石墨碳納米材料光學性質(zhì)在生化傳感領域的應用

徐逸婷 陳 龍 陳 卓,*

(1湖南大學，化學生物傳感與計量學國家重點實驗室，長沙410006；2澳門大學科技學院，澳門999078)

石墨碳納米材料光學性質(zhì)在生化傳感領域的應用

徐逸婷1陳 龍2,*陳 卓1,*

(1湖南大學，化學生物傳感與計量學國家重點實驗室，長沙410006；2澳門大學科技學院，澳門999078)

石墨碳納米材料因其特殊的光學性質(zhì)而受到廣泛關注。石墨碳納米材料最引人注目的光學性質(zhì)之一是其獨特的拉曼性質(zhì)，作為拉曼探針，石墨碳納米材料在對于復雜生物樣品，極端測試條件和定量拉曼檢測方面都有很好的應用；除了拉曼性質(zhì)以外，單壁碳納米管(SWNTs)獨特的近紅外二區(qū)(NIR-II，1000－1700 nm)熒光性質(zhì)，具有穿透深度大、分辨率高的熒光成像特點，在生物活體成像領域也得到了很好的應用。除了光致發(fā)光特性，石墨碳納米材料還具有優(yōu)異的光熱轉(zhuǎn)換效應，同時具有比表面積大的特點，被廣泛應用在針對腫瘤的熱療及其它療法協(xié)同治療當中。除此之外，石墨碳納米材料還是一種高效的信號傳導基底，可以猝滅激發(fā)態(tài)的染料和光敏劑，利用該類性質(zhì)設計的生物傳感器和納米藥物，顯現(xiàn)出高靈敏、高選擇性的特點。本文主要結(jié)合本課題組的工作，總結(jié)和探討了石墨碳納米材料作為光學探針、光熱材料和信號傳遞基底在生化傳感領域的應用。

石墨碳納米材料；生化傳感；拉曼探針；分子檢測；光熱治療

1 引言

納米生物技術與納米醫(yī)學是納米科學與生命科學、醫(yī)學的前沿交叉領域，有著廣泛的發(fā)展應用前景。在已有的眾多研究中，納米材料因其獨特的物理化學性質(zhì)而受到廣泛的關注，發(fā)展非常迅速。這類材料根據(jù)形貌，可以分為納米簇1,2、納米顆粒3、納米棒4、納米線5和納米管等。

在眾多納米材料中，石墨碳納米材料，是一種具有獨特結(jié)構(gòu)、電學和光譜特征的材料。自從1985年富勒烯的發(fā)現(xiàn)開始，碳納米材料已經(jīng)引起了人們濃厚的興趣6。碳納米材料中，碳納米管和石墨烯，分別在1991年和2004年被發(fā)現(xiàn)，得到世界范圍內(nèi)的廣泛關注。這兩種碳納米材料主要是由sp2雜化的碳原子構(gòu)成的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，其表面覆蓋高密度離域π電子。這一電子結(jié)構(gòu)特點，使其具有很多獨特的性質(zhì)：(1)導電性出色，在室溫下傳遞電子的速度比已知導體都快，電子的運動速度可達到了光速的1/300；(2)導熱性好，熱導率在5000 W·m－1·K－1，可以很快地傳導和散發(fā)熱量，其散熱效果比常用的散熱材料銅要提高2－4倍7；(3)機械性能高，石墨烯是目前人類已知機械強度最高的物質(zhì)；(4)大的比表面積，理論值為2630 m2· g－18；(5)可以吸收近紅外的光，表現(xiàn)出優(yōu)異的光熱轉(zhuǎn)換特性和良好的熒光性質(zhì)9,10；(6)化學性質(zhì)相對穩(wěn)定，作為一種無機材料，對于酸堿有相當強的耐腐蝕性。這些性質(zhì)使它們在電子、光電子、可再生能源和生物醫(yī)藥方面得以應用10－13。其中利用其光學特性在生物分子檢測、生物成像、藥物運輸和疾病治療等方面的應用尤為矚目。

徐逸婷，1990年生。2013年本科畢業(yè)于河南師范大學化學化工學院，2013年至今為湖南大學化學化工學院博士研究生。主要研究方向為功能納米材料的制備及其在生化傳感領域應用的研究。

陳龍，1978年生。美國得州大學圣安東尼奧分校博士、博士后，加拿大阿爾伯塔大學碩士，北京大學學士，現(xiàn)任澳門大學科技學院助理教授，博士研究生導師。主要研究方向為機器學習，計算智能，圖像處理及這些技術在化學計量學的應用。

陳卓，1979年生。2001年本科畢業(yè)于浙江大學理學院化學系，2006年于北京大學化學與分子工程學院獲得博士學位，2006年至2010年在美國斯坦福大學化學系從事博士后研究?，F(xiàn)任湖南大學化學生物傳感與計量學國家重點實驗室、化學化工學院教授，博士研究生導師。主要研究方向為功能納米材料的制備及其在化學、生物、材料領域應用的研究。

在眾多獨特的光學特點中，石墨碳納米材料的拉曼性質(zhì)尤為突出14。拉曼光譜是一種非彈性散射光譜，常見的拉曼光譜報道了分子由于其較小的橫截面而具有相當弱的拉曼信號，而表面增強拉曼光譜(SERS)的出現(xiàn)則使得拉曼檢測具有更廣泛應用前景。SERS是一種基于納米尺度的粗糙表面、顆粒形貌的異常光學增強效應，能夠檢測出吸附在金屬表面的單層和亞單層分子，從而給出表面分子的結(jié)構(gòu)、組分等信息。貴金屬，如金、銀、鉑、鈀等，因其表面獨特的等離子共振性質(zhì)是最常見的SERS基底，有很好的SERS增強效果15,16。雖然在過去近四十年中，人們研究了SERS效應的起源，并致力于創(chuàng)造更理想的SERS基質(zhì)，但是對于SERS相關機理仍存在著爭議，而創(chuàng)造出理想的SERS系統(tǒng)也是具有挑戰(zhàn)的。通常理想的SERS系統(tǒng)需要同時滿足以下要求17,18：(1)高SERS活性以保證靈敏度；(2)結(jié)構(gòu)均勻可以提供重復、可靠的信號；(3)對于不同的分子結(jié)構(gòu)具有高選擇性；(4)可對樣品進行快速無損的前處理和檢測。而石墨烯獨特的光學特性和穩(wěn)定的化學性質(zhì)使其在拉曼檢測、細胞成像領域有出色的應用。

