苦味受體激動劑苦精對哮喘氣道炎癥及重塑的影響

閆 珊，程 麗，趙曉寧，黃軼民，劉 麗，劉靜靜，高福生△

(1.濰坊醫(yī)學院臨床醫(yī)學院 261053;2.濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科 261000)

論著·基礎研究

苦味受體激動劑苦精對哮喘氣道炎癥及重塑的影響

閆 珊1，程 麗1，趙曉寧1，黃軼民1，劉 麗2，劉靜靜2，高福生2△

(1.濰坊醫(yī)學院臨床醫(yī)學院 261053;2.濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科 261000)

目的 觀察苦精對哮喘小鼠α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、氣道上皮下膠原纖維及氣道炎癥的影響。方法 45只BALB/c小鼠分為3組，每組15只。A組：正常對照；B組：哮喘模型組；C組：哮喘加苦精干預1周。采用免疫組織化學方法觀察小鼠肺組織α-SMA的沉積，用馬松(Masson)染色方法觀察小鼠氣道膠原纖維的沉積，蘇木素-伊紅(HE)染色觀察小鼠氣道炎性程度，并對其進行計算機圖像半定量分析。結果 C組小鼠肺內(nèi)細支氣管壁α-SMA、膠原纖維沉積、氣道炎癥程度較B組明顯減少，圖像半定量分析結果與B組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論 苦精可以改善哮喘小鼠氣道炎癥及氣道重塑。

苦味受體；苦精；哮喘；氣道炎癥；氣道重塑

哮喘是一種以氣道炎癥、氣道高反應性、氣道重塑為特征的慢性疾病[1]，哮喘時嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞增多，這些細胞可以分泌炎性介質，進而加重氣道阻塞、黏液分泌，最終發(fā)生氣道重塑[2]。

氣道重塑加重了哮喘患者的病死率，包括上皮下膠原纖維增生，黏液過度分泌，細胞外基質沉積，氣道平滑肌增厚等[3-4]。糖皮質激素是臨床上治療哮喘的一線用藥，可以改善氣道炎癥，減緩氣道重塑。但臨床上一些患者對糖皮質激素不敏感[5-7]，而且糖皮質激素還可以引起高脂血癥、高血糖、高血壓、骨質疏松癥等不良反應[8-9]，糖皮質激素類藥物對于哮喘的治療有一定局限性，因此找到一種新型、有效的治療哮喘的藥物很重要。

Deshpande等[10]近年發(fā)現(xiàn)人類肺部存在苦味受體(TAS2R)，TAS2R激活后可以引起氣道高效舒張，顯著降低哮喘患者的氣道阻力。但關于TAS2R 是否可以改善哮喘氣道重塑的研究尚未見報道。α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)可反映氣道平滑肌數(shù)量及其收縮能力的改變[11]，α-SMA和膠原纖維的沉積被認為是氣道重塑的重要指標[12]。

本實驗通過制造卵清蛋白(OVA)致敏和激發(fā)的哮喘小鼠模型，用TAS2R激動劑苦精干預，探究了苦精對于哮喘氣道炎癥及氣道重塑的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 BABL/c小鼠45只，購自北京華阜康生物有限公司，6～8周齡，平均體質量16～20 g，飼養(yǎng)于濰坊醫(yī)學院動物房，12 h晝夜交替，標準飼料，自由取水。

1.2 主要試劑與儀器 霧化器(上海魚躍公司)，密閉霧化箱(自制，20 cm×15 cm×10 cm)，OVA、氫氧化鋁粉劑[Al(OH)3]、苦精(美國Sigma公司)，Solarbio、α-ASM、Masson染色試劑盒、HE染色試劑盒(北京Solarbio公司)。

1.3 方法

1.3.1 哮喘模型的制備給藥 45只BALB/c小鼠分為3組，每組15只。A組：正常對照組；B組：哮喘模型不干預組；C組：哮喘加苦精干預1周組。B組、C組小鼠在第1天、第15天，每只鼠腹腔注射0.2 mL[PBS配置，含100 μg OVA,1 mg Al(OH)3]OVA混懸液致敏，從第21天起，用1%OVA進行霧化，每周3次，連續(xù)8周。A、B組小鼠用等量生理鹽水做同樣處理。C組小鼠從第8周開始，每天霧化前30 min每只小鼠霧化吸入800 μg苦精(800 μg苦精溶解于5 mL PBS里)。

1.3.2 獲取肺組織 最后一次霧化后，次日麻醉小鼠，剖開胸部，心臟取血1 mL后注入1 mL 生理鹽水，以沖洗肺部紅細胞。用眼科剪剪取肺組織，放入4%多聚甲醛，4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 免疫組織化學 儲存的肺組織石蠟包埋后，5 μm厚切片，一抗為抗小鼠抗體α-ASM，用PBS進行1∶200稀釋，二抗為兔抗小鼠抗體，進行α-SMA的免疫組織化學染色。用Imagepro-plus IPP測定各組肺組織α-SMA相對水平(以免疫組織化學染色靜態(tài)灰度值表示)。

1.3.4 馬松(Masson)染色及蘇木素-伊紅(HE)染色 儲存的肺組織石蠟包埋后，5 μm 厚切片，按照試劑盒操作說明進行Masson染色和HE染色，分別顯示膠原纖維的增生情況及炎癥情況。

