基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究石斛堿治療阿爾茲海默病的關(guān)鍵靶點(diǎn)

洪夢杰，于白音，劉洋洋，陳 娟，陳 潔

（1.河南科技職業(yè)大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，河南 周口 466000；2.韶關(guān)學(xué)院 廣東省粵北食藥資源利用與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 韶關(guān) 512005；3.興安盟食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，內(nèi)蒙古 烏蘭浩特 137400）

阿爾茲海默?。ˋlzheimer’s disease，簡稱AD）是發(fā)病于老年人群的一種常見的神經(jīng)退行性疾病，衰老和淀粉樣蛋白-β（Aβ）聚集等因素與AD 的發(fā)病密切相關(guān)［1-2］. AD 嚴(yán)重影響病患的生活質(zhì)量，是造成患者死亡的主要風(fēng)險因素［3］. 隨著人口老齡化程度的加深，AD 病患人數(shù)將進(jìn)一步增加. 金釵石斛（Dendrobium nobileLindl.）別名金釵石、扁金釵、扁黃草、扁草等，為蘭科石斛屬多年生附生草本植物，是中藥石斛的基源植物之一［4］. 其主要活性成分有生物堿類、酚類、多糖類、黃酮類、萜類等［5-7］. 生物堿類化合物是最早從石斛屬植物中分離到的化合物，是石斛中重要的活性成分［8-10］. 中華人民共和國藥典（2020 年版）將石斛堿（Dendrobine）作為金釵石斛的指標(biāo)性成分［11］. 現(xiàn)代藥理研究表明，石斛堿具有神經(jīng)保護(hù)［12-13］、抗氧化［14-15］、抗炎［16］和抗腫瘤［17］等功效，這些功效對治療AD 有著積極的意義，但石斛堿治療AD 的作用機(jī)理及分子機(jī)制尚未得到系統(tǒng)闡釋，還需進(jìn)一步探究［18-20］.

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于人工智能和大數(shù)據(jù)的一個藥物系統(tǒng)研究的新興交叉前沿學(xué)科，它是基于系統(tǒng)生物學(xué)理論，用生物信息學(xué)和網(wǎng)絡(luò)分析方法，通過構(gòu)建特定藥物的“藥物-靶點(diǎn)-疾?。ㄖ委熗罚敝g的網(wǎng)絡(luò)預(yù)測模型，預(yù)測藥物作用靶點(diǎn)，分析藥物的作用機(jī)制，為中藥復(fù)雜體系研究提供了新思路，可對石斛堿治療AD 的作用機(jī)理進(jìn)行系統(tǒng)的預(yù)測分析［21］. 為此，筆者借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，初步探尋石斛堿治療AD 的關(guān)鍵靶點(diǎn)和通路，為石斛堿的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 石斛堿治療AD 潛在靶點(diǎn)的獲取

將Dendrobine 輸入PubChem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行檢索，獲得石斛堿SMILES化學(xué)式，然后將該化學(xué)式上傳到Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫（http://www.swisstargetprediction.ch/），設(shè)置屬性為homo sapiens（人類），收集石斛堿靶點(diǎn)；在GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）中，以“Alzheimer’s disease”為關(guān)鍵詞搜索，篩選Relevance score＞1 的基因，獲得AD 靶點(diǎn)；將收集的石斛堿靶點(diǎn)和AD 靶點(diǎn)導(dǎo)入在線分析工具Venny 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），獲取石斛堿與AD的共同靶點(diǎn)，并繪制韋恩圖，以獲得石斛堿治療AD 的潛在靶點(diǎn).

1.2 石斛堿-AD 靶點(diǎn)蛋白互作（Protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將石斛堿與AD 的共同靶點(diǎn)上傳至STRING 11.5 數(shù)據(jù)庫（https://cn.string-db.org/），限定物種為“homo sapiens”，設(shè)置最低相互作用閾值的中等置信度（＞0.4），其余參數(shù)為默認(rèn)，得到PPI 數(shù)據(jù)，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1，運(yùn)用CytoNCA 插件［22］對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治觯?jì)算度中心性（Degree，DC）、介數(shù)中心性（Betweenness，BC）和接近中心性（Closeness，CC），篩選出同時滿足大于DC、BC 和CC 中位數(shù)的靶點(diǎn)，即為核心靶點(diǎn)，構(gòu)建核心靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)［23-24］.

1.3 核心靶點(diǎn)的GO 功能注釋和KEGG 通路富集分析

將篩選出的核心靶點(diǎn)上傳至DAVID 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp），進(jìn)行基因本體（Gene ontology，GO）功能注釋、京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析，以P<0.05 為篩選條件. 獲得生物過程（Biological process，BP）、細(xì)胞成分（Cellular component，Cc）、分子功能（Molecular function，MF）和KEGG 關(guān)鍵信號通路的富集信息，并在微生信網(wǎng)站（https://www.bioinformatics.com.cn/）對結(jié)果進(jìn)行可視化分析.