除了拉曼成像以外，熒光成像對于研究生物系統(tǒng)是一種必不可少的成像手段。然而在活體成像應用中，由于活體組織對光的背景吸收和光子的散射，成像的穿透深度和分辨率受到很大的影響。而石墨碳納米材料中的單壁碳納米管(SWNTs)具有引人注目的的近紅外二區(qū)(NIR-II)成像特性，能夠有效的解決這一問題19。眾所周知，碳納米管可以分為單壁碳納米管和多壁碳納米管兩種。多壁碳納米管可以看做作是一束同軸的單壁碳納米管。而單壁碳納米管則依據(jù)結(jié)構(gòu)的不同可分為半導體性單壁碳納米管和金屬性單壁碳納米管。其中半導體型單壁碳納米管的電子結(jié)構(gòu)特殊，可在NIR-II區(qū)(1000－1700 nm)產(chǎn)生光致發(fā)光的現(xiàn)象，這一波段的熒光，有效地規(guī)避了生物體的背景吸收，相比于近紅外一區(qū)(NIR-I，750－900 nm)，能夠達到更深層的生物組織19－21。

除了光致發(fā)光性質(zhì)外，石墨碳納米材料還具有十分出色的光熱轉(zhuǎn)換能力，在針對惡性腫瘤的熱療領域有很好的應用。惡性腫瘤是嚴重危害人類健康的一種疾病。在各種治療方法中，過高熱的治療法，即熱療，受到了生化傳感工作者的極大關注22。研究發(fā)現(xiàn)當細胞所處體系的溫度上升至42°C以上時，熱能開始使細胞出現(xiàn)異變。熱能對細胞損傷的程度取決于溫度高低和暴露在熱能下的時間，這一現(xiàn)象對于腫瘤細胞尤其明顯。現(xiàn)代的熱療是使用各種現(xiàn)代化的儀器，通過超聲、微波、射頻、外加磁場等方式，將人體某個部位或某個器官的溫度升高到具有治療作用的水平，達到殺死局部腫瘤細胞的治療目的。但這種方式存在極大的缺陷，即熱傳遞的非專屬性，這極易造成腫瘤周圍正常的組織器官的損傷，引發(fā)炎癥反應，使患者痛苦不堪，因此其實際應用受到了限制。而新興納米材料的發(fā)展，為特異性殺死腫瘤細胞提供了可能。石墨碳納米材料，主要包括石墨烯和碳納米管，是一類出色的光熱轉(zhuǎn)換材料，在近紅外窗口有較強的光吸收(NIR-I，750－900 nm)，轉(zhuǎn)換效率極高，經(jīng)合適波長的光源照射會產(chǎn)生明顯的光熱效應。而其本身性質(zhì)穩(wěn)定，且比表面積大，可與其它藥物分子組裝在一起，實現(xiàn)對腫瘤的高效治療。

除此之外，石墨碳納米材料還可以作為信號傳遞基底而應用于生化傳感領域23。信號傳遞通常涉及能量轉(zhuǎn)移和電子轉(zhuǎn)移，基于這兩個機理的檢測方法已有很多，最近研究指向研發(fā)出具有高傳遞效率、穩(wěn)定，而對目標檢測物沒有影響的信號傳遞基底。石墨碳納米材料穩(wěn)定的化學性質(zhì)，高比表面積，快速電子傳導率，和寬波段的吸收(500－900 nm)等特性，使其成為一種理想的信號傳遞基底。本文總結(jié)和探討了石墨碳納米材料光學性質(zhì)在生化傳感領域的應用，著重評述了石墨碳納米材料作為光學探針、光熱材料和信號傳遞基底的應用。

2 石墨碳納米材料作為光學探針在生化傳感領域的應用

2.1 石墨碳納米材料作為拉曼探針在生化傳感領域的應用

納米材料已經(jīng)在生化傳感領域得到了很廣泛的應用，研究納米顆粒與細胞間的相互作用成為研究的熱點之一，它對生物體成像、疾病的診斷、治療都具有重要的意義24。在這種情況下，確定細胞內(nèi)納米顆粒的具體位置對納米藥物預期的治療效果至關重要。與傳統(tǒng)熒光染料相比，石墨烯的拉曼散射更能抵抗光猝滅和光漂白現(xiàn)象，更適合用于長期的追蹤和標記25。石墨烯具有強而簡潔的拉曼散射信號，但是應用到拉曼成像時，仍有一些缺陷，如收集時間較長，如果每個像素點的收集時間為1 s，100×100個像素點的區(qū)域會需要幾個小時的時間。除此之外，石墨烯的拉曼信號部分可能與細胞內(nèi)的自身信號重疊，使信號難以分辨。針對以上兩個問題，Song等26設計研制了銀石墨納米囊(ACGs)核殼結(jié)構(gòu)的納米材料，并在拉曼細胞成像方面開展了研究。銀石墨納米囊表面的薄層石墨烯有效地保護了銀納米粒子在不同環(huán)境中的優(yōu)異拉曼增強性能，在高濃度的過氧化氫、硫化物甚至硝酸的存在下，顆粒的等離激元性能都能得到很好的保持。作者通過在石墨烯表面修飾炔基聚乙二醇(PEG)，再結(jié)合石墨烯本身的拉曼信號，實現(xiàn)了細胞與顆粒共定位快速拉曼成像。如圖1所示，將炔基分子與聚乙二醇偶聯(lián)，合成了炔基-PEG分子。炔基-PEG不但是一種理想的低背景拉曼信號分子，還是一種表面活性劑?？梢酝ㄟ^強的π－π堆積作用修飾在銀石墨納米囊的表面，并幫助提高ACGs的水溶性。實驗結(jié)果表明這種炔基-PEG修飾的ACGs具有優(yōu)異的拉曼成像能力。圖2為炔基-PEG-ACGs用于細胞內(nèi)的高分辨率拉曼圖像26。作者利用三種拉曼振動模式，即石墨烯的D峰、G峰，和來自炔的拉曼信號峰，用于ACGs的共定位，結(jié)果表明其具有良好的細胞內(nèi)定位能力。所有拉曼信號分布在細胞質(zhì)，準確地指示了ACGs的位置。同時，表面的石墨烯有效地保護了內(nèi)核銀顆粒，成像信號穩(wěn)定，可重復性好。

