古法炮制地黃與市售地黃成分的比較

楊飛飛，李勝男，郭懷忠，楊茹敏

(1.河北大學(xué) 藥學(xué)院，河北 保定 071002； 2.安國市益源康中藥材有限公司，河北 安國 071200)

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古法炮制地黃與市售地黃成分的比較

楊飛飛1，李勝男1，郭懷忠1，楊茹敏2

(1.河北大學(xué) 藥學(xué)院，河北 保定 071002； 2.安國市益源康中藥材有限公司，河北 安國 071200)

通過高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜技術(shù)來研究古法炮制生、熟地黃藥材與當(dāng)前市售生、熟地黃的品質(zhì)差異，為地黃藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善以及炮制方法的研究提供參考.樣品采用甲醇提取，使用Welchrom C18色譜柱 (4.6 mm × 250 mm，5 μm )，乙腈-0.1% (體積分?jǐn)?shù)) 磷酸水溶液梯度洗脫，多波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器檢測(cè)，流速 1.0 mL/min，進(jìn)樣量 20 μL，柱溫 35 ℃.分別對(duì)生、熟地黃的HPLC指紋圖譜的共有峰面積進(jìn)行比對(duì).古法炮制地黃與市售地黃所含成分有顯著差異，古法竹刀切片制生地黃與古法酒蒸炮制熟地黃，其主要成分梓醇、毛蕊花糖苷含量普遍高于市售生、熟地黃；而5-羥甲基糠醛的含量遠(yuǎn)低于市售品.

生地黃；熟地黃；指紋圖譜；HPLC；炮制

地黃為玄參科植物地黃(RehmanniaglutinosaLibosch.)的塊根，在臨床上應(yīng)用廣泛，生地黃、熟地黃是其2種入藥形式.鮮地黃緩緩烘焙至約八成干，制得生地黃；生地黃照酒燉法或蒸法炮制，即得熟地黃.生地黃性寒、味甘，歸心、肝、腎經(jīng)，具有清熱涼血，養(yǎng)陰生津的功效.熟地黃性微溫、味甘，歸肝、腎經(jīng)，具有補(bǔ)血滋陰，益精填髓的功效[1].生地黃炮制成熟地黃后其藥性由寒轉(zhuǎn)溫，功能由清轉(zhuǎn)補(bǔ)，2者在藥性、藥效上有著極大的差異.地黃的炮制方法及炮制品的質(zhì)量會(huì)極大影響其臨床療效.

中藥炮制是根據(jù)中醫(yī)臨床用藥理論和藥物配制的需要，將藥材進(jìn)一步加工的傳統(tǒng)工藝，與藥效有著密切的關(guān)系，且古法炮制中多有禁忌[2].如生地黃的炮制，《雷公炮炙論》曰，“凡使生地黃……，勿犯銅鐵器，令人腎消并發(fā)白，男損榮，女損衛(wèi)也”，因此古法加工生地黃時(shí)多用木刀或竹刀切制[3].酒制熟地黃是地黃傳統(tǒng)制法之一，且古法記載炮制時(shí)要求達(dá)到“九蒸九曬”，方得質(zhì)量上乘地黃藥材[4].現(xiàn)今地黃加工炮制在輔料使用及工藝上多有改變，并簡(jiǎn)化炮制工藝，且不完全統(tǒng)一，且多數(shù)僅以“黑如漆，甜如飴”等籠統(tǒng)的性狀變化作為達(dá)到炮制終點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)，缺少客觀的質(zhì)量檢測(cè)指標(biāo).以蒸制地黃為例，基于工業(yè)化要求，目前多采用一次蒸制，蒸熟即可，但《本草綱目》中記載“今布中惟以酒煮熟售者，不可用.”《備急千金要方》中亦記載“候好晴日便早蒸之,即暴于日中,夜置汁中以物蓋之,明朝又蒸,古法九遍止,今但看汁盡色黑熟,蒸三五遍亦得”.不同的炮制過程必然會(huì)造成地黃藥材質(zhì)量出現(xiàn)差異.相關(guān)研究表明，地黃炮制前后，其主要成分梓醇、苷類、5-羥甲基糠醛等會(huì)發(fā)生明顯的變化[5-6].本文參考文獻(xiàn)[7]，建立了高效液相色譜測(cè)定地黃指紋圖譜的方法，并利用該方法對(duì)采用竹刀切片制生地黃，古法多次酒蒸法制熟地黃，以及市售地黃進(jìn)行研究，比較其成分差異，為開展地黃藥材炮制規(guī)范化研究提供參考.

