自體富血小板凝膠治療糖尿病皮膚慢性難愈合創(chuàng)面的機(jī)制及臨床應(yīng)用進(jìn)展

劉 風(fēng) 綜述，簡華剛 審校

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院急診外科 400010)

·綜 述·

自體富血小板凝膠治療糖尿病皮膚慢性難愈合創(chuàng)面的機(jī)制及臨床應(yīng)用進(jìn)展

劉 風(fēng) 綜述，簡華剛△審校

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院急診外科 400010)

富血小板凝膠;富血小板血漿;糖尿病皮膚慢性難愈合創(chuàng)面

慢性難愈合創(chuàng)面即無法通過正常有序而及時的修復(fù)過程達(dá)到解剖和功能上的完整狀態(tài)，常常是二期愈合的傷口[1]。臨床上指各種原因形成的創(chuàng)面，經(jīng)一個月以上規(guī)范治療未能愈合，也無愈合傾向者。20世紀(jì)我國人民群眾體表慢性難愈合創(chuàng)面發(fā)生原因主要為創(chuàng)傷感染、壓迫性潰瘍、靜脈性潰瘍、糖尿病潰瘍和其他因素。隨著經(jīng)濟(jì)和社會結(jié)構(gòu)出現(xiàn)的變化，疾病譜也隨之發(fā)生了相應(yīng)的改變。糖尿病潰瘍已經(jīng)成為我國體表慢性難愈合創(chuàng)面的首要原因[2]。糖尿病神經(jīng)病變、血管病變和感染是糖尿病皮膚慢性難愈合創(chuàng)面延遲愈合甚至不愈合的三大基本要素，三者共同作用，導(dǎo)致組織壞死、潰瘍和壞疽。傳統(tǒng)治療方法如有效徹底的清創(chuàng)可使慢性創(chuàng)面趨于急性化，改善局部微環(huán)境，加快創(chuàng)面愈合，但對糖尿病皮膚慢性難愈合創(chuàng)面的效果不甚理想，截肢率仍較高。自體富血小板凝膠(autologous platelet-rich gel,APG)的概念被首次提出以來，先后應(yīng)用于骨科、頜面外科、燒傷整形科等領(lǐng)域創(chuàng)面的治療，取得較好的療效。APG相繼應(yīng)用于糖尿病皮膚慢性難愈合創(chuàng)面的治療，經(jīng)大量研究證實(shí)，創(chuàng)面局部應(yīng)用APG可促進(jìn)組織修復(fù)和再生，促進(jìn)創(chuàng)面愈合，已成為糖尿病皮膚慢性難愈合創(chuàng)面治療的有效手段之一。

1 APG的制備及成分

APG是患者自身外周靜脈血通過離心、濃縮、分離后，制得自體富血小板血漿(autologous platelet-rich plasma,APRP)，其中含有高濃度的血小板、數(shù)量不等的白細(xì)胞及少量血漿，APRP與凝血酶-鈣劑按10∶1比例混合后凝固形成的凝膠狀物質(zhì)，即為APG。APG形成過程中，血小板活化并釋放大量生長因子和細(xì)胞因子等生物活性物質(zhì)，同時纖維蛋白形成，并交聯(lián)形成纖維蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[3]。創(chuàng)面局部應(yīng)用APG需聯(lián)合糖尿病基礎(chǔ)治療及潰瘍局部處理等綜合治療，需徹底清除創(chuàng)面及竇道內(nèi)壞死組織，然后將制備的APG均勻噴灑至創(chuàng)面表面或注射至深部竇道內(nèi)，表面以凡士林油紗覆蓋。1周1次或1周2次進(jìn)行治療。

2 APG的有效性和質(zhì)量控制

APG的制備包括采血、離心分離濃縮血小板、激活血小板3個步驟，制備的方案決定其有效性和質(zhì)量。不同文獻(xiàn)制備APG的方案不同，主要差別在于離心加速度和離心時間、離心次數(shù)及抗凝劑和血小板激活劑的類型。采血時，需排除患者靜脈血管壁損傷以確保血小板的完整性，離心的過程要求回收大量未被激活的血小板，是決定APG有效性的關(guān)鍵步驟。Perez等[4]應(yīng)用全血的物理性質(zhì)，比較紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板在重力和離心力作用下的運(yùn)動速度，將全血中血細(xì)胞分離。全血在離心管中經(jīng)離心后血小板和少量白細(xì)胞存在于上清液中，底層主要是紅細(xì)胞，兩者中間的棕黃色薄膜樣物質(zhì)主要是白細(xì)胞。通過調(diào)節(jié)離心過程中的操作變量，如離心力、離心時間、血細(xì)胞比容，調(diào)節(jié)和控制APG中血小板的質(zhì)量和有效性。血小板的最高回收率可通過較大的離心力和較短的離心時間或者較小的離心力和較長的離心時間來實(shí)現(xiàn)。通過觀察得出，較大離心力會破壞血小板的完整性，從而影響血小板的功能，而較小離心力如100×g離心300～400 s獲得完整血小板同時，其血小板回收率最大達(dá)70%。Araki等[4]以70×g離心全血10 min，血小板回收率達(dá)70%～80%。抽取全血后，通過稀釋法獲得適當(dāng)?shù)难?xì)胞比容可提高血小板回收率[5]。