除了銀納米材料，金也是常用的拉曼信號增強基底。最近，Lai等27開發(fā)了一種有效的方法合成各向異性的金石墨納米囊材料(AuNR@G)。如圖3所示，首先，通過在金納米棒(AuNR)上以水解的方法包裹一層介孔的SiO2，再通過CVD法生長出高質(zhì)量的石墨包裹層。這種方法不僅能在高溫下保持AuNR的形狀，而且還可以有效進行石墨層的生長。與貴金屬沉積在碳納米管或者石墨烯的表面的方法相比28，該方法合成的納米復合物更加穩(wěn)定，表面的石墨烯層有效地保護了作為拉曼增強基底的內(nèi)核金。而與通過靜電作用合成的氧化石墨烯包裹金納米顆粒相比29，該種方法實現(xiàn)了顆粒表面石墨烯高效穩(wěn)定的生長，減少了氧化石墨烯表面缺陷帶來的對石墨材料本征優(yōu)異光學性質(zhì)的干擾。由于其各向異性的結(jié)構(gòu)特點，通過形貌的調(diào)控，AuNR@G能有效的與近紅外光產(chǎn)生強的共振，從而增強其拉曼和雙光子熒光的信號。進一步，利用核酸適配體對AuNR@G進行表面功能化，還能實現(xiàn)對腫瘤組織的特異性識別與拉曼和雙光子的多模態(tài)組織成像，顯示了在生物靶向成像、治療診斷等方面應用的巨大潛力。

圖1 (a)炔基PEG的合成路線，(b)炔基PEG修飾ACG的原理圖Fig.1 (a)Synthesis procedure of alkyne-PEG,(b)schematic illustration of the alkyne-PEG functionalization ofACGs PPh3:triphenyl phosphine;PdCl2(PPh3)2:bis(triphenylphosphine)palladium(II)chloride;THF:tetrahydrofuran;PBr3:phosphorus tribromide;DCM:dichloromethane;PEG:polyethylene glycol

圖2ACGs的SERSFig.2 SERS of theACGs(a)Raman spectrum of theACGs,(b,c,d)high-resolution Raman image of MCF-7 cells,(e)Raman spectra of Rhodamine 6G(R6G) with(red)and without(blue)ACGs.scale bar:10 μm.color online

圖3 (a)AuNR@G的制備流程圖；(b)TEM表征AuNR@SiO2，(c,d)TEM、HR-TEM表征AuNR@G；(e－g)不同生長溫度下不同顆粒形狀的調(diào)控Fig.3 (a)Schematic illustration ofAuNR@G nanocapsule preparation;(b)transmission electron microscope(TEM) image ofAuNR@SiO2;(c)TEM and(d)high-resolution(HR)-TEM image ofAuNR@G;(e－g)modulating the morphology of gold graphitic nanocapsules under different temperatures

運用SERS探針，檢測分子結(jié)構(gòu)和組成是被廣泛研究的方法，但是用該方法進行定量檢測依然是一大難題。這是因為SERS本質(zhì)上是一種與距離相關的現(xiàn)象，只有那些離增強電磁場(通常被稱為hot spot，熱點)近(<2 nm)的待測分子的拉曼信號才能得到相應增強；而且，熱點的場增強效應與局部的具體結(jié)構(gòu)相關，也和被測分子與表面的相互作用形式有關，熱點具體結(jié)構(gòu)和分子作用形式不同，往往會帶來SERS信號強度數(shù)倍的改變。針對這一問題，很多研究傾向于引入內(nèi)標來提高檢測的準確性。Zou等30構(gòu)建了一種具有SERS內(nèi)標(IS)的多層石墨包覆磁性納米囊(AGNs)。如圖4所示，該納米復合材料具有磁性內(nèi)核，表面包覆數(shù)層石墨烯結(jié)構(gòu)，同時在石墨烯結(jié)構(gòu)表面再組裝上一層致密金納米顆粒。作者將石墨烯獨特的拉曼信號作為穩(wěn)定的內(nèi)標，結(jié)合表面組裝的金納米顆粒創(chuàng)造的電磁共振熱點，構(gòu)建出一種具有超高精確度和靈敏性的SERS探針，為生物分子的定量檢測提供了一種潛在、可靠的方法。同時，AGNs具有較強磁性，方便了探針的富集回收。如圖5所示，AGNs表面的石墨烯包裹使其具有了優(yōu)異的抗氧化能力。此外，對于定量檢測羅丹明(RhB)，以相對標準偏差評估該SERS檢測方法的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示相對于不加內(nèi)標的檢測方法，AGNs顯示出更小的偏差，更好的穩(wěn)定性。SERS檢測中引入內(nèi)標可以是不同的分子，而與一些有機分子SERS內(nèi)標相比31，石墨烯具有更穩(wěn)定的拉曼信號，避免了檢測過程中激光帶來的碳化影響，在極端條件下顯現(xiàn)出色的穩(wěn)定性。與傳統(tǒng)有機分子內(nèi)標對甲基苯硫酚(pTSH)與金顆粒結(jié)合的復合結(jié)構(gòu)作對比，AGNs顯示了具

