產(chǎn)堿桿菌DN25去除金礦廢水中的氰

尹業(yè)興，李青云，2，劉幽燕，2

（1. 廣西大學 化學化工學院，廣西 南寧 530004；2. 廣西生物煉制重點實驗室，廣西 南寧 530003）

產(chǎn)堿桿菌DN25去除金礦廢水中的氰

尹業(yè)興1，李青云1，2，劉幽燕1，2

（1. 廣西大學 化學化工學院，廣西 南寧 530004；2. 廣西生物煉制重點實驗室，廣西 南寧 530003）

采用產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes sp.）DN25去除金礦選礦廢水和礦渣浸出液中的氰。考察了菌株DN25的除氰效果，研究了DN25生長和降解活性的影響因素。實驗結(jié)果表明：利用DN25處理選礦廢水，當反應時間為23 h時，總氰質(zhì)量濃度分別從162.6，32.4，21.0，22.3 mg/L降至0，0.07，0，1.24 mg/L；利用DN25處理礦渣浸出液，當反應時間為25 h時，總氰質(zhì)量濃度分別從 4.4，8.8 mg/L降至0.37，0.38 mg/L；處理后兩種廢水的總氰質(zhì)量濃度均滿足GB 8978—1996《污水綜合排放標準》的要求；DN25可在初始總氰質(zhì)量濃度為10～30 mg/L且僅含碳源的條件下生長但存在24 h停滯期，而在初始總氰質(zhì)量濃度為5～20 mg/L且含碳、氮源的條件下沒有生長停滯期。

生物處理；金礦廢水；氰化物；產(chǎn)堿桿菌

氰化物常用于金礦提金，產(chǎn)生的廢水中除了含有游離氰和絡合氰［1］，還常有砷、鉛、鎘等有毒物質(zhì)［2］。據(jù)統(tǒng)計，我國僅黃金生產(chǎn)企業(yè)所排放含氰廢水就達1. 2×108m3/a［3］。當前金礦廢水中氰的去除方法主要有自然分解、化學處理、生物分解、電解氧化等方法［4-5］。相比于其他方法，生物分解法具有成本低、分解快且無二次污染物等諸多優(yōu)點［6］。2000年美國環(huán)境保護署（EPA）對生物法處理氰污染技術(shù)的評估［7］中指出，生物法是一種有前景的治理方法。盡管氰化物對大部分微生物具有毒性，但在自然界中仍存在可高效分解氰的微生物。目前，已報道的氰分解菌包括產(chǎn)堿菌（Alcaligenes. sp）、芽孢桿菌（Bacillus. sp）、假單胞菌（Pseudomonas. sp）和克雷伯氏桿菌（Klebsiella. sp）等［8］，這些微生物的存在為氰污染修復奠定了基礎。近十年來，我國有關(guān)氰化物生物處理的研究大部分還處于實驗室水平，對實際工業(yè)廢水處理的報道較少。郭訓文等［9］利用曝氣生物濾池（BAF）處理含氰電鍍廢水，當CN-初始質(zhì)量濃度低于35.34 mg/L時，出水CN-質(zhì)量濃度低于0.20 mg/L。上世紀80年代初，美國Homestake公司在南達科他州的鉛礦區(qū)運用48片生物轉(zhuǎn)盤（RBC）連續(xù)處理氰化物，總氰化物的去除率可達91.0%～99.5%［4］。

本工作對本實驗室前期從氰污染土壤中分離得到的一株高效分解氰的菌株DN25［10］，進一步探討該菌株對實際含氰廢水的處理效果，考察了該菌株對廢水中游離氰和總氰的分解情況，初步分析了實際含氰廢水對菌株生長、分解活性的影響，以期為生物法處理氰污染物的工程應用提供技術(shù)準備。

1 實驗部分

1.1 材料、試劑和儀器

選礦廢水： 采自廣西某金礦廠不同工段，共4個水樣（1#～4#）；礦渣浸出液：為云南某金礦廠礦渣經(jīng)去離子水4 ℃靜置浸取12 h后的浸出液（5#）。各水樣的廢水水質(zhì)見表1。

表1 廢水水質(zhì) mg/L

菌株：產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes sp.）DN25，由本實驗室自行篩選獲得。

LB培養(yǎng)基： NaCl 10 g，蛋白胨10 g，酵母粉5 g，蒸餾水1 000 mL， pH 8.0。固體平板培養(yǎng)基添加1.5%（w）瓊脂。該培養(yǎng)基用于菌體培養(yǎng)。

