青蒿琥酯對(duì)耐地塞米松的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株增殖及NF-κB p65、P-gp表達(dá)影響

歐瑞明，周長(zhǎng)華，譚友平，劉爽，鐘啟，張青，杜苑苑，鄭麗玲(廣東省第二人民醫(yī)院，廣州 510317)

青蒿琥酯對(duì)耐地塞米松的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株增殖及NF-κB p65、P-gp表達(dá)影響

歐瑞明，周長(zhǎng)華，譚友平，劉爽，鐘啟，張青，杜苑苑，鄭麗玲
(廣東省第二人民醫(yī)院，廣州 510317)

目的 探討青蒿琥酯對(duì)耐地塞米松人多發(fā)性骨髓瘤(MM)細(xì)胞株MM.1R增殖的影響，并探討其可能作用機(jī)制。方法 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MM.1S、對(duì)塞米松敏感的MM細(xì)胞株MM.1R，各分為空白對(duì)照組、地塞米松組、青蒿琥酯組、地塞米松+青蒿琥酯組，分別加入等量培養(yǎng)液、20 ng/mL的地塞米松、25μg/mL的青蒿琥酯、20 ng/mL的地塞米松+25μg/mL的青蒿琥酯，觀測(cè)各組細(xì)胞增殖情況，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。取MM.1R細(xì)胞加入終濃度為25μg/mL的青蒿琥酯，分別于給藥前、給藥24 h、給藥48 h檢測(cè)細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子κB (NF-κB) p65蛋白、P糖蛋白(P-gp)蛋白的表達(dá)。結(jié)果 給藥24 h時(shí)，MM.1S細(xì)胞地塞米松組、青蒿琥酯組、地塞米松+青蒿琥酯組的細(xì)胞增殖抑制率分別為20.41%±2.75%、29.07%±2.71%、68.92%±4.12%，組間兩兩比較，P均<0.05；給藥24 h，MM.1R細(xì)胞地塞米松組、青蒿琥酯組、地塞米松+青蒿琥酯組的細(xì)胞增殖抑制率分別對(duì)為4.13%±3.10%、27.43%±2.67%、60.14±3.24%，組間兩兩比較，P均<0.05；青蒿琥酯給藥前、給藥24 h、給藥48 h， MM.1R細(xì)胞NF-κB p65蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.89±0.21、0.42±0.13、0.23±0.08；P-gp蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.86±0.19、0.43±0.13、0.25±0.09，隨干預(yù)時(shí)間增加，MM.1R細(xì)胞NF-κB p65、P-gp蛋白的相對(duì)表達(dá)量均降低(P均<0.05)。結(jié)論 青蒿琥酯可抑制MM.1S以及MM.1R細(xì)胞的增殖，與地塞米松聯(lián)用有協(xié)同效應(yīng)。青蒿琥酯抑制MM.1R細(xì)胞增殖的機(jī)制可能為下調(diào)NF-κB p65、P-gp蛋白的表達(dá)。

青蒿琥酯；多發(fā)性骨髓瘤；細(xì)胞增殖；核轉(zhuǎn)錄因子κB p65蛋白；P糖蛋白

多發(fā)性骨髓瘤(MM)約占血液系惡性腫瘤10%，近年發(fā)病率逐年上升?；?、造血干細(xì)胞移植是MM的主要治療方法，地塞米松是常用的MM化療藥物。硼替佐米、來那度胺等新藥及大劑量化療藥物聯(lián)合自體造血干細(xì)胞移植是新興的MM治療方法，大大提高了MM患者的病情緩解率及患者生存期。但MM細(xì)胞易產(chǎn)生耐藥性，多數(shù)患者治療后容易發(fā)生MM復(fù)發(fā)(或難治)[1]。發(fā)掘能克服MM耐藥的新藥物或治療新方案，提高復(fù)發(fā)(或難治)MM的療效是目前的研究熱點(diǎn)。青蒿琥酯是我國(guó)傳統(tǒng)抗瘧中藥,最新研究發(fā)現(xiàn)其具有廣泛的抗腫瘤活性，對(duì)肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等實(shí)體瘤以及白血病、淋巴瘤、骨髓瘤等血液系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞均有一定的增殖抑制作用，并具與傳統(tǒng)抗腫瘤藥物無交叉耐藥，且能逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的優(yōu)點(diǎn)[2，3]。目前關(guān)于青蒿琥酯對(duì)地塞米松耐藥的人MM細(xì)胞株抗腫瘤作用的相關(guān)報(bào)道較少。本研究探討了青蒿琥酯對(duì)地塞米松耐藥(MM.1R)、地塞米松敏感(MM.1S)的人MM細(xì)胞株細(xì)胞增殖的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、材料及試劑 地塞米松耐藥(MM.1R)、地塞米松敏感(MM.1S)性人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株來源于ATCC細(xì)胞庫(kù)，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3～4天換液傳代1次。核轉(zhuǎn)錄因子κB (NF-κB)p65蛋白、P糖蛋白(P-gp)、GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；注射用青蒿琥酯為桂林南藥股份有限公司生產(chǎn)(批號(hào)H10930195)。