圖4AGNs的合成和表征Fig.4 Synthesis and characterization ofAGNs(a)schematic diagram ofAGNs;(b)zeta potentials of MMs,gold seeds,AGNs;(c)HR-TEM image of MMs,scale bar,5 nm; (d)TEM image of singleAGNs;scale bar,20 nm;(e)digital photos ofAGNs solution under external magnet; (f)Raman spectra of MMs(red)andAGNs(black).color online

圖5AGNs作為拉曼內(nèi)標(IS)的檢測

Fig.5 AGNs as Raman internal standard(IS)

SERS spectra collected fromAu@pTSH(a)andAGNs(b)before and after adding H2O2at 20 min interval;(c)Raman spectra of RhB with(red)and without(black)AGNs;(d)SERS spectra of RhB with various laser focusing depth;Raman bands of 618 cm－1(e)and 2655 cm－1(f)zoom in of(d); (g)relative standard deviation(RSD)calculated from(d),with and withoutAGN internal standard normalization.color online有優(yōu)異的抗氧化能力，為拉曼檢測提供了更為穩(wěn)定的內(nèi)標。另外，通過調(diào)控石墨納米囊表面的金納米顆粒的密度，還可以實現(xiàn)不同波長激光的等離激元共振增強，進一步提高了AGNs拉曼分析的普適性。

2.2 單壁碳納米管的NIR-II熒光特性在生化傳感領域的應用

除了拉曼這一光學特性外，半導體型的單壁碳納米管還具有非常獨特的NIR-II光發(fā)光性質(zhì)，被應用在生物成像等領域。根據(jù)手性結(jié)構(gòu)的不同，單壁碳納米管可以分為金屬型和半導體型，其中只有半導體型的單壁碳納米管符合NIR-II光致發(fā)光的要求，這是因為對于金屬型單壁碳納米管，其態(tài)密度在費米能級不為零，從而，在吸收了一個光子到激發(fā)態(tài)之后，又以非輻射的形式躍遷回價態(tài)，從而不會產(chǎn)生熒光現(xiàn)象21。以下討論的都是半導體型單壁碳納米管。不同方法制備出來的單壁碳納米管具有不同的激發(fā)波長，通常都在1000－1700 nm的NIR-II，如此長波長的激發(fā)特性使其成為第一個應用在生物NIR-II熒光成像領域的實用性納米材料。常規(guī)熒光光學成像具有很高的時空分辨率，然而，由于成像組織對光的背景吸收和光子散射的原因，在進行活體熒光成像時，光的穿透深度受到限制，難以對深層組織進行成像，另外活體組織的成像分辨率也大打折扣。而長波長激發(fā)的單壁碳納米管可以有效的解決這些難題。如圖6所示，Welsher等19通過表面修飾有磷脂聚乙二醇分子(DSPE-mPEG)的單壁碳納米管作為NIR-II熒光探針，探究了該種材料經(jīng)尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)之后的實時動力學過程。結(jié)果顯示，SWNTs是一種可用于近紅外二區(qū)熒光成像的納米材料，且不需要額外的激發(fā)能量，就能夠?qū)π∈髢?nèi)部的深層組織進行有效的高幀頻成像。

將這種材料與傳統(tǒng)近紅外一區(qū)熒光染料吲哚菁綠(ICG)做比較，如圖7所示，結(jié)果顯示近紅外二區(qū)激發(fā)的單壁碳納米管的組織穿透深度更深，克服了活體組織的背景吸收，顯著降低了光散射的影響，提供了更高時空分辨率的活體熒光成像。但相比于傳統(tǒng)染料，SWNTs熒光量子產(chǎn)率較低，通常只有0.1%－1%，遠低于紫外可見激發(fā)和近紅外一區(qū)激發(fā)的傳統(tǒng)染料。有研究解釋這是因為其發(fā)光特性實質(zhì)上來源于激子的能量，而激子擴散過程很容易被材料表面缺陷俘獲而被猝滅，因此這種熒光發(fā)光受周圍化學環(huán)境影響很大19,21。

3 石墨碳納米材料的光熱特性在生化傳感領域的應用

圖6SWNTs在近紅外二區(qū)對活體小鼠的視頻速率成像Fig.6 Video-rate imaging of SWNTs in a live mouseScale bars represent 1 cm.color online

圖7SWNTs和ICG的成像深度比較Fig.7 Tissue phantom study of the depth penetration of SWNTs and ICGfluorescence images of capillaries of single-walled carbon nanotubes(SWNTs)(NIR II)and Indo cyanine green(ICG)(NIR I)at different depths of Intralipid?excited at 785 nm.Scale bars represent 1.5 cm.

石墨碳納米材料在近紅外區(qū)域有很強的光吸收，并能高效的將光轉(zhuǎn)化成熱，因而可以被應用在光熱治療的研究中。腫瘤熱療是指用人工加熱的方法(如超聲、微波、射頻、水浴等)治療惡性腫瘤，利用各種物理能量在人體組織中所產(chǎn)生的熱效應使腫瘤細胞升溫到一定程度，并維持一定時間，達到殺滅癌細胞避免正常細胞遭受損傷的目的。其中光熱療，是通過光熱轉(zhuǎn)換來達到升溫的目的，其最突出的優(yōu)點，是對正常組織的無損性。由于人體的背景吸收，一般的紫外可見光，穿透深度不足，對于較深的患處，光熱療的效果很差，這就需要一個近紅外光激發(fā)的、光熱轉(zhuǎn)換效率高的材料來進行更有效的治療。石墨烯符合以上條件，同時其比表面積大，可以與其它藥物分子結(jié)合，達到協(xié)同治療的目的。如圖8、9所示，Bian等32合成的一種金石墨納米囊(GIAN)，一方面利用金納米顆粒和石墨烯光熱轉(zhuǎn)換的特點，對癌細胞進行熱療；另一方面還可以石墨烯表面對阿霉素(DOX)的π－π堆積作用，載入腫瘤化療藥物DOX，并且可以通過酸堿度和熱效應對DOX進行有選擇的釋放，降低了DOX的副作用，對腫瘤有很好的協(xié)同治療效果。GIAN與傳統(tǒng)光熱療材料金納米顆粒、金納米棒相比，除了具有長波長吸收的特性之外，還具有比表面積大的特點，表面可以與化療藥物、標記分子通過π－π堆積、靜電吸附作用結(jié)合，能夠?qū)崿F(xiàn)協(xié)同治療、實時跟蹤治療的目的。