M9培養(yǎng)基：Na2HPO4·12H2O 17.1 g，KH2PO43 g，NaCl 0.5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 8.0。根據(jù)實驗目的，在M9培養(yǎng)基中分別外加碳源葡萄糖1.5 g及氮源氯化銨 0.27 g。將該培養(yǎng)基加入礦渣浸出液中，分別考察外加碳源、碳氮源條件下的菌株生長情況。

實驗所用試劑均為分析純。

723型可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；Optima 5300DV 型電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀：美國鉑金埃爾默儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 DN25菌體的培養(yǎng)

用接種環(huán)從平板培養(yǎng)基上挑取一環(huán)產(chǎn)堿桿菌DN25接種至100 mL滅菌的LB培養(yǎng)基中， 30 ℃、120 r/min恒溫搖床振蕩培養(yǎng)35 h，然后8 000 r/min離心20 min，收集菌體。再用pH 8.0、50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液洗滌菌體2次，取適量緩沖液重懸菌體，配制得到600 nm處光密度（OD600）為10.0的菌液，待用于氰分解實驗。

1.2.2 菌株DN25對水樣中氰的分解

在250 mL搖瓶中分別加入100 mL水樣，調(diào)節(jié)pH為8.0，然后投加5 mL菌液，使反應初始OD600為0.5，同時取樣測定初始游離氰及總氰質(zhì)量濃度。將瓶口密封，在30 ℃、120 r/min條件下進行分解反應，于設定的時間取樣測定殘余游離氰及總氰質(zhì)量濃度。

1.2.3 菌株DN25生長及活性的影響因素

按照文獻［10］方法制備種子液。在50 mL總氰質(zhì)量濃度分別稀釋為5，10，15，20，30 mg/L（游離氰質(zhì)量濃度分別為 3.5， 5.6， 8.9， 9.6， 12.3 mg/ L）的礦渣浸出液稀釋液中，按照1%的接種量接種（OD600=0.1）后，在與1.2.1節(jié)相同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)菌體，定時取樣，測定菌液的OD600值，同時監(jiān)測體系中游離氰的濃度變化。

將含有碳源或碳氮源的M9培養(yǎng)基加入到礦渣浸出液稀釋液中，按同樣方法考察菌株DN25的生長及活性變化。

1.3 分析方法

菌液濃度以OD600表征，采用723型可見分光光度計測定菌液在波長600 nm處的光密度值。游離氰和總氰質(zhì)量濃度的測定參照國家標準方法［11］。水質(zhì)分析采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀測定［12］。COD的測定采用快速消解分光光度法［13］。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株DN25對選礦廢水的除氰效果

菌株DN25對選礦廢水中游離氰的去除效果見圖1。由圖1可見：氰的分解過程主要發(fā)生在前30 min，其中1#水樣中氰的分解速率最快，30 min時游離氰去除率為90.2%，而2#、3#、4#的去除率分別為64.9%，43.5%，10.0%；反應至330 min時，游離氰質(zhì)量濃度分別為 3.0，5.8，4.2，10.0 mg/L，去除率分別為96.7%，74.5%，68.4%，31.8%。

圖1 菌株DN25對選礦廢水中游離氰的去除效果初始游離氰質(zhì)量濃度/（mg·L-1）：● 1#；■ 2#；▲ 3#；◆ 4#游離氰去除率/%：○ 1#；□ 2#；△ 3#；◇ 4#

當反應時間為23 h時，菌株DN25對選礦廢水中總氰的去除效果見表2。由表2可見，1#，2#，3#水樣的總氰去除率達99.7%以上，其中1#、3#水樣中的總氰能被菌株DN25完全去除，而4#水樣的總氰去除率為94.4%，剩余總氰質(zhì)量濃度為1.24 mg/ L，說明菌株DN25既能分解游離氰也能分解部分絡合氰化物，但對于Fe（CN）64-、Fe（CN）63-等可生物分解性差的絡合氰［14］的分解仍比較困難。處理后選礦廢水的總氰質(zhì)量濃度分別為 0，0.1，0，1.2 mg/L，滿足GB 8978—1996《污水綜合排放標準》的要求［15］。實驗結(jié)果初步顯示，產(chǎn)堿桿菌DN25對實際含氰廢水的處理具有一定應用潛力。