1.2 青蒿琥酯對(duì)MM.1S、MM.1R細(xì)胞增殖的影響觀察 分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MM.1S、MM.1R細(xì)胞，胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞懸浮液濃度為5×104/mL，100 μL/孔接種于96孔板，孵育24 h，將MM.1S、MM.1R細(xì)胞各分為對(duì)照組和觀察組(地塞米松組、青蒿琥酯組、地塞米松+青蒿琥酯組)，分別加入等量培養(yǎng)液、終濃度20 ng/mL的地塞米松、終濃度25 μg/mL的青蒿琥酯、終濃度20 ng/mL的地塞米松+終濃度25 μg/mL的青蒿琥酯，每組3個(gè)復(fù)孔，終體積為200 μL。采用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖抑制情況。所有操作均嚴(yán)格按照使用說明書進(jìn)行。采用酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)處的吸光度值(A570)，重復(fù)3次，取平均值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=(1-A觀察組/A對(duì)照組)×100%。

1.3 青蒿琥酯對(duì)MM.1R細(xì)胞p65、P-gp蛋白表達(dá)的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MM.1R細(xì)胞，分別于給藥前、給藥24 h、給藥48 h采用Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞NF-κB p65、P-gp蛋白的表達(dá)。取各組細(xì)胞, 冰上裂解細(xì)胞，采用BCA法提取總蛋白，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗(NF-κB p65、P-gp、GAPDH抗體)4 ℃孵育過夜，加入二抗室溫孵育2 h，ECL顯色，膠片曝光，掃描成像。采用Gelpro軟件測(cè)量目的條帶的灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，以目的蛋白與GAPDH灰度值之比作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖抑制率比較 各組細(xì)胞增殖抑制率比較見表1、2。

表1 MM.1R細(xì)胞增殖抑制率比較(%，±s)

注：與地塞米松組比較，*P<0.05；與青蒿琥酯組比較，#P<0.05。

表2 MM.1S細(xì)胞增殖抑制率比較(%，±s)

注：與地塞米松組比較，*P<0.05；與青蒿琥酯組比較，#P<0.05。

2.2 不同給藥時(shí)間MM.1R細(xì)胞 p65、P-gp蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 給藥前、給藥24 h、給藥48 h，MM.1R細(xì)胞p65蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.89±0.21、0.42±0.13、0.23±0.08。給藥前、給藥24 h、給藥48 h，MM.1R細(xì)胞P-gp蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.86±0.19、0.43±0.13、0.25±0.09。隨干預(yù)時(shí)間增加，MM1.R細(xì)胞NF-κB p65、P-gp蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低(P均<0.05)。

3 討論

MM細(xì)胞容易發(fā)生耐藥。雖然來那度胺、硼替佐米等新藥與傳統(tǒng)化療藥物的聯(lián)合使用對(duì)克服MM耐藥有一定成效，但也面臨毒性作用加大、治療費(fèi)用增加等諸多問題。研究表明，青蒿琥酯能夠抑制MM細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，不但對(duì)正常組織細(xì)胞的毒性很低，而且與傳統(tǒng)化療藥物無交叉耐藥，能增加MM細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，逆轉(zhuǎn)MM細(xì)胞多藥耐藥性[4]。地塞米松作為經(jīng)典的抗MM治療藥物，即使在目前MM治療的新藥時(shí)代，仍是各種MM治療方案中的基礎(chǔ)用藥之一。本實(shí)驗(yàn)中選取的MM.1細(xì)胞株建株于一IgA型MM患者的外周血，其亞系糖皮質(zhì)激素敏感的細(xì)胞系MM.1S和耐藥的細(xì)胞系MM.1R均來源于這一母系，分別代表了MM進(jìn)展的不同階段，是研究MM疾病進(jìn)展和耐藥的理想模型[5]。