圖8GIAN的結(jié)構(gòu)和化學表征圖Fig.8 Structural analysis and chemical properties of GIAN(a)schematic diagram of GIAN;(b,c)TEM images of GIAN;(d)selected area electron diffraction measurement of GIAN; (e)UV-Vis spectrum of an aqueous GIAN suspension;(f)GIAN suspensions ranging from different acidic conditions,respectively

圖9GIAN光熱增強的化療作用Fig.9 Photothermal enhanced chemotherapy with GIAN(a)schematic illustration of NIR photothermal enhanced chemotherapy mechanism of graphene-isolated-Au-nanocrystal/doxorubicin(GIAN/DOX) complexes;(b)UV-Vis characterization of the DOX-loaded GIAN.Inset:digital photo of the DOX,GIAN,and GIAN/DOX solutions;(c)fluorescence spectroscopy characterization of the DOX loading efficiency;(d)cell viability of MCF-7 cells with and without NIR laser irradiation after incubation with free DOX,GIAN,and GIAN/DOX,respectively.color online

4 石墨碳納米材料作為信號傳遞基底在生化傳感領域的應用

最近的研究發(fā)現(xiàn)石墨碳納米材料是一種優(yōu)異的納米猝滅劑，可以高效猝滅有機染料分子的熒光，在生物傳感應用方面具有很大的潛能33,34。研究發(fā)現(xiàn)單鏈DNA(ssDNA)可以通過非共價鏈接的方式與石墨碳納米材料發(fā)生相互作用35,36，這一現(xiàn)象被應用在納米管的分離35,37、藥物的運輸38和生化傳感領域39。但是將石墨烯應用于復雜的傳感體系仍然存在一些問題，因此研究人員希望能夠找到一種更靈敏、簡易、快速、便宜與特異性的石墨烯傳感器。最近新開發(fā)的檢測方法包括DNA酶放大反應、滾環(huán)放大反應和聚合酶鏈反應(PCR)，這些方法都大大降低了DNA的檢測下限40。但是這些基于酶放大檢測的方法有幾個缺點，首先使用酶成本高，其次酶很容易失活，而且滾環(huán)放大以及PCR放大需要特殊的儀器。因此，發(fā)展新型的納米材料并構(gòu)建簡易、無酶、低成本的高靈敏傳感體系具有重要的意義。如圖10所示，Song等41設計合成了磁性石墨納米囊(MGN)，并將其用于富集放大檢測DNA。該納米材料是一種核殼結(jié)構(gòu)，由磁性核與石墨殼構(gòu)成，充分發(fā)揮了磁性顆粒的富集與石墨烯的高效猝滅的雙重特性。ssDNA可以通過π－π堆積作用吸附在MGN的石墨殼表面，形成ssDNA/MGN結(jié)構(gòu)，同時ssDNA的熒光被石墨迅速猝滅。為了提高檢測的靈敏度，作者構(gòu)建了一種先磁場捕獲富集再釋放的傳感體系，用于DNA的富集放大檢測。該體系具有操作簡單以及無酶放大的優(yōu)點，檢測下限低至50 pmol· L－1，比傳統(tǒng)基于碳納米管和石墨烯的檢測方法低三個數(shù)量級42。

圖10MGN用于DNA富集放大檢測的原理圖Fig.10 Strategy of the MGN for DNAfishing and detection

圖11SWNTs結(jié)合染料標記的ssDNA識別特異性DNA序列和蛋白質(zhì)原理示意圖Fig.11 Schematic diagram of recognizing and detecting specific DNAsequences and proteins by the assembly of SWNTs and dye-labeled ssDNA

一些石墨碳納米材料除了能夠猝滅熒光染料的熒光以外，還能夠以類似的機理猝滅光敏劑產(chǎn)生單線態(tài)氧(1O2)。1O2是在光動力學療(PDT)過程中產(chǎn)生的一類非常重要的具有細胞毒性的物質(zhì)43。通過能量傳遞的過程，處在高能態(tài)的1O2能量轉(zhuǎn)移給低能態(tài)石墨碳納米材料，而材料自身對1O2的光化學作用足夠穩(wěn)定44。因為1O2的壽命和擴散速度都有限，可控的產(chǎn)生單線態(tài)氧可以使PDT更加有效和可靠，同時不可預計的副作用也會大大減少45,46。光動力學療可以分為兩個步驟，首先是光敏劑富集在待治療的組織中，然后被一束波長合適的光源激發(fā)，就會被激活，并產(chǎn)生1O2。如圖11所示，Zhu等39合成了光敏劑-核酸適配體(aptamer)-SWNTs的復合結(jié)構(gòu)。其中SWNTs通過超聲和酸性溶液中回流，能夠順利地溶解在水中。一端修飾有光敏劑Ce6分子的aptamer非共價修飾在SWNTs表面，由于aptamer與SWNTs的緊密結(jié)合，光敏劑能被有效的猝滅。這樣，即使在合適的光照條件下，復合物也不會產(chǎn)生單線態(tài)氧，而當可與aptamer相互作用的α-凝血酶存在時，aptamer帶著Ce6從SWNTs表面脫落下來，Ce6的光敏性恢復。如此，通過調(diào)節(jié)α-凝血酶的濃度，就可以有效地控制1O2的產(chǎn)生。這樣的設計大大提高了光動力學療的選擇性，帶來更安全、更個性化的治療方法。這種以石墨碳納米材料為猝滅劑的設計，相比有機猝滅劑，具有更好的猝滅效果，和更好抗光漂白的性質(zhì)，另外表面積大的特性也使其表面能夠負載更多的分子，從而具有更高的信噪比。