表2 菌株DN25對選礦廢水中總氰的去除效果

2.2 菌株DN25對礦渣浸出液的除氰效果

菌株DN25對礦渣浸出液中游離氰及總氰的去除效果分別見圖2及圖3。由圖2可見，相比于選礦廢水，菌株DN25對礦渣浸出液中游離氰的分解較為緩慢，30 min時的游離氰去除率僅為32.7%，反應至480 min時，游離氰去除率也僅為47.4%，這可能是由于礦渣浸出液中重金屬離子如As2+、Zn2+等對菌株活性存在更強的抑制作用。Jandhyala等［16］研究發(fā)現(xiàn)，當溶液中單獨存在200 μmol/L的 Pb2+或Zn2+時便會抑制菌株中氰分解酶的活力，使其降低25%以上。菌株對總氰的分解也具有相類似的情況。由圖3可見，反應15 h后的總氰去除率為40.0%，反應44 h后的總氰去除率為42.3%。為了提高總氰的去除率，反應44 h時追加等量菌體，反應至88 h時，總氰去除率為51.2%，處理效果仍然不理想。

圖2 菌株DN25對礦渣浸出液中游離氰的去除效果

圖3 菌株DN25對礦渣浸出液中總氰的去除效果

嘗試采用稀釋的策略來降低礦渣浸出液中有毒物質(zhì)對菌株降解活性的影響。產(chǎn)堿桿菌DN25對礦渣浸出液稀釋液中總氰的去除效果見表3。由表3可見：當水樣中初始總氰質(zhì)量濃度大于10 mg/L時，總氰去除率只能維持在75%左右，這可能是由于水樣中有毒物質(zhì)仍然對菌株活力具有抑制作用；當初始總氰質(zhì)量濃度為8.8 mg/L時，總氰去除率可提高至95.6%，反應后總氰質(zhì)量濃度為0.38 mg/L，低于排放標準；然而將初始總氰質(zhì)量濃度降至4.4 mg/L時，菌株也并不能將氰完全降解，初步分析認為該部分氰可能是產(chǎn)堿桿菌DN25所不能分解的絡合氰。

2.3 菌株DN25生長及活性的影響因素

2.3.1 總氰質(zhì)量濃度的影響

礦渣浸出液初始總氰質(zhì)量濃度對OD600的影響見表4。由表4可見，在80 h的培養(yǎng)時間內(nèi)各礦渣浸出液稀釋液的OD600基本無變化，培養(yǎng)至100 h時還略有下降，說明菌株DN25在此期間基本不能增殖。

表3 產(chǎn)堿桿菌DN25對礦渣浸出液稀釋液中總氰的去除效果

礦渣浸出液初始總氰質(zhì)量濃度對游離氰質(zhì)量濃度的影響見圖4。

表4 礦渣浸出液初始總氰質(zhì)量濃度對OD600的影響

由圖4可見，各礦渣浸出液稀釋液中游離氰的分解在35 h后趨于平穩(wěn)， 80 h后的游離氰質(zhì)量濃度分別為1.8，2.9，5.0，6.4，10.0 mg/L，游離氰去除率僅分別為50.4%、49.4%、46.1%、37.4%和28.9%，說明礦渣浸出液的條件不適合菌株生長及活性的發(fā)揮。因此考慮采用生物刺激的辦法進行改善。

2.3.2 碳源的影響

由于實驗菌株能以CN-為唯一氮源生長［17］，因此首先在礦渣浸出液中添加碳源葡萄糖，并監(jiān)測菌株DN25的生長情況。礦渣浸出液添加碳源對OD600的影響見圖5。由圖5可見：當初始總氰質(zhì)量濃度為5 mg/L時，菌株生長不存在停滯期，80 h后到達穩(wěn)定期；初始總氰質(zhì)量濃度為10 mg/L和15 mg/L時，菌體需經(jīng)過24 h的停滯期才開始生長，初步分析認為停滯期是菌株自身的解毒過程；當初始總氰質(zhì)量濃度為20 mg/L和30 mg/L時，菌體則需要60 h的停滯期后才開始生長，說明初始總氰質(zhì)量濃度超過5 mg/L時即對菌株DN25的生長產(chǎn)生抑制，且隨著總氰質(zhì)量濃度的增大，菌株自身解毒所需時間也越長。對比表4與圖5可確定，外加碳源葡萄糖對菌株DN25的生長具有一定的促進作用，這為后期構(gòu)建生物反應器長效處理氰污染提供了可能。