1 材料與試劑

1.1 藥材

市售生地黃(編號(hào)：生地黃Ⅰ-Ⅶ)、熟地黃(編號(hào)：熟地黃Ⅰ-Ⅶ)分別購自7家不同的藥店.古法竹刀切片制生地黃(編號(hào)：生地黃Ⅷ-Ⅹ)、古法多次酒蒸法制熟地黃(編號(hào)：熟地黃Ⅷ-Ⅹ，自制)各3批.古法炮制生、熟地黃樣品均由安國市益源康中藥材有限公司提供，所有藥材均經(jīng)河北大學(xué)藥學(xué)院徐宏欣老師鑒定為正品.

1.2 儀器與試藥

P3000高效液相色譜儀(北京創(chuàng)新通恒科技有限公司)；Welchrom C18色譜柱 (4.6 mm × 250 mm，5 μm，上海月旭科技股份有限公司)；AG204電子分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；TG16-W微量高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)；HH-601超級(jí)恒溫水浴(山東鄄城華魯電熱儀器有限公司).

梓醇(批號(hào)110808-200508)和毛蕊花糖苷(批號(hào)111530-201007)對(duì)照品均購自中國食品藥品檢定研究院；5-羥甲基糠醛(5-HMF)為實(shí)驗(yàn)室參考文獻(xiàn)[8-9]自制(稱取葡萄糖2.0 g，以HCl-CrCl3為復(fù)合催化體系，在溫度200 ℃下反應(yīng)15 min制得，經(jīng)HPLC測(cè)定無雜峰，符合定性要求)；甲醇、乙腈(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司).

2 方法

2.1 古法炮制[3-4]

鮮地黃洗凈，毛刷去皮，竹刀切片，晾至八成干，制得生地黃.將適量黃酒與生地黃倒入壇中，用糯米制泥封口，燜蒸24 h，取出，曬至八成干，同上繼續(xù)蒸曬，重復(fù)3次，制得熟地黃.

2.2 樣品制備

將干燥后的各類地黃分別研磨粉碎為粗粉，即粒度范圍控制在能全部通過二號(hào)篩.精密稱取藥材粉末1.0 g，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流提取1.5 h，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL，旋蒸濃縮至近干，殘?jiān)皿w積分?jǐn)?shù)15%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，定容，搖勻，經(jīng) 0.45 μm 濾膜過濾，備用.

2.3 色譜條件

Welchrom C18色譜柱 (4.6 mm × 250 mm，5 μm )，流速1.0 mL/min，生地黃檢測(cè)波長(zhǎng)為210、334 nm，熟地黃檢測(cè)波長(zhǎng)為334、284 nm，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量20 μL.二元梯度洗脫，流動(dòng)相A為乙腈，B為體積分?jǐn)?shù)0.1% 磷酸水溶液(洗脫程序：0～5 min，1%A；5～10 min，1%～4%A；10～22 min，4%～6%A；22～30 min，6%～18%A ；30～60 min，18%～25%A；60～80 min，25%～35%A).

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

取同一樣品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行HPLC分析，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄保留時(shí)間及各峰峰面積.

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一藥材5份，按“2.2”項(xiàng)下方法操作，制備樣品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行HPLC分析，記錄保留時(shí)間及各峰峰面積.

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

同一樣品溶液，室溫存放，分別于0、4、8、12、24、48 h，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行HPLC分析，記錄保留時(shí)間及各峰峰面積.

3 結(jié)果與分析

3.1 古法炮制地黃與市售地黃性狀對(duì)比

古法竹刀制生地黃與市售生地黃，古法炮制熟地黃與市售熟地黃在性狀上均存在較大差異，對(duì)比圖如圖1.

a.竹刀制生地黃；b.市售生地黃；c.古法制熟地黃；d.市售熟地黃.

由圖1中a、b可以看出，市售生地黃呈深棕色，而竹刀切制的生地黃顏色明顯較淺.推測(cè)可能是市售生地黃接觸鐵器，使某些化學(xué)成分發(fā)生變化而使得其顏色變深.由圖中c、d可看出，2種熟地黃表面皆是烏黑色，但古法制熟地黃有光澤，并且與市售熟地黃相比黏性大，質(zhì)柔軟而帶韌性，不易折斷.

3.2 色譜條件的建立及優(yōu)化

210、334 nm分別是2015年版《中國藥典》規(guī)定的生、熟地黃檢測(cè)成分梓醇、毛蕊花糖苷的吸收波長(zhǎng)[1].284 nm是5-HMF的檢測(cè)波長(zhǎng)，它是文獻(xiàn)[5]報(bào)道地黃炮制前后變化最顯著的成分之一.因此，本實(shí)驗(yàn)參考2015年版《中國藥典》生、熟地黃的含量測(cè)定色譜條件，并對(duì)流動(dòng)相梯度程序進(jìn)行優(yōu)化，以獲得盡量多的共有峰信息，最終確定的色譜條件見2.3.采用多個(gè)波長(zhǎng)進(jìn)行分析，樣品間可識(shí)別的共有峰增加，能更準(zhǔn)確地反映藥材間的差異.