2 結 果

2.1 各組肺組織的α-ASM免疫組織化學 α-SMA免疫組織化學半定量分析顯示，B組肺組織中α-ASM水平顯著增加，免疫組織化學染成棕黃色，苦精干預一周后，C組α-ASM水平較B組下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。

2.2 各組肺組織的Masson染色 Masson染色顯示，B組小鼠氣道上皮下膠原纖維沉積增多，染色呈淡藍色，苦精干預1周后，與B組比較，C組膠原纖維減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

2.3 各組肺組織的HE染色 肺組織HE染色顯示，A組氣道黏膜光滑連續(xù)、無皺褶，氣道管壁無明顯增厚，肺泡大小一致，壁薄均無增厚；B組氣道黏膜皺褶明顯增多，氣道管壁、基底膜增厚，血管及平滑肌增生，氣道周圍可見大量炎性細胞浸潤，肺泡間隔不均勻增厚；C組氣道管壁、基底膜增厚，管腔狹窄及氣道周圍炎性細胞浸潤，以上病理改變均較B組減輕。見圖3。

A：A組(×200);B:B組(×200);C:C組(×200);D:定量分析圖；a:P<0.05，與A組比較；b：P<0.05，與B組比較。

圖1 各組肺組織的α-ASM表達(免疫組織化學)

A：正常組(×200)；B:哮喘組(×200)；C:苦精1周組(×200)；D:定量分析圖；a:P<0.05，與正常組比較；b：P<0.05，與哮喘組比較。

圖2 各組肺組織的Masson染色

A：A組B:B組C:C組。

圖3 各組肺組織的HE染色(×200)

3 討 論

氣道重塑是哮喘的重要病理特征。氣道上皮細胞脫落，杯狀細胞增生，黏液腺過度分泌，上皮下膠原纖維增生，氣道平滑肌細胞增生肥大，氣道高反應性增加，造成哮喘患者肺功能嚴重降低[13]。

在本實驗中，筆者用OVA反復給小鼠霧化吸入，制造哮喘小鼠模型。11周后，OVA致敏和激發(fā)的小鼠出現(xiàn)躁動不安，搔抓、打噴嚏、呼吸急促等反應，HE染色顯示，B組小鼠模型氣道壁明顯增厚，杯狀細胞增生，Masson染色顯示B組小鼠氣道下膠原纖維沉積，說明本實驗成功制造出慢性哮喘小鼠模型。C組用苦精連續(xù)給藥1周后，與B組相比，氣道上皮下膠原纖維、氣管周圍炎性細胞、氣道α-ASM的沉積量明顯減少，說明苦精可以改善哮喘氣道的炎癥及重塑。

苦精是一種苦味受體激動劑，可以作用于氣道平滑肌上的TASZR[10]，引起氣道平滑肌細胞內(nèi)鈣離子增加，而使氣道高效舒張，其舒張效果是β2受體激動劑的3倍[10]。近年發(fā)現(xiàn)，TASZR不僅存在于人類的味蕾中，在人體其他組織比如腎臟中，也發(fā)現(xiàn)了TASZR，可以發(fā)揮調節(jié)血壓的功能[14]?？汞懰幝揉橇硪环NTASZR激動劑，研究表明，苦精、氯喹均可使哮喘患者血液中TNF-α、IL-13減少[15]，而TNF-α、IL-13是與哮喘炎癥密切相關的炎性因子，IL-13還可以通過IL-4受體上調黏蛋白的表達，促使氣道上皮細胞分化為杯狀細胞，增加哮喘患者氣道黏液的分泌[16]。目前國內(nèi)外仍未見關于苦味受體激動劑與哮喘氣道炎癥及重塑關系的報道，本實驗對苦精干預后的肺組織進行HE染色、Masson染色、α-ASM免疫組織化學，結果顯示苦精干預后，氣道上皮下膠原纖維減少，α-ASM水平減少，氣道周圍炎性細胞減少，證明苦精可以減少氣道的炎癥及重塑，苦味受體激動劑或許成為治療哮喘的新型藥劑，這為哮喘治療提供了新思路。

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Effect of denatonium benzoate on airway inflammation and remodeling in asthmatic mice

YanShan1,ChengLi1,ZhaoXiaoning1,HuangYimin1,LiuLi2,LiuJingjing2，GaoFusheng2△

(1.ClinicalMedicineSchool,WeifangMedicalSchool,Weifang,Shandong261053,China;2.DepartmentofRespiratury，AffiliatedHospitalofWeifangMedicalSchool,Weifang,Shandong261000,China)

Objective To evaluate the effect of denatonium benzoaten on α-smooth muscle actin (α-SMA),subepithelial collagen and airway inflammation in asthmu mice.Methods Forty-five BALB/c mice were divided into 3 groups,normal control group (A group),asthma model group (B group),asthma model+denatonium benzoaten group(C group);α-SMA detected by using immunohistochemistry,lung sections were stained with Masson to detect subepithelial collagen,HE stain method was used to observe the airway inflammation the images were analyzed with semi-quantitative computer.Results The deposition of α-SMA、subepithelial collagen and inflammation degree in C group was significantly reduced compared with B group,the difference were statistically significant(P<0.05).Conclusion Denatonium benzoaten can improve airway remodeling in asthmatic mice.

bitter taste receptor;denatonium benzoate;asthma;airway inflammation;airway remodeling

閆珊(1989-)，碩士，主要從事呼吸疾病研究?！?/p>

，E-mail:gaofs888@163.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.06.010

R562.1

A

1671-8348(2017)06-0752-03

2016-10-20

2016-11-18)