圖5 礦渣浸出液添加碳源對OD600的影響

礦渣浸出液添加碳源對游離氰質(zhì)量濃度的影響見圖6。由圖6可見：游離氰的分解趨勢與菌株的生長規(guī)律相符合，初始總氰質(zhì)量濃度為10～30 mg/L時，菌株進入停滯期進行自身解毒，此時游離氰質(zhì)量濃度呈下降趨勢，反應24 h時游離氰質(zhì)量濃度降低至5 mg/L，此時氰的抑制作用緩解，菌株開始生長；當反應時間接近60 h時，菌株對初始總氰質(zhì)量濃度為10 mg/L和15 mg/L水樣中的游離氰基本降解完全，初始總氰質(zhì)量濃度為20 mg/L和30 mg/L水樣的游離氰質(zhì)量濃度分別為 2.2 mg/L和 5.5 mg/L，游離氰去除率分別為74.0%和52.6%；繼續(xù)培養(yǎng)至102 h時，菌株將游離氰分解完全，此時礦渣浸出液中基本監(jiān)測不到剩余游離氰。與圖4中游離氰的分解情況對比，說明碳源對菌株DN25的降氰活性具有促進作用。

圖6 礦渣浸出液添加碳源對游離氰質(zhì)量濃度的影響

2.3.3 碳氮源的影響

為進一步提高菌株的生長速率、縮短氰的分解時間，在礦渣浸出液中同時添加碳源葡萄糖和氮源氯化銨。礦渣浸出液同時添加碳源和氮源對OD600的影響見圖7。

圖7 礦渣浸出液同時添加碳源和氮源對OD600的影響

由圖7可見：同時添加碳氮源能顯著促進菌株的生長，與外加碳源時相比，初始總氰質(zhì)量濃度為10 mg/L和20 mg/L的礦渣浸出液中，菌株不經(jīng)過停滯期直接生長；與圖5相比，24 h時3種礦渣浸出液稀釋液的OD600都比單獨外加碳源時提高了1倍。

礦渣浸出液同時添加碳源和氮源對游離氰質(zhì)量濃度的影響見圖8。由圖8可見：反應時間為67 h時，初始總氰質(zhì)量濃度為5 mg/L和15 mg/L的礦渣浸出液的游離氰質(zhì)量濃度均為0，游離氰去除率均為100%，比外加碳源時所需的時間大約縮短了7 h；初始總氰質(zhì)量濃度為20 mg/L的礦渣浸出液的游離氰質(zhì)量濃度為 1.3 mg/L，游離氰去除率可提高至87%。與圖6相比，同時添加碳氮源的策略比單獨添加碳源更能有效提高菌株的生長速率、縮短氰分解時間，為未來高效生物反應器的長效運行奠定了基礎。

圖8 礦渣浸出液同時添加碳源和氮源對游離氰質(zhì)量濃度的影響

3 結(jié)論

a）產(chǎn)堿桿菌DN25可以高效去除金礦選礦廢水中的氰。在反應時間為330 min時，游離氰質(zhì)量濃度分別從 92.6，22.6，13.3，14.7 mg/L降至3.0，5.8，4.2，10.0 mg/L；在反應時間為23 h時，總氰質(zhì)量濃度分別從162.6，32.4，21.0，22.3 mg/L降至0，0.07，0，1.24 mg/L，滿足GB 8978—1996《污水綜合排放標準》的要求。

b）采用產(chǎn)堿桿菌DN25處理礦渣浸出液。當初始總氰、游離氰質(zhì)量濃度分別為96.0 mg/L 和57.2 mg/L、反應時間為分別為8 h和88 h時，處理效果不理想；當初始總氰質(zhì)量濃度分別為4.4 mg/L 和8.8 mg/L、反應時間為 25 h時，處理后礦渣浸出液總氰質(zhì)量濃度分別為0.37 mg/L 和0.38 mg/L，滿足GB8978—1996《污水綜合排放標準》的要求。

c）對礦渣浸出液中外加碳源且初始總氰質(zhì)量濃度為10～30 mg/L時，產(chǎn)堿桿菌 DN25有24 h的生長停滯期，102 h時游離氰去除率達100%；同時投加碳氮源且總氰濃度為5～20 mg/L時，產(chǎn)堿桿菌DN25沒有生長停滯期，67 h后游離氰的去除率達到87%以上。

［1］ Acheampong M A，Meulepas R J W，Lens P N L. Removal of heavy metals and cyanide from gold mine wastewater［J］. J Chem Technol Biotechnol，2010，85（5）：590 - 613.

［2］ Luque-Almagro V M，Moreno-Vivian C，Roldan M D. Biodegradation of cyanide wastes from mining and jewellery industries［J］. Curr Opin Biotechnol，2016，38：9 - 13.

［3］ 任小軍，李彥鋒，趙光輝，等. 工業(yè)含氰廢水處理研究進展［J］. 工業(yè)水處理，2009，29（8）：1 - 4.

［4］ Kuyucak N，Akcil A. Cyanide and removal options from ef fl uents in gold mining and metallurgical processes［J］. Miner Eng，2013，50/51：13 - 29.