此外，與單壁碳納米管和石墨烯猝滅光敏劑的性質(zhì)不同，零維的富勒烯納米材料在光動力學療法中可以作為光敏劑，將其受光激發(fā)的能量或電子傳導給氧分子，從而產(chǎn)生活性氧簇45。相比于傳統(tǒng)的四吡咯型的有機光敏劑，富勒烯及其衍生物構(gòu)成的光敏劑具有碳材料的優(yōu)點，抗光漂白和化學穩(wěn)定性出色。另外單一富勒烯材料雖然生物相容性較差，但是通過對其表面進行修飾，可以增加其在生物體內(nèi)的穩(wěn)定性。富勒烯納米材料作為光敏劑遇到的最大難題即激發(fā)波長較短的問題，其激發(fā)波長一般位于紫外-可見區(qū)。針對這一問題，目前的解決方法主要集中在通過表面修飾更長波長吸收的分子作為光俘獲分子，再通過富勒烯的自旋轉(zhuǎn)換，達到產(chǎn)生活性氧簇的目的39。

5 其他的檢測應用

石墨碳納米材料還被應用在其他一些檢測系統(tǒng)中。例如，SWNTs被設計用來檢測水溶液的pH值47。利用對pH敏感的聚合物連接熒光基團，再與SWNTs組裝成復合物。當體系pH值改變時，受到刺激的聚合物發(fā)生膨脹或收縮，從而改變了連接的熒光基團與SWNTs表面的距離，熒光發(fā)生相應的改變，從而反應出體系pH的變化。此外，磁性石墨納米囊也被用來進行pH值的測量40。通過在石墨殼層上組裝二十五碳二炔酸(PCDA)分子，并進一步進行聚合，可同時利用熒光強度和核磁共振弛豫率的改變來檢測溶液中的pH值的變化，有效的提高了檢測的靈敏度和準確性。

6 結(jié)語與展望

圍繞石墨碳納米材料獨特的光學、化學性質(zhì)，本文討論了其在生化傳感領域的進展。石墨碳納米材料優(yōu)異的光學性質(zhì)，使其在生物成像和生化分析方面有出色應用。例如新型貴金屬石墨納米囊材料，集成了貴金屬和石墨碳納米材料優(yōu)異的理化性質(zhì)，通過石墨烯包裹貴金屬納米材料形成的納米核殼復合物，既有很強的表面增強拉曼效果，又結(jié)合了石墨碳材料獨特而穩(wěn)定的拉曼性質(zhì)和猝滅熒光干擾的性質(zhì)；另外，石墨碳納米材料比表面積大，可以吸附的信號分子更多，從而提高了生化分析的信噪比，在細胞快速拉曼成像和拉曼定量檢測方面得到了較好的應用；除此之外，還可以通過靜電吸附或π－π堆積的方式，運載其他藥物分子或靶向分子，達到診斷與治療相結(jié)合的目的。除了作為拉曼光學探針，另一種典型的石墨碳納米材料，單壁碳納米管還具有近紅外二區(qū)熒光特性，其出色的生物組織穿透深度和高分辨率使其成為第一種應用在近紅外二區(qū)熒光成像領域的納米材料。其次，本文討論了石墨碳納米材料出色的光熱轉(zhuǎn)換效率和高比表面積在針對腫瘤的光熱療和化療協(xié)同治療領域的應用。石墨碳納米材料在近紅外有出色的光熱轉(zhuǎn)換效率，相比于紫外可見吸收材料，有更好的組織穿透力，同時其表面可以負載各種功能分子，從而實現(xiàn)協(xié)同治療的目的。最后，本文就石墨碳納米材料作為信號傳遞基底，討論了其在生物分子檢測和光動力學療領域的應用。通常將石墨碳納米材料設計為猝滅劑，與有機猝滅劑有類似的機理，但是相比于有機猝滅劑，石墨碳納米材料物理化學性質(zhì)穩(wěn)定，在紫外-可見直到近紅外區(qū)域都有一定吸收，這些特性得其具有更好的猝滅效果，和更好抗光漂白的性質(zhì)，另外其表面積大的特性也使其表面能夠負載更多的分子，從而具有更高的信噪比。

石墨碳納米材料在生化傳感領域的應用與發(fā)展日新月異。目前，更多的研究集中在如何開發(fā)出操作更簡單，性質(zhì)更穩(wěn)定的石墨烯納米傳感器，包括合成多色的、分辨率更高的的拉曼探針，以及開發(fā)出高通量、高選擇性、高靈敏度的分子檢測方法。另一方面，如何通過生物、化學的方法，解決石墨烯材料在生物醫(yī)學領域應用尚存在的缺點，進一步改善其生物相容性，也是生物醫(yī)學研究者關注的焦點。

(1)Prasuhn,D.E.;Feltz,A.;Blanco-Canosa,J.B.;Susumu,K.;Stewart,M.H.;Mei,B.C.;Yakovlev,A.V.;Loukou,C.;Mallet, J.M.;Oheim,M.ACS Nano 2010,4(9),5487.doi:10.1021/ nn1016132

(2)Zhang,C.Y.;Hu,J.Anal.Chem.2010,82(5),1921. doi:10.1021/ac9026675

(3)Ho,J.A.;Chang,H.C.;Shih,N.Y.;Wu,L.C.;Chang,Y.F.; Chen,C.C.;Chou,C.Anal.Chem.2010,82(14),5944. doi:10.1021/ac1001959

(4)Mayer,K.M.;Lee,S.;Liao,H.;Rostro,B.C.;Fuentes,A.; Scully,P.T.;Nehl,C.L.;Hafner,J.H.ACS Nano 2008,2(4), 687.doi:10.1021/nn7003734

(5)Zheng,G.;Patolsky,F.;Cui,Y.;Wang,W.U.;Lieber,C.M. Nat.Biotechnol.2005,23(10),1294.doi:10.1038/nbt1138

(6)Baughman,R.H.;Zakhidov,A.A.;de Heer,W.A.Science 2002,297(5582),787.10.1126/science.1060928

(7)Kroto,H.W.;Heath,J.R.;O′Brien,S.C.;Curl,R.F.;Smalley, R.E.Nature 1985,318(6042),162.

