Notch信號通路與銀屑病發(fā)病的關(guān)系及作用機制

狄偉

(山東中醫(yī)藥大學，濟南271100)

Notch信號通路與銀屑病發(fā)病的關(guān)系及作用機制

狄偉

(山東中醫(yī)藥大學，濟南271100)

目的 探討Notch信號通路與銀屑病發(fā)病的關(guān)系及作用機制。方法 分別用RT-PCR、Western blotting技術(shù)檢測30例銀屑病患者皮損區(qū)皮膚組織(病例組)及其周邊非皮損區(qū)皮膚組織(對照組)、30例正常人皮膚組織(正常組)中Notch1、Jagged1 mRNA和蛋白表達；將人永生化角質(zhì)形成細胞HaCaT隨機分為Jagged1-Fc融合蛋白組、DAPT組、常規(guī)對照組，分別加入含Notch信號通路特異性激活劑(Jagged1-Fc融合蛋白，終濃度0、0.5、1、2 μg/mL)、Notch信號通路特異性阻斷劑(DAPT，終濃度0、5、10、20 μmol/L)、常規(guī)細胞培養(yǎng)液干預(yù)24、48、72 h。用Western blotting法檢測細胞內(nèi)Bcl-2、Bax、Keratin1、Involucrin蛋白表達，用MTT法檢測HaCaT細胞增殖活力，用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。結(jié)果 病例組Notch1、Jagged1 mRNA及蛋白相對表達量高于對照組與正常組(P均<0.05)。干預(yù)0、24、48、72 h，Jagged1-Fc融合蛋白組細胞增殖率隨干預(yù)濃度升高依次升高，DAPT組隨干預(yù)濃度降低依次降低(P均<0.05)。與常規(guī)對照組比較，Jagged1-Fc融合蛋白組細胞凋亡率降低、DAPT組升高(P均<0.05)。與常規(guī)對照組比較，Jagged1-Fc融合蛋白組Bcl-2蛋白相對表達量升高，Bax蛋白相對表達量降低(P均<0.05)；DAPT組Bcl-2蛋白相對表達量降低，Bax蛋白相對表達量升高(P均<0.05)。與常規(guī)對照組比較，Jagged1-Fc融合蛋白組Keratin1及Involucrin蛋白相對表達量降低(P均<0.05)；DAPT組Keratin1及Involucrin蛋白相對表達量升高(P均<0.05)。結(jié)論 銀屑病的發(fā)生與Notch信號通路的激活相關(guān)，其可能的作用機制為Notch信號通路促進角質(zhì)形成細胞增殖、抑制其凋亡與分化。

銀屑病；Notch信號通路；角質(zhì)形成細胞；細胞增殖；細胞凋亡；細胞分化

銀屑病是一種常見的慢性炎癥性皮膚病，其主要病理特征為角質(zhì)形成細胞過度增殖，導(dǎo)致表皮可凋亡的角質(zhì)形成細胞異常分化，并伴隨皮膚炎癥浸潤及血管生成異常等[1，2]。銀屑病病程較長、易復(fù)發(fā)且較難治愈[3]。目前關(guān)于銀屑病的發(fā)病原因和機制尚無定論，但普遍認為與遺傳和環(huán)境相關(guān)[4]。Notch信號通路由多種分子及蛋白組成，參與多種疾病的發(fā)生過程，與銀屑病的發(fā)生密切相關(guān)。目前研究較多的是Notch信號通路與免疫介導(dǎo)機制在銀屑病發(fā)病中的作用[5]。角質(zhì)形成細胞是構(gòu)成表皮結(jié)構(gòu)的主要細胞，約占表皮細胞總數(shù)的80%。多種皮膚腫瘤及炎癥性皮膚病的發(fā)生與角質(zhì)形成細胞增殖、凋亡、分化異常相關(guān)[6]。HaCaT細胞是從成人皮膚中分離的永生化角質(zhì)形成細胞系，其遺傳特性穩(wěn)定，增殖、分化特性與角質(zhì)形成細胞相似，在進行實驗研究時常用來替代角質(zhì)形成細胞[7]。2014年4月～2015年6月，本研究觀察Notch信號通路關(guān)鍵因子在銀屑病皮損區(qū)皮膚中的表達情況及對HaCaT細胞增殖、凋亡及分化的影響，探討Notch信號通路在銀屑病發(fā)病中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 皮膚組織標本來源 選擇同期山東省中醫(yī)院就診的斑塊型銀屑病患者30例(病例組)，均經(jīng)皮膚組織病理檢查確診。其中男18例、女12例，年齡18～75(32.6±7.4)歲。采集患者皮損區(qū)皮膚組織為病例組，同時采集距皮損區(qū)1 cm非皮損區(qū)皮膚組織作為對照組。納入標準：皮損區(qū)近2周未外涂藥物，近1個月未接受免疫抑制劑及其他藥物治療。排除標準：年齡<18歲或>75歲；合并皮膚腫瘤或其他增生性皮膚??；有心腦血管、肝、腎及造血系統(tǒng)等嚴重原發(fā)性疾病或其他情況不適合取材者。同期選取本院皮膚科留存的健康人皮膚組織樣本30例作為正常組，健康人男16例、女14例，年齡18～69(34.2±6.8)歲。三組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。三組去除皮下結(jié)締組織與皮下脂肪后，于液氮中速凍，-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 細胞、試劑及儀器 人永生化角質(zhì)形成細胞系HaCaT，購于中國科學院細胞庫。Notch信號通路特異性激活劑(Jagged1-Fc融合蛋白)和Notch信號通路特異性阻斷劑(DAPT)，購于美國R&D System公司；TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑(SYBR Green I)，購于日本TaKaRa公司；Notch1、Jagged1、B淋巴細胞瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、角蛋白1(Keratin1)和重組人外皮蛋白(Involucrin)單克隆抗體，購于美國Abcam公司；辣根過氧化物標記的二抗，購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；DMEM培養(yǎng)基、100 μg/mL碘化丙啶(PI)、Annexin-V-FITC，購于美國Sigma公司；MTT試劑盒購于普洛麥格北京生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白定量試劑盒、5×SDS蛋白上樣緩沖液，購于天根生化科技有限公司；FBS，購于杭州四季青生物工程材料研究所。CO2培養(yǎng)箱，購于常州菲普實驗儀器廠；倒置顯微鏡，購于日本尼康；RT-PCR儀，購于瑞士Roche公司；流式細胞儀，購于美國BD公司；Multiskan MK3 型酶標儀，購于芬蘭 Thermo Labsys2tems公司。