［5］ 范文玉，王紅，夏洪娟，等. 絡合沉淀—Fenton試劑氧化法處理高濃度含氰廢水［J］. 化工環(huán)保，2015，35（1）：44 - 48.

［6］ 鄭偉，周林成，徐艷艷，等. 含氰化物廢水生物處理研究進展［J］. 化工環(huán)保，2011，31（2）：123 - 128.

［7］ Environmental Protection Agency. SITE technology capsule：Pintail Systems Inc’.s aqueous biocyanide process［EB/OL］. Washington：Biblio Gov，2000： 2-4（2000-5）［2016-04-21］. http：//webharvest.gov/ peth04/20041108152202/. EPA #540/R-00/501a.

［8］ Martínková L，Veselá1 A B，Rinágelová A，et al. Cyanide hydratases and cyanide dihydratases：emerging tools in the biodegradation and biodetection of cyanide［J］. Appl Microbiol Biotechnol ，2015，99（21）：8875 - 8882.

［9］ 郭訓文，汪曉軍，林旭龍. 曝氣生物濾池處理含氰廢水的啟動性能及污染物去除特性［J］. 化工進展，2013，32（1）：222 - 226.

［10］ 汪艷華，劉幽燕，唐愛星，等. 產(chǎn)堿桿菌DN25中降氰酶的分離純化及生化特性［J］. 應用與環(huán)境生物學報，2012，18（1）：108 - 114.

［11］ 環(huán)境保護部. HJ 484—2009 水質(zhì)氰化物的測定 容量法和分光光度法［S］. 北京：中國環(huán)境科學出版社，2009.

［12］ 王明輝，晏波，麥戈，等. 分步沉淀法處理酸性礦山廢水［J］. 化工環(huán)保，2016，36（1）：47 - 52.

［13］ 環(huán)境保護部．HJ/T 399—2007 化學需氧量的測定 快速消解分光光度法［S］．北京：中國環(huán)境科學出版社，2008.

［14］ Ebbs S. Biological degradation of cyanide compounds［J］. Curr Opin Biotechnol，2004，15（3）： 231 -236.

［15］ 原國家環(huán)境保護局. GB 8978—1996 污水綜合排放標準［S］. 北京：中國標準出版社，1996.

［16］ Jandhyala D M，Willson R C，Sewell B T，et al. Comparison of cyanide-degrading nitrilases［J］. Appl Microbiol Biotechnol，2005，68（3）：327 - 335.

［17］ 陳煥基. 產(chǎn)堿桿菌DN25的氰代謝機理研究及其降氰酶的克隆和表達［D］. 南寧：廣西大學， 2014.

（編輯 葉晶菁）

Removal of cyanide from gold mining wastewater using Alcaligenes sp. DN25

Yin Yexing1，Li Qingyun1，2，Liu Youyan1，2
（1. School of Chemistry and Chemical Engineering，Guangxi University，Nanning Guangxi 530004，China；2. Guangxi Key Laboratory of Biore fi nery，Nanning Guangxi 530003，China）

Cyanide was removed from gold mining wastewater and slag leaching solution using Alcaligenes sp. DN25. The cyanide removal effect and the factors affecting the growth and degradation activity of DN25 were investigated. The experimental results show that：When the gold mining wastewater has treated by using DN25 for 23 h，the total cyanide mass concentration is decreased from 162.6，32.4，21.0，22.3 mg/L to 0，0.07，0，1.24 mg/L，respectively；When the slag leaching solution has treated by using DN25 for 25 h，the total cyanide mass concentration is decreased from 4.4，8.8 mg/L to 0.37，0.38 mg/L，respectively；The total cyanide mass concentrations of the two kinds of wastewater both meet the national discharge standard of GB 8978-1996；Under the conditions of initial total cyanide mass concentration 10-30 mg/L and carbon source added only，DN25 can grow after a lag phase of 24 h，however，it can grow without lag phase when the initial total cyanide mass concentration is 5-20 mg/L and carbon and nitrogen sources are added.

biological treatment；gold mining wastewater；cyanide；Alcaligenes sp.

X703.1

A

1006-1878（2017）01-0049-06

10.3969/j.issn.1006-1878.2017.01.009

2016 - 05 - 17；

2016 - 09 - 14。

尹業(yè)興（1990— ），男，廣西壯族自治區(qū)百色市人，碩士生，電話 18776966944，電郵 yinyexingzou@163.com。聯(lián)系人：李青云，電話 18978903227，電郵 qyli@gxu.edu.cn。

國家自然科學基金項目（51108098）。