(8)Ghosh,S.;Calizo,I.;Teweldebrhan,D.;Pokatilov,E.;Nika,D.; Balandin,A.;Bao,W.;Miao,F.;Lau,C.N.Appl.Phys.Lett. 2008,92(15),151911.doi:10.1063/1.2907977

(9)Novoselov,K.;Jiang,D.;Schedin,F.;Booth,T.;Khotkevich,V.; Morozov,S.;Geim,A.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2005,102 (30),10451.doi:10.1073/pnas.0502848102

(10)Liu,Q.;Guo,B.;Rao,Z.;Zhang,B.;Gong,J.R.Nano Lett. 2013,13(6),2436.doi:10.1021/nl400368v

(11)Qian,J.;Wang,D.;Cai,F.H.;Xi,W.;Peng,L.;Zhu,Z.F.;He, H.;Hu,M.L.;He,S.Angew.Chem.Int.Ed.2012,51(42), 10570.doi:10.1002/anie.201206107

(12)Liu,Z.;Robinson,J.T.;Tabakman,S.M.;Yang,K.;Dai,H. Mater.Today 2011,14(7),316.doi:10.1016/S1369-7021(11) 70161-4

(13)Liu,Z.;Tabakman,S.;Welsher,K.;Dai,H.Nano Res.2009,2 (2),85.doi:10.1007/s12274-009-9009-8

(14)Wang,H.;Dai,H.Chem.Soc.Rev.2013,42(7),3088. doi:10.1039/C2CS35307E

(15)Dresselhaus,M.;Dresselhaus,G.;Jorio,A.;Souza-Filho,A.; Saito,R.Carbon 2002,40(12),doi:2043.10.1016/S0008-6223 (02)00066-0

(16)Saha,K.;Agasti,S.S.;Kim,C.;Li,X.;Rotello,V.M.Chem. Rev.2012,112(5),2739.

(17)Lin,X.M.;Cui,Y.;Xu,Y.H.;Ren,B.;Tian,Z.Q.Anal. Bioanal.Chem.2009,394(7),1729.doi:10.1007/s00216-009-2761-5

(18)Natan,M.J.Faraday Discuss.2006,132,321.doi:10.1039/ B601494C

(19)Welsher,K.;Sherlock,S.P.;Dai,H.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S. A.2011,108(22),8943.doi:10.1073/pnas.1014501108

(20)Hong,G.;Diao,S.;Antaris,A.L.;Dai,H.Chem.Rev.2015,115 (19).doi:10.1021/acs.chemrev.5b00008

(21)Maeda,H.;Wu,J.;Sawa,T.;Matsumura,Y.;Hori,K. J.Controlled Release 2000,65(1),271.doi:10.1016/S0168-3659(99)00248-5

(22)Zhao,W.;Karp,J.M.Nat.Mater.2009,8(6),453.doi:10.1038/ nmat2463

(23)Li,H.;Martin,R.B.;Harruff,B.A.;Carino,R.A.;Allard,L.F.; Sun,Y.P.Adv.Mater.2004,16(11),896.doi:10.1002/ adma.200306288

(24)Shah,N.B.;Dong,J.;Bischof,J.C.Mol.Pharm.2011,8(1), 176.doi:10.1021/mp1002587

(25)Chao,W.;Ma,X.;Ye,S.;Liang,C.;Kai,Y.;Liang,G.;Li,C.; Li,Y.;Zhuang,L.Adv.Funct.Mater.2012,22(11),2363. doi:10.1002/adfm.201200133

(26)Song,Z.L.;Chen,Z.;Bian,X.;Zhou,L.Y.;Ding,D.;Liang,H.; Zou,Y.X.;Wang,S.S.;Chen,L.;Yang,C.J.Am.Chem.Soc. 2014,136(39),13558.doi:10.1021/ja507368z

(27)Lai,X.F.;Zou,Y.X.;Wang,S.S.;Zheng,M.J.;Hu,X.X.; Liang,H.;Xu,Y.T.;Wang,X.W.;Ding,D.;Chen,L.Anal. Chem.2016,88(10),5385.doi:10.1021/acs.analchem.6b00714

(28)Hao,Q.;Wang,B.;Bossard,J.A.;Kiraly,B.;Zeng,Y.;Chiang, I.K.;Jensen,L.;Werner,D.H.;Huang,T.J.J.Phys.Chem.C 2012,116(13),7249.doi:10.1021/jp209821g

(29)Ma,X.;Qu,Q.;Zhao,Y.;Luo,Z.;Zhao,Y.;Ng,K.W.;Zhao,Y. J.Mater.Chem.B 2013,1(47),6495.doi:10.1039/ C3TB21385D

(30)Zou,Y.;Chen,L.;Song,Z.;Ding,D.;Chen,Y.;Xu,Y.;Wang, S.;Lai,X.;Zhang,Y.;Sun,Y.;Chen,Z.;Tan,W.Nano Res. 2016,9(5),1418.doi:10.1007/s12274-016-1037-6

(31)Shen,W.;Lin,X.;Jiang,C.;Li,C.;Lin,H.;Huang,J.;Wang, S.;Liu,G.;Yan,X.;Zhong,Q.Angew.Chem.Int.Ed.2015,54 (25),7308.doi:10.1002/ange.201502171