1.3 細胞培養(yǎng)及處理 從液氮罐中取出裝有HaCaT細胞的凍存管，放入37 ℃恒溫水浴鍋中快速解凍，待細胞凍存液融解后，將細胞移至5 mL無菌離心管中，加入含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)液3 mL稀釋凍存液中的DMSO，1 000 r/min離心5 min，去除上清液。加入新的培養(yǎng)液吹打重懸細胞沉淀，接種到細胞培養(yǎng)皿中，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞貼壁后換液1次，去除漂浮的死細胞，之后定期換液，待細胞融合度達80%以上時，用0.25%的胰酶消化并收集細胞，按1∶3的比例進行傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的HaCaT細胞，去除細胞培養(yǎng)液，用PBS清洗細胞2次，用0.25%的胰酶消化，待細胞呈單個存在時終止消化，離心收集細胞沉淀。用培養(yǎng)液重懸、計數(shù)后，將細胞濃度調(diào)整為5×104/mL，每孔200 μL接種于經(jīng)紫外照射滅菌的96孔培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，去除細胞培養(yǎng)液，將細胞隨機分為Jagged1-Fc融合蛋白組、DAPT組、常規(guī)對照組，分別加入含(終濃度0、0.5、1、2 μg/mL)Jagged1-Fc融合蛋白、(終濃度0、5、10、20 μmol/L)DAPT、常規(guī)細胞培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。

1.4 皮膚組織中Notch1、Jagged1 mRNA表達檢測 用RT-PCR技術(shù)。取三組皮膚組織，用TRIzol法提取總RNA。紫外分光光度計檢測總RNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量；用PrimeScriptTM RT Reagent kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用RT-PCR試劑盒檢測。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中公布的人Notch1和Jagged1 mRNA序列，用Primer5.0軟件設(shè)計RT-PCR引物，送上海派森諾生物科技有限公司合成，引物序列為Notch1-F：5′-GTCAACGCCGTAGATGACCT-3′，Notch1-R：5′-CAGGTTGTACTCGTCCAGCA-3′；Jagged1-F：5′-GTCCCACTGGTTTCTCTGGA-3′，Jagged1-R：5′-CCACAGACGTTGGAGGAAAT-3′；β-actin-F：5′-TGACGTGGACATCCG-CAAAG-3′，β-actin-R：5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAG-G-3′。RT-PCR擴增條件：預(yù)變性95 ℃ 5 min，變性95 ℃ 30 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，35個循環(huán)。用β-actin作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

