)突變位點(diǎn)為rpoB531者占61.0%(155/254)、rpoB526者占14.2%(36/254)、rpoB516者占13.4%(34/254)、rpoB511者占12.6%(32/254)、rpoB533者占5.1%(13/254)、rpoB513者占1.6%(4/254);MTB耐藥突變位點(diǎn)的分布情況見(jiàn)表3、4。

    表3 254株耐RFP菌株的rpoB基因突變位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果

    表4 344例耐INH菌株基因突變位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果

    討 論

    浙江省12個(gè)區(qū)(縣)收集到的2803份菌株中分離到NTM、MDR共378株,占總菌株的13.5%;這些菌株的感染者如按照經(jīng)驗(yàn)性使用國(guó)家推薦的標(biāo)準(zhǔn)方案(2H-R-Z-E/4H-R或2H2-R2-Z2-E2/4H2-R2)治療,效果是無(wú)效或是效果不佳的[8]。如果能在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)及疾病預(yù)防控制中心采取分枝桿菌菌種鑒定,在診斷初期及時(shí)甄別NTM與MTB感染,可提高結(jié)核病診斷的正確性,及時(shí)獲得MDR感染信息并給予合理的治療;如此就有希望提高結(jié)核病患者的治愈率,對(duì)控制結(jié)核病疫情將有很好的促進(jìn)作用。

    浙江省的狀況在一定程度上反映了中國(guó)現(xiàn)階段結(jié)核病防控方面存在的問(wèn)題。縣級(jí)醫(yī)療機(jī)構(gòu)是中國(guó)結(jié)核病診治工作的主要承擔(dān)者,但目前有大部分的縣級(jí)醫(yī)療機(jī)構(gòu)不具備對(duì)MTB進(jìn)行分離培養(yǎng)的能力,更無(wú)法進(jìn)行MTB耐藥檢測(cè)與分枝桿菌菌種鑒定;由這些機(jī)構(gòu)診斷的肺結(jié)核患者中可能有一部分患者是NTM或MDR感染,在治的化療方案是不合理的[9]。中國(guó)是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家,為加快結(jié)核病疫情的控制,中國(guó)有必要在所有承擔(dān)結(jié)核病診治任務(wù)的基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)規(guī)劃推行分枝桿菌菌種鑒定技術(shù)和耐藥檢測(cè)技術(shù)。

    本研究顯示,擬診為肺結(jié)核的菌陽(yáng)患者中,大約有7.3%的患者實(shí)際是NTM感染,我們應(yīng)該高度重視NTM在結(jié)核病控制中的混雜干擾作用,避免誤診誤治,減少醫(yī)療浪費(fèi),減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。在浙江省,胞內(nèi)分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、龜-膿腫分枝桿菌是最常見(jiàn)的NTM流行菌種,與前期報(bào)道基本一致[10]。類似韓國(guó)、日本、臺(tái)灣[11-13],關(guān)于這些NTM感染患者的治療與預(yù)防知識(shí)對(duì)于大部分臨床醫(yī)生還是很陌生的,加強(qiáng)知識(shí)的普及也是疾病防控工作中的重要環(huán)節(jié)[14]。

    在MTB耐藥突變位點(diǎn)資料中,所有菌株中存在耐INH位點(diǎn)突變的菌株占12.5%,其中單耐INH的菌株為6.6%;所有菌株中存在耐RFP位點(diǎn)突變的菌種占9.8%,其中單耐RFP的菌株為3.1%;可見(jiàn)RFP耐藥位點(diǎn)突變后進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為MDR菌株的概率要高一些[15],這些信息對(duì)結(jié)核病臨床工作中進(jìn)行耐藥檢測(cè)靶點(diǎn)、耐藥預(yù)測(cè)的把握上有一定的參考價(jià)值。

    [1] El Helou G,Viola GM,Hachem R,et al. Rapidly growing mycobacterial bloodstream infections. Lancet Infect Dis,2013,13(2):166-174.

    [2] Menzies D,Nahid P. Update in tuberculosis and nontuberculous mycobacterial disease 2012. Am J Respir Crit Care Med,2013,188(8):923-927.

    [3] 浙江省統(tǒng)計(jì)局,國(guó)家統(tǒng)計(jì)局浙江調(diào)查總隊(duì).浙江省統(tǒng)計(jì)年鑒(2011).北京:中國(guó)統(tǒng)計(jì)出版社,2011.

    [4] Zhu L,Jiang G,Wang S,et al. Biochip system for rapid and accurate identification of mycobacterial species from isolates and sputum. J Clin Microbiol,2010,48(10):3654-3660.

    [5] Pang Y,Zhou Y,Wang S,et al. Rapid molecular identification of mycobacterial species in positive culture isolates using the biochip test. Int J Tuberc Lung Dis,2011,15(12):1680-1685.

    [6] Liu J,Yue J,Yan Z,et al. Performance assessment of the CapitalBio mycobacterium identification array system for identification of mycobacteria. J Clin Microbiol,2012,50(1):76-80.