(32)Bian,X.;Song,Z.L.;Qian,Y.;Gao,W.;Cheng,Z.Q.;Chen, L.;Liang,H.;Ding,D.;Nie,X.K.;Chen,Z.Sci.Rep.2014,4, 1.doi:10.1038/srep06093

(33)Novoselov,K.S.;Geim,A.K.;Morozov,S.V.;Jiang,D.; Katsnelson,M.I.;Grigorieva,I.V.;Dubonos,S.V.;Firsov,A. A.Nature 2005,438(7065),197.doi:10.1038/nature04233

(34)Zhao,X.H.;Kong,R.M.;Zhang,X.B.;Meng,H.M.;Liu,W. N.;Tan,W.;Shen,G.L.;Yu,R.Q.Anal.Chem.2011,83(13), 5062.doi:10.1021/ac200843x

(35)Tu,X.;Manohar,S.;Jagota,A.;Zheng,M.Nature 2009,460 (7252),250.doi:10.1038/nature08116

(36)Wang,S.;Humphreys,E.S.;Chung,S.Y.;Delduco,D.F.; Lustig,S.R.;Wang,H.;Parker,K.N.;Rizzo,N.W.; Subramoney,S.;Chiang,Y.M.Nat.Mater.2003,2(3),196. doi:10.1038/nmat833

(37)Zheng,M.;Jagota,A.;Semke,E.D.;Diner,B.A.;McLean,R. S.;Lustig,S.R.;Richardson,R.E.;Tassi,N.G.Nat.Mater. 2003,2(5),338.doi:10.1038/nmat877

(38)Kam,N.W.S.;Jessop,T.C.;Wender,P.A.;Dai,H.J.Am. Chem.Soc.2004,126(22),6850.doi:10.1021/ja0486059

(39)Zhu,Z.;Yang,R.;You,M.;Zhang,X.;Wu,Y.;Tan,W.Anal. Bioanal.Chem.2010,396(1),73.doi:10.1007/s00216-009-3192-z

(40)Lu,C.H.;Li,J.;Lin,M.H.;Wang,Y.W.;Yang,H.H.;Chen, X.;Chen,G.N.Angew.Chem.Int.Ed.2010,49(45),8454. doi:10.1002/ange.201002822

(41)Song,Z.L.;Zhao,X.H.;Liu,W.N.;Ding,D.;Bian,X.;Liang, H.;Zhang,X.B.;Chen,Z.;Tan,W.Small 2013,9(6),951. doi:10.1002/smll.201201975

(42)Liu,M.;Yin,X.;Ulinavila,E.;Geng,B.;Zentgraf,T.;Ju,L.; Wang,F.;Zhang,X.Nature 2011,474(7349),64.doi:10.1038/ nature10067

(43)Dolmans,D.E.;Fukumura,D.;Jain,R.K.Nat.Rev.Cancer 2003,3(5),380.doi:10.1038/nrc1071

(44)Lebedkin,S.;Kareev,I.;Hennrich,F.;Kappes,M.M.J.Phys. Chem.C 2008,112(42),16236.doi:10.1021/jp802754

(45)Calzavara,P.P.;Venturini,M.;Sala,R.J.Eur.Acad.Dermatol. Venereol.2007,21(3),293.doi:10.1111/j.1468-3083.2006.01902.x

(46)Triesscheijn,M.;Baas,P.;Schellens,J.H.;Stewart,F.A. Oncologist 2006,11(9),1034.doi:10.1634/theoncologist.11-9-1034

(47)Cho,E.S.;Hong,S.W.;Jo,W.H.Macromol.Rapid Commun. 2008,29(22),1798.doi:10.1002/marc.200800457

Applications of Graphitic Nanomaterial′s Optical Properties in Biochemical Sensing

XU Yi-Ting1CHEN Long2,*CHEN Zhuo1,*
(1State Key Laboratory of Cheme/Biosensing and Chemometric,Hunan University,Changsha 410006,P.R.China;2Faculty of Science and Technology,University of Macau,Macao 999078,P.R.China)

Graphitic nanomaterials,which possess unique optical properties,have attracted significant attention in biochemical sensing.Herein,we summarize and discuss recent progress of such materials as optical probes, photothermal materials and signal transduction substrates for biosensing applications.The most attractive optical property of graphitic nanomaterials is their strong and unique Raman signals.As a Raman probe,these nanomaterials have remarkable applications,especially in detecting complex biological samples,quantitative surface enhanced Raman scattering(SERS)detection and detection under extreme conditions.Besides Raman, the unique intrinsic fluorescence emission of single-walled carbon nanotubes(SWNTs)in the long wavelength and second near-infrared window(NIR-II window,1000－1700 nm)has facilitated deep-tissue high-resolution fluorescence imaging in vivo.Additionally,graphitic nanomaterials have efficient photothermal conversion capability.Together with the large surface area,graphitic nanomaterials are used in photothermal synergy therapy for cancer treatment.Furthermore,because of their particular physical and chemical properties,graphitic nanomaterials are established as an efficient signal transduction substrate,which can quench an excited chromophore and photosensitizer,showing high selectivity and sensitivity in biosensing and nanomedicine.

Graphitic nanomaterial;Biochemical sensing;Raman probe;Molecular detection; Photothermal therapy

O644

tureArticle]

10.3866/PKU.WHXB201609213www.whxb.pku.edu.cn

Received:June 15,2016;Revised:September 20,2016;Published online:September 21,2016.

*Corresponding authors.CHEN Zhuo,Email:zhuochen@hnu.edu.cn.Tel:+86-731-88821834;CHEN Long,Email:longchen@umac.mo.

The project was supported by the National Key Basic Research Program of China(973)(2013CB932702),National Natural Science Foundation of

China(21522501),and Science and Technology Development Fund of Macao S.A.R,China(FDCT,067/2014/A).

國家重點基礎研究發(fā)展規(guī)劃項目(973)(2013CB932702),國家自然科學基金(21522501)和澳門科學技術發(fā)展基金(FDCT,067/2014/A)資助

?Editorial office ofActa Physico-Chimica Sinica