1.5 皮膚組織中Notch1、Jagged1蛋白及HaCaT細胞內(nèi)Bcl-2、Bax、Keratin1、Involucrin蛋白表達檢測 采用Western blotting法。取三組皮膚組織，按照蛋白提取試劑盒說明書提取皮膚組織總蛋白；HaCaT細胞經(jīng)Jagged1-Fc融合蛋白、DAPT處理。用0.25%的胰酶消化、收集細胞，按照蛋白提取試劑盒說明書提取HaCaT細胞總蛋白。按照試劑盒說明書測定組織及細胞總蛋白濃度。蛋白上清液稀釋至統(tǒng)一濃度后，與Loading buffer按體積4∶1混勻，100 ℃煮沸5 min使蛋白變性。將變性蛋白樣品加入SDS蛋白凝膠上樣孔中，每孔50 μL，常規(guī)方法垂直電泳。電泳結(jié)束取出蛋白凝膠，按照濾紙、PVDF膜、蛋白凝膠、濾紙的順序在4 ℃轉(zhuǎn)膜過夜。PBST洗滌3次，PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉2 h，然后依次與一抗(500倍稀釋)、二抗(1 000倍稀釋)孵育，滴加ECL顯色液，在暗室中曝光，用Odyssey成像系統(tǒng)掃描各條帶灰度值，β-actin條帶作為內(nèi)參照。目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值。

1.6 HaCaT細胞增殖活力檢測 采用MTT法。HaCaT細胞經(jīng)Jagged1-Fc融合蛋白、DAPT處理，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h，每孔加入0.5%的MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，加入DMSO 150 μL，低速振蕩10 min溶解藍紫色結(jié)晶。用空白調(diào)零孔調(diào)零，用酶標儀測定波長570 nm處光密度(A)值，A值與細胞數(shù)量呈正比，以A值作為評價細胞增殖活力的指標。

1.7 HaCaT細胞凋亡率檢測 采用流式細胞術(shù)。取對數(shù)生長期的HaCaT細胞分別用終濃度為2 μg/mL的Jagged1-Fc融合蛋白、終濃度為20 μmol/L DAPT處理72 h，棄去細胞培養(yǎng)液，PBS清洗細胞2次，加入0.25%的胰蛋白酶消化、收集細胞，以不做處理的細胞作對照。細胞計數(shù)，用細胞培養(yǎng)液重懸細胞，調(diào)整細胞為1×106/mL。取細胞懸液1 mL加入1.5 mL離心管中，4 ℃，1 200 r/min，離心5 min，棄上清液。向細胞沉淀中加入Binding Buffer 200 μL，充分混勻后分別加入PI 5 μL和Annexin V-FITC 5 μL，避光室溫孵育20～30 min，加入Binding Buffer 400 μL，用流式細胞儀檢測HaCaT細胞凋亡情況，計算細胞凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 各組皮膚組織中Notch1、Jagged1 mRNA及蛋白的表達比較 正常組Notch1、Jagged1 mRNA相對表達量分別為1.00±0.09、1.00±0.11，蛋白相對表達量分為0.39±0.12、0.67±0.08；對照組Notch1、Jagged1 mRNA相對表達量分別為1.16±0.16、1.17±0.21，蛋白相對表達量分別為 0.43±0.01、0.71±0.11；病例組Notch1、Jagged1 mRNA相對表達量分別為3.64±0.15、2.36±0.32，蛋白相對表達量分別為1.29±0.13、1.46±0.15。病例組Notch1、Jagged1 mRNA及蛋白相對表達量高于其他兩組(P均<0.05)，對照組與正常組Notch1、Jagged1 mRNA及蛋白相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。

2.2 Notch信號通路對HaCaT細胞增殖的影響 見表1。

表1 Jagged1-Fc融合蛋白組與DAPT組細胞增殖率比較

2.3 Notch信號通路對HaCaT細胞凋亡的影響 Jagged1-Fc融合蛋白組、DAPT組、常規(guī)對照組凋亡率分別為4.76%±1.13%、26.87%±3.18%、13.69%±2.05%；與常規(guī)對照組比較，Jagged1-Fc融合蛋白組細胞凋亡率降低、DAPT組升高(P均<0.05)。

2.4 Notch信號通路對HaCaT細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響 常規(guī)對照組、Jagged1-Fc融合蛋白組、DAPT組Bcl-2蛋白相對表達量分別為0.63±0.11、1.28±0.15、0.29±0.08，Bax蛋白相對表達量分別為0.57±0.08、0.16±0.08、1.17±0.16。與常規(guī)對照組比較，Jagged1-Fc融合蛋白組Bcl-2蛋白相對表達量升高，Bax蛋白相對表達量降低(P均<0.05)；DAPT組Bcl-2蛋白相對表達量降低， Bax蛋白相對表達量升高(P均<0.05)。

2.5 Notch信號通路對HaCaT細胞分化的影響 常規(guī)對照組、Jagged1-Fc融合蛋白組、DAPT組Keratin1蛋白相對表達量分別為0.53±0.08、0.29±0.06、1.03±0.14，Involucrin蛋白相對表達量分別為0.86±0.17、0.39±0.06、1.27±0.16。與常規(guī)對照組比較，Jagged1-Fc融合蛋白組Keratin1及Involucrin蛋白相對表達量降低(P均<0.05)；DAPT組Keratin1及Involucrin蛋白相對表達量升高(P均<0.05)。