青蒿琥酯作為我國(guó)擁有完全自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的傳統(tǒng)中藥衍生物，具有低毒、價(jià)廉的優(yōu)點(diǎn)，是一種理想的抗腫瘤藥物增敏劑，與常規(guī)抗骨髓瘤藥物聯(lián)合使用有可能進(jìn)一步提高耐藥MM的療效。既往的研究顯示，青蒿琥酯能通過介導(dǎo)MM細(xì)胞G0/G1期阻滯、抑制MM細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡、抑制MM血管新生、逆轉(zhuǎn)MM細(xì)胞多藥耐藥等多種機(jī)制，抑制多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生、發(fā)展[4]。本研究結(jié)果顯示，青蒿琥酯對(duì)MM.1R具有增殖抑制作用，能降低其NF-κB p65及P-gp的表達(dá)，并且其抑制率與MM.1S相近，提示其抗腫瘤效應(yīng)與地塞米松不存在交叉耐藥，而青蒿琥酯與地塞米松聯(lián)合用藥，抑制率較單藥明顯升高，提示兩藥聯(lián)合有良好的協(xié)同效應(yīng)，能克服MM細(xì)胞的耐藥性。MM細(xì)胞的耐藥機(jī)制較為復(fù)雜，且耐藥多表現(xiàn)為多耐藥反應(yīng)(MDR)，目前認(rèn)為主要與多藥耐藥基因(MDR1)的過度表達(dá)、凋亡調(diào)控基因介導(dǎo)機(jī)制等有關(guān)，其中最主要的耐藥機(jī)制是NF-κB通路的活化，使得受NF-κB調(diào)控的下游基因如MDR1、Bcl-2表達(dá)增加[6]。研究表明，NF-κB通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管新生等多種機(jī)制在MM的發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用，并與MM細(xì)胞多藥耐藥的發(fā)生密切相關(guān)[7]。細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)啟動(dòng)子上含有兩個(gè)NF-κB結(jié)合位點(diǎn)，NF-κB可促進(jìn)CyclinD1的表達(dá)，從而促使細(xì)胞由G0/G1期向S期轉(zhuǎn)化，加速細(xì)胞周期，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。此外，NF-κB還可以通過上調(diào)其下游抗凋亡因子的水平來發(fā)揮抗凋亡作用，其中包括Bcl-2蛋白家族，細(xì)胞凋亡抑制蛋白家族、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子家族等。研究還發(fā)現(xiàn)，NF-κB活化伴隨各種血管生成因子的活化，如成纖維生長(zhǎng)因子、血管生成衍生生長(zhǎng)因子、基質(zhì)金屬蛋白酶等，能促進(jìn)腫瘤血管的生成。耐藥的產(chǎn)生是導(dǎo)致MM治療失敗的重要原因，其中P-gp介導(dǎo)的多藥耐藥途徑是腫瘤細(xì)胞最為經(jīng)典的耐藥機(jī)制，由MDRl編碼的P-gp是一種跨膜蛋白，具有能量依賴性外排泵功能，能夠降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度從而產(chǎn)生多藥耐藥。MDR1啟動(dòng)區(qū)域的第1個(gè)外顯子包含1個(gè)純化的NF-κB結(jié)合序列(5′-CCTYTCGGGG-3′)，MDR1作為NF-κB的下游基因，能夠被NF-κB激活，使得基因轉(zhuǎn)錄增加，P-gp合成增加而導(dǎo)致耐藥的發(fā)生[8～10]。研究[11]還發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯能下調(diào)MM細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，明顯抑制MM細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。研究[12，13]發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯還能通過下調(diào)VEGF的表達(dá)水平，抑制MM細(xì)胞誘導(dǎo)的的血管新生。進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯能下調(diào)耐藥蛋白P-gp的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)對(duì)阿霉素、米托蒽醌、依托泊苷和甲氨蝶呤等多藥耐藥的MM細(xì)胞株的耐藥性[14]。

除了抑制NF-κB通路活化之外，青蒿琥酯的抗骨髓瘤作用還有多種機(jī)制參與，其中誘導(dǎo)自由基的產(chǎn)生及氧化應(yīng)激方面值得關(guān)注。青蒿素類藥物中都含有獨(dú)特的過氧橋結(jié)構(gòu),在細(xì)胞內(nèi)二價(jià)鐵離子的催化作用下，青蒿素類藥物中的過氧橋發(fā)生裂解，產(chǎn)生大量以青蒿素碳原子為中心的自由基和活性氧簇(ROS),這種獨(dú)特的作用機(jī)制可能其是殺傷具有耐藥性的瘧疾和腫瘤細(xì)胞的作用基礎(chǔ)[15，16]。Papanikolaou等[17]研究證實(shí)，青蒿琥酯能通過增加細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，促進(jìn)線粒體膜間蛋白凋亡誘導(dǎo)因子及核酸內(nèi)切酶G釋放及核轉(zhuǎn)位，誘導(dǎo)耐藥MM細(xì)胞株發(fā)生Caspase非依賴性的凋亡，其效應(yīng)與細(xì)胞內(nèi)二價(jià)鐵離子水平密切相關(guān)，提示青蒿琥酯通過ROS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡亦可能是其克服MM細(xì)胞耐藥的重要作用機(jī)制之一。

綜上所述，青蒿琥酯可抑制MM.1S以及MM.1R細(xì)胞的增殖，下調(diào)MM.1R細(xì)胞NF-κB p65、P-gp蛋白的表達(dá)水平，抑制NF-κB活化、下調(diào)P-gp表達(dá)可能為青蒿琥酯克服MM細(xì)胞耐藥的機(jī)制之一，但其具體作用靶點(diǎn)以及對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)通路的影響仍有待進(jìn)一步研究。

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國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81400168)；廣東省醫(yī)學(xué)科研基金資助項(xiàng)目(A2013128)；廣東省中醫(yī)藥局科研課題(20131104)；廣東省第二人民醫(yī)院人才引進(jìn)基金項(xiàng)目(YY2014-002)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.07.010

R722.12

A

1002-266X(2017)07-0034-03

2016-09-17)