    [7] Guo Y,Zhou Y,Wang C,et al. Rapid and accurate determination of MDR inM.tuberculosisisolates and clinical sputum using a biochip system. Int J Tuberc Lung Dis,2009,13(7):914-920.

    [8] Zhao Y, Xu S,Wang L,et al.National survey of drug-resistant tuberculosis in China.N Engl J Med,2012,366(23):2161-2170.

    [9] 全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組,全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查辦公室. 2010年全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告. 中國(guó)防癆雜志,2012,34(8):485-508.

    [10] Xu K,Bi S,Ji Z,et al. Distinguishing nontuberculous mycobacteria from multidrugr resistantMycobacteriumtuberculosis,China. Emerg Infect Dis,2014,20(6):1060-1062.

    [11] Ryoo SW,Shin S,Shim MS,et al. Spread of nontuberculous mycobacteria from 1993 to 2006 in Koreans. J Clin Lab Anal,2008,22(6):415-420.

    [12] Tsukamura M,Kita N,Shimoide H,et al. Studies on the nontuberculous lung mycobacteriosis in Japan. Kekkaku,1988,63(7):493-499.

    [13] Chiang CY,Luh KT,Enarson DA,et al. Accuracy of classification of notified tuberculosis cases in Taiwan. Int J Tuberc Lung Dis,2007,11(8):876-881.

    [14] McGrath EE,McCabe J,Anderson PB. Guidelines on the diagnosis and treatment of pulmonary non-tuberculous mycobacteria infection. Int J Clin Pract,2008,62(12):1947-1955.

    [15] Zumla AI,Gillespie SH,Hoelscher M,et al. New antituberculosis drugs,regimens,and adjunct therapies: needs,advances,and future prospects. Lancet Infect Dis,2014,14(4):327-340.

    (本文編輯:范永德)

    Strain identification and analysis of drug resistance gene characteristics inM.tuberculosisstrains from 12 districts in Zhejiang Province

    XUKai-jin,JIZhong-kang,HUHai-yang,BISheng,HUFei-shu,ZHENGLin,JINXiu-yuan,XUWen-jie,WANGShu-ting,YANGMei-fang,SHAOJun-dan,LIPeng-cheng,HUANGYan-fang,SHENGJi-fang,LILan-juan.

    StateKeyLaboratoryforDiagnosisandTreatmentofInfectiousDiseases,theFirstAffiliatedHospital,SchoolofMedicine,ZhejiangUniversity,CollaborativeInnovationCenterforDiagnosisandTreatmentofInfectiousDiseases,Hangzhou310003,China

    LILan-juan,Email:ljli@zju.edu.cn

    Objective To analyze the epidemiological characteristics of Mycobacterium strains and drug-resistance gene characteristics inMycobacteriumtuberculosisstrains from 12 counties in Zhejiang Province, China. Methods From January, 2012, to June, 2016, a total of 2803 sputum positive samples (positive staining that confirmed growth of acid-fast bacilli) were collected from patients newly diagnosed with TB in Zhejiang Province. Mycobacteria Identification Array Kits andM.tuberculosisDrug Resistance Detection Array Kits were used to further identify and characterize the strains in each sample. Results We identified 2598 of the 2803 strains (92.7%), asMycobacteriumtuberculosisand 205 strains (7.3%) as NTM. NTM strains were further identified as follows:Mycobacteriumintracellulare, 101 isolates;Mycobacteriumkansasii, 50 isolates; Turtle/Mycobacteriumabscessus, 24 isolates;Mycobacteriumavium, 16 isolates;Mycobacteriumfortuitum, 4 isolates;light yellowMycobacterium,1 isolate. Among the 2598M.tuberculosisstrains there were 326 (12.5%) INH-resistant strains, 254 (9.8%) RFP-resistant strains,and 173 (6.7%) MDR TB strains. Among the drug-resistant strains ofM.tuberculosis, 81.1% (279/344) of the INH-resistant mutations were related tokatG315, and 84 (60.0%) of 140 RFP-resistant mutations were associated withrpoB531. Conclusion Among the 2803 strains collected from patients in 12 counties of Zhejiang Province, 378 (13.5%) were designated as either MDR TB or NTM. In addition,katG315 was the main point mutation associated with INH resistance inM.tuberculosisstrains, andrpoB531 was the main point mutation for RFP resistance. Mycobacterium strain identification and drug-resistance testing are important in enhancing regulation and prevention of TB in basic medical institutions.

    Mycobacteriumtuberculosis; Mycobacteria, atypical; Drug resistance, multiple, bacterial; Genes, MDR; Point mutation; Data interpretation, statistics

    10.3969/j.issn.1000-6621.2017.02.010

    “十二五”國(guó)家科技重大專項(xiàng)(2013ZX10004-904;2014ZX10003002);浙江省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015KYA102)

    310003 杭州,浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 傳染病診治國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 感染性疾病診治協(xié)同創(chuàng)新中心

    李蘭娟,Email:ljli@zju.edu.cn

    2016-08-22)

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