3.3 方法學(xué)驗(yàn)證

在精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中，測(cè)得其共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD均在1.1%和4.7%以內(nèi)，表明儀器的精密度和方法重復(fù)性良好，樣品在室溫下48 h內(nèi)穩(wěn)定.

3.4 生地黃樣品測(cè)定

取“2.2”項(xiàng)下生地黃樣品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行HPLC分析.生地黃代表性HPLC指紋圖譜見圖2、3、4、5.

通過向樣品中添加對(duì)照品來確定樣品中的梓醇和毛蕊花糖苷峰.在210 nm下，生地黃共11個(gè)共有峰(圖2)，所有批次梓醇峰面積比較見圖3.由圖3可見，古法制生地黃梓醇峰面積整體高于市售生地黃.在334 nm波長(zhǎng)下，共7個(gè)共有峰(圖4)，由圖5可看出，古法制生地黃(Ⅷ-Ⅹ)中毛蕊花糖苷峰面積皆遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他批次藥材.利用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件(2004版A)對(duì)不同波長(zhǎng)下的地黃HPLC指紋圖譜進(jìn)行了相似度分析，發(fā)現(xiàn)在210 nm下，除生地黃Ⅱ外，其余批次相似度皆大于0.873；在334 nm下，除生地黃Ⅱ外，其余皆大于0.823，生地黃Ⅱ的梓醇和毛蕊花糖苷含量都很低，這可能是由于藥材本身的品質(zhì)差異或炮制儲(chǔ)藏不當(dāng)造成的.相對(duì)來說，3批古法制生地黃的相應(yīng)成分含量較高.

a.生地黃Ⅰ；b.生地黃Ⅷ；1.梓醇

圖3 所有批次生地黃梓醇峰面積比較

a.生地黃Ⅰ；b.生地黃Ⅷ；2.毛蕊花糖苷

圖5 所有批次生地黃毛蕊花糖苷峰面積比較

3.5 熟地黃樣品測(cè)定

取“2.2”項(xiàng)下熟地黃樣品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行HPLC分析.熟地黃藥材代表性HPLC指紋圖譜見圖6、7、8、9.

334 nm下熟地黃共有峰有8個(gè)(圖6)，由圖7可知，古法制熟地黃中毛蕊花糖苷峰面積均明顯高于各批次市售熟地黃，此波長(zhǎng)下指紋圖譜相似性皆大于0.874.在284 nm下，熟地黃指紋圖譜差異較大，共有峰少，并且其相似度較低，在0.555～0.659內(nèi)，見圖8.由圖9可知，市售熟地黃的5-HMF峰面積皆遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于自制熟地黃，其中熟地黃Ⅲ的峰面積甚至達(dá)到2×107.

熟地黃中的5-HMF主要來自于炮制加熱過程中單糖的脫水轉(zhuǎn)化，加熱時(shí)間和溫度對(duì)其產(chǎn)生量有重要影響.在較短的時(shí)間內(nèi)單糖不斷脫水轉(zhuǎn)化，表現(xiàn)為5-HMF隨加熱時(shí)間的延長(zhǎng)而增加[10]，但本文所制熟地黃中5-HMF含量極低，可能主要是因?yàn)楸疚牡墓欧ǖ攸S炮制方式歷時(shí)較長(zhǎng)，在長(zhǎng)時(shí)間的蒸曬過程中，轉(zhuǎn)化相對(duì)較完全的5-HMF本身不穩(wěn)定，易發(fā)生降解，并且5-HMF可隨水蒸氣揮發(fā)[11]，最終導(dǎo)致5-HMF含量大幅減少[12].

a.熟地黃Ⅰ；b.熟地黃Ⅷ； 2.毛蕊花糖苷

研究表明，5-HMF對(duì)眼睛、黏膜和皮膚有刺激性，能與人體蛋白質(zhì)結(jié)合引起中毒，造成橫紋肌麻痹和內(nèi)臟損害，并且具有神經(jīng)毒性，還具有潛在的遺傳及生殖毒性[13-14].同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)5-HMF存在一定的藥理活性，如降血糖[15]、改善學(xué)習(xí)記憶[16]、抗心肌缺血[17]等.5-HMF既有一定毒性，同時(shí)又有某些藥理活性，因此，該成分對(duì)熟地黃功效和毒副作用的綜合影響，以及對(duì)其含量控制指標(biāo)的制定尚有待進(jìn)一步探討.