1.4 “石斛堿-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

將石斛堿、通路及其相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件，得到“石斛堿-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖. 利用插件CytoNCA 對網(wǎng)絡(luò)中成分節(jié)點(diǎn)進(jìn)行拓?fù)浞治?，反向篩選石斛堿治療AD 的關(guān)鍵靶點(diǎn).

2 結(jié)果與分析

2.1 石斛堿-AD 靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

經(jīng)收集篩選共獲得石斛堿靶點(diǎn)139 個，AD疾病靶點(diǎn)9 691 個，共有靶點(diǎn)125 個. 將共有靶點(diǎn)上傳至STRING 11.5 數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，共篩選出115 個靶點(diǎn)參與PPI 網(wǎng)絡(luò)，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件，利用CytoNCA 插件對網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行拓?fù)浞治?，篩選出24 個同時滿足大于DC、BC 和CC 中位數(shù)的靶點(diǎn)，見圖1.圖1 可以直觀地表明蛋白與蛋白的相互作用，線條越多表明與之相關(guān)的蛋白越多，蛋白之間的連線越粗表明蛋白之間的作用越強(qiáng)［23］.

圖1 核心靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)

2.2 GO 功能注釋和KEGG 通路富集分析

結(jié)果顯示，富集的GO 條目共140 條（P<0.05），其中，富集的BP 條目有79 條，主要包括興奮性突觸后電位（Excitatory postsynaptic potential）、化學(xué)性突觸傳遞（Chemical synaptic transmission）和神經(jīng)系統(tǒng)過程（Neurological system process）等；富集的CC（細(xì)胞成分）條目有35 條，富集部位涉及突觸后膜（Postsynaptic membrane），蛋白酶體復(fù)合物（Proteasome complex）和突觸（Synapse）等；富集的MF 條目有26 條，主要涉及配體門控離子通道活性（Igand-gated ion channel activity）、乙酰膽堿結(jié)合（Acetylcholine binding）和神經(jīng)遞質(zhì)受體活性（Neurotransmitter receptor activity）等.

同時，富集的KEGG 通路有27 條（P<0.05），主要包括阿爾茨海默?。ˋD）、帕金森病（Parkinson disease）、脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)（Spinocerebellar ataxia）和神經(jīng)變性途徑-多種疾?。⊿pinocerebellar ataxia）等. 將前10 條BP、Cc、MF 富集條目和前20 條KEGG 通路繪制氣泡圖見圖2 和圖3.

圖2 石斛堿治療AD 核心靶點(diǎn)GO 條目氣泡圖

圖3 石斛堿治療AD 核心靶點(diǎn)KEGG 通路氣泡圖

2.3 石斛堿-AD“石斛堿-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

將石斛堿、核心靶點(diǎn)和前20 條通路數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件，得到“石斛堿-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖 如圖4 所示，該網(wǎng)絡(luò)圖包含45 個節(jié)點(diǎn)和182 條邊. 通過對網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的拓?fù)浞治?，共有GRIN2B、G R I N 2 A、G R I N 1、P S M D 2、PSMC1、PSMC4、PSMD14、PSMC6和DRD2 等9 個靶點(diǎn)的數(shù)據(jù)均大于DC、BC 和CC 中位數(shù)，即為石斛堿治療AD 的關(guān)鍵靶點(diǎn).

圖4 “石斛堿-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

3 結(jié)論與討論

運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選石斛堿的作用靶點(diǎn)，篩選出石斛堿可能通過調(diào)節(jié)GRIN2B、GRIN2A、GRIN1、PSMD2、PSMC1、PSMC4、PSMD14、PSMC6 和DRD2 等 靶點(diǎn)來實(shí)現(xiàn)對AD 的治療作用. 其中， GRIN2B、GRIN2A 和GRIN1為NMDA 受體的不同亞基，NMDA 受體在全腦均有分布，是治療AD 的靶向受體［25-26］；DRD2 是一種多巴胺受體，Liu 等研究發(fā)現(xiàn)可通過調(diào)控DRD2/β-arrestin 2/PP2A/JNK 信號軸來改善Aβ1-42 誘導(dǎo)的小鼠神經(jīng)炎癥和記憶缺陷，石斛堿也可能通過作用于DRD2 信號軸來改善AD 的癥狀，從而實(shí)現(xiàn)對AD 的防治作用［27］. 但是局限于數(shù)據(jù)庫完整性、分析軟件和機(jī)體環(huán)境的差異，關(guān)于石斛堿治療AD 的作用機(jī)理還需要進(jìn)行進(jìn)一步的體內(nèi)、體外臨床實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，才能更好地指導(dǎo)石斛堿的開發(fā)和利用.