3 討論

Notch信號通路是介導(dǎo)細胞之間相互接觸的重要信號通路，在機體多種組織器官中均有表達，能夠調(diào)控細胞增殖、分化、凋亡等過程[8]。研究證實Notch信號通路的異常激活與多種惡性腫瘤的發(fā)生相關(guān)。如劉天舒等[9]研究發(fā)現(xiàn)，阻斷Notch信號通路能夠抑制肺癌干細胞的生長。在造血系統(tǒng)中，Notch信號通路激活能夠促進造血組細胞增殖并抑制其分化[10]。皮膚是人體重要的組織器官，與全身免疫系統(tǒng)密切相關(guān)，具有非特異性免疫防御功能。表皮多種細胞中均有Notch信號分子的表達。有研究報道，Notch信號通路關(guān)鍵因子Notch1、Notch2及HES-1在銀屑病患者外周血T細胞中表達上調(diào)[11]；Jagged1是Notch信號通路的主要配體之一，有研究發(fā)現(xiàn)Jagged1在血熱型銀屑病表皮中表達增強[12]，提示Notch信號通路可能參與銀屑病的發(fā)生過程。本研究采集了銀屑病患者皮損區(qū)皮膚組織、周邊非皮損區(qū)皮膚組織及正常人皮膚組織，用RT-PCR和Western blotting檢測Notch信號通路配體受體Notch1、Jagged1的表達，發(fā)現(xiàn)Notch1、Jagged1 mRNA和蛋白在銀屑病患者皮損區(qū)皮膚組織呈現(xiàn)高表達。說明Notch信號通路與銀屑病的發(fā)病過程相關(guān)，這與其他研究結(jié)果一致。

角質(zhì)形成細胞是構(gòu)成表皮結(jié)構(gòu)的主要細胞，具有很強的增殖及分化能力，是皮膚組織免疫及屏障的重要功能細胞[13]。正常狀態(tài)下，角質(zhì)形成細胞的增殖與凋亡處于動態(tài)平衡狀態(tài)，兩者相互制約維持表皮的正常厚度與角質(zhì)層的形成，其增殖、凋亡、分化異常會導(dǎo)致多種皮膚疾病的發(fā)生[14]。銀屑病的發(fā)病機制尚不清楚，但是表皮角質(zhì)形成細胞過度增殖及異常分化是其主要特點之一，多數(shù)學者還認為銀屑病的發(fā)生與表皮角質(zhì)形成細胞凋亡減少有關(guān)[15]。本研究以HaCaT細胞為實驗材料，用Jagged1-Fc融合蛋白激活Notch信號通路，DAPT阻斷Notch信號通路，結(jié)果顯示，激活Notch信號通路能夠促進HaCaT細胞增殖；而阻斷Notch信號通路能夠抑制HaCaT細胞增殖。

Bcl-2基因家族在通過線粒體途徑調(diào)控細胞凋亡中具有重要作用，其中Bcl-2是一種抑凋亡基因[16]，Bax是一種促凋亡基因[17]，Bcl-2和Bax能夠形成異源或同源二聚體，對細胞凋亡的調(diào)節(jié)作用由兩者的比值決定，其中Bcl-2蛋白表達減少，Bax蛋白表達增加，促進細胞的凋亡，反之則抑制細胞凋亡[18]。本實驗結(jié)果顯示，激活Notch信號通路能夠抑制HaCaT細胞凋亡，并明顯促進Bcl-2蛋白表達，抑制Bax蛋白表達；阻斷Notch信號通路則能夠促進HaCaT細胞凋亡，并明顯抑制Bcl-2蛋白表達，促進Bax蛋白表達，提示Notch信號通路調(diào)控HaCaT細胞凋亡可能與Bcl-2基因家族相關(guān)。

Keratin1是表皮顆粒層特異性蛋白，Involucrin是棘皮層特異性蛋白，二者可作為HaCaT細胞分化的標志蛋白[19，20]。本研究發(fā)現(xiàn)，用Jagged1-Fc融合蛋白激活Notch信號通路能夠下調(diào)Keratin1和Involucrin蛋白表達；用DAPT阻斷Notch信號通路能夠上調(diào)Keratin1和Involucrin表達，說明激活Notch信號通路能夠抑制HaCaT細胞分化，阻斷Notch信號通路能夠促進HaCaT細胞分化。

綜上所述，Notch信號通路關(guān)鍵因子在銀屑病患者皮損區(qū)皮膚組織中表達上調(diào)，激活Notch信號通路能夠促進角質(zhì)形成細胞的增殖、抑制角質(zhì)形成細胞的凋亡和分化。反之，阻斷Notch信號通路能夠抑制角質(zhì)形成細胞的增殖、促進角質(zhì)形成細胞的凋亡和分化。

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