圖7 所有批次熟地黃毛蕊花糖苷峰面積比較

a.熟地黃Ⅰ；b.熟地黃Ⅷ；3.5-HMF

3.6 鐵粉處理生地黃Ⅷ

上述結(jié)果表明，古法炮制生地黃和熟地黃中，梓醇和毛蕊花糖苷的含量明顯高于市售品，推測(cè)藥材與鐵器的接觸可能是導(dǎo)致這2個(gè)成分含量出現(xiàn)變化的主要原因，因?yàn)楣欧鞔_說明地黃的炮制“忌犯銅鐵器”而應(yīng)用竹刀切制.鐵作為催化劑可催化一些化學(xué)反應(yīng)，因此將竹刀切片制生地黃Ⅷ經(jīng)鐵粉處理，來考察其指紋圖譜的變化.處理過程：取少量生地黃Ⅷ放入燒杯中，加入少許鐵粉和水，紙封口，放置5 h后取出，置50℃烘箱中干燥，按“2.2”項(xiàng)下制備樣品溶液，進(jìn)行HPLC分析.HPLC指紋圖譜見圖10.

圖9 所有批次熟地黃5-HMF峰面積比較

1.梓醇; 2.毛蕊花糖苷.

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)與鐵粉接觸后，竹刀制生地黃藥材顏色加深，干燥后與市售生地黃藥材性狀接近.結(jié)合圖2、4和10可看出，生地黃經(jīng)鐵粉處理后，其梓醇、毛蕊花糖苷及其他共有峰峰面積較之前有所下降，說明鐵會(huì)催化生地黃中的某些化學(xué)反應(yīng)，加速某些成分含量改變，并使生地黃顏色變深，與筆者的推測(cè)基本一致.因此，在炮制生地黃藥材時(shí)應(yīng)遵循古法炮制原則，避免與鐵等金屬接觸，以防止其藥效成分降低或轉(zhuǎn)化.

4 結(jié)論

利用高效液相色譜指紋圖譜測(cè)定，考察了竹刀切制生地黃、古法制熟地黃與市售地黃藥材主要成分的含量差異，并對(duì)其原因進(jìn)行了初步探討.除地黃炮制中未注意避免接觸金屬器具外，現(xiàn)今市售熟地黃炮制亦時(shí)間較短且工藝多變，未做到古法中要求的多次蒸曬，使不同方法制得藥材間藥效成分含量差異較大.本文為地黃藥材的炮制規(guī)范化和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善提供借鑒，保證用藥的安全有效.

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(責(zé)任編輯：梁俊紅)

Component comparison of rehmanniae radix and rehmanniae radix praeparata between their ancient preparation and commercial medicines

YANG Feifei1,LI Shengnan1,GUO Huaizhong1,YANG Rumin2

( 1.College of Pharmacy,Hebei University,Baoding 071002,China; 2.Yiyuankang Traditional Chinese Medicine Co.Ltd.of Anguo,Anguo 071200,China )

The quality differences of rehmanniae radix and rehmanniae radix praeparata between their ancient preparation and commercial medicines were investigated by high performance liquid chromatography (HPLC) fingerprinting technology,providing reference for the improvement of their quality criterions and the study of their preparation processes of rehmanniae radix and rehmanniae radix praeparata.The samples were extracted with methanol and analyzed by HPLC.The chromatographic conditions were as follows:Welchrom C18 (4.6 mm × 250 mm,5 μm ) column;acetonitrile-0.1% phosphate solution (V/V) was used as mobile phase for gradient elution;multi-wavelength UV detector;the flow rate was 1.0 mL/min and the column temperature was 35 ℃;the injection volume was 20 μL.There were significant differences between the ancient preparation and commercial medicines through the comparison of their common peaks.The involved component contents,catalpol and acteoside of rehmanniae radix and rehmanniae radix praeparata from ancient preparation were higher than those of commercial medicines;while 5-HMF from ancient preparation were much lower than those of commercial medicines.The preparation processes of rehmanniae radix and rehmanniae radix praeparata are necessary to be further investigated and standardized to ensure their quality and efficacy.

rehmanniae radix;rehmanniae radix praeparata;fingerprints;HPLC;preparation process

10.3969/j.issn.1000-1565.2017.01.008

2016-07-06

河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(H2016201221)

楊飛飛(1988—)，女，山東濟(jì)南人，河北大學(xué)在讀碩士研究生.E-mail：524667972@qq.com

郭懷忠(1968—)，男，內(nèi)蒙古商都人，河北大學(xué)教授，博士，主要從事中藥質(zhì)量控制及藥效學(xué)研究. E-mail：ghuaizh@aliyun.com

O657.8

A

1000-1565(2017)01-0047-09