3 糖尿病皮膚慢性難愈合創(chuàng)面的特殊性

創(chuàng)面愈合是一個復(fù)雜而有序的生物學(xué)過程，創(chuàng)面愈合過程在機(jī)體的協(xié)調(diào)下呈現(xiàn)高度的有序性和完整性，任何因素異常都有可能導(dǎo)致創(chuàng)面的延遲愈合或不愈合。糖尿病皮膚慢性難愈合創(chuàng)面延遲愈合主要與創(chuàng)面局部生長因子缺乏有關(guān)[6-8]，多種原因致其生長因子減少和活性降低，主要包括：糖基化改變和神經(jīng)血管病變等多因素綜合作用，使創(chuàng)面局部炎癥修復(fù)細(xì)胞分泌功能障礙和凋亡增多，生長因子分泌減少[7]；糖尿病中央和周圍血管病變，使創(chuàng)面供血不足，局部代謝物質(zhì)排泄障礙、生長因子等其他營養(yǎng)物質(zhì)供給不足[6]；以及糖尿病皮膚組織中糖代謝產(chǎn)物使生長因子糖基化，創(chuàng)面局部基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)可降解生長因子，使其活性改變、功能降低[6]。此外，皮膚組織中糖代謝產(chǎn)物異常蓄積，使表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等修復(fù)細(xì)胞增殖障礙、凋亡增加，創(chuàng)面修復(fù)過程中出現(xiàn)表皮細(xì)胞不易上皮化、細(xì)胞外基質(zhì)合成和降解失衡、血管舒縮功能障礙等，導(dǎo)致急性創(chuàng)面慢性化，并逐漸向不愈合方向進(jìn)展[9-10]。

4 APG在糖尿病皮膚慢性難愈合創(chuàng)面治療中的可能機(jī)制

局部應(yīng)用APG可加速創(chuàng)面愈合、減少創(chuàng)面疼痛、減少出血和分泌物滲出[11]。其作用的機(jī)制主要與血小板活化后脫顆粒釋放多種生長因子有關(guān)[12-13]。其次，APG中含有大量纖維蛋白，并交聯(lián)形成纖維蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可作為生物支架，也可牽拉創(chuàng)面使創(chuàng)緣向中心移動，誘導(dǎo)創(chuàng)面修復(fù)過程快速而有效進(jìn)行。APG呈凝膠狀，可封閉保護(hù)創(chuàng)面避免外界污染，并在創(chuàng)面表面形成潮濕低氧的環(huán)境，有利于成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管增生、肉芽組織再生及創(chuàng)緣表皮細(xì)胞的爬行，加速創(chuàng)面愈合。同時，APG中活化的血小板可抑制創(chuàng)面局部細(xì)菌生長，發(fā)揮抗菌作用[14-15]。此外，APG中的生長因子可誘導(dǎo)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)產(chǎn)生，而MMPs合成受抑，MMPs和TIMP比例下降可減緩局部膠原及其他細(xì)胞外基質(zhì)和生長因子等的降解，促進(jìn)創(chuàng)面愈合[7,16]。

4.1 APG中生長因子的作用 APRP與凝血酶-鈣劑混合形成APG后，血小板被迅速激活，活化的血小板脫顆粒釋放大量生長因子，如血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor-β，TGF-β)、胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor,IGF-1)、表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,b-FGF)等[12-13]，這些生長因子在創(chuàng)面愈合的各個階段相互作用，促進(jìn)創(chuàng)面愈合。PDGF有PDGF-AA，PDGF-AB，PDGF-BB 3種亞型。PDGF是最先分泌進(jìn)入創(chuàng)面發(fā)揮作用的生長因子，趨化并激活巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，產(chǎn)生其他生長因子和細(xì)胞因子促進(jìn)創(chuàng)面愈合；誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞、纖維母細(xì)胞等的遷移、增殖和分化，刺激膠原合成；促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖，促進(jìn)血管、神經(jīng)生成。VEGF對內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖和分化進(jìn)行調(diào)控，并誘導(dǎo)新生血管形成，血管形成后，將改善創(chuàng)面局部血供，并提供氧氣及營養(yǎng)物質(zhì)，加快創(chuàng)面愈合。TGF-β可促進(jìn)表皮細(xì)胞、纖維母細(xì)胞、巨噬細(xì)胞向創(chuàng)面遷移，促使成纖維細(xì)胞增殖，并分泌纖維蛋白、黏蛋白，加快細(xì)胞外基質(zhì)合成、轉(zhuǎn)移并塑形，并參與瘢痕的重塑和攣縮，促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)并閉合創(chuàng)面。IGF-1可促進(jìn)軟骨細(xì)胞的有絲分裂和增殖，加快肌肉、軟組織及神經(jīng)損傷性愈合。另外，EGF、b-FGF等也不同程度參與慢性創(chuàng)面愈合過程，協(xié)同促進(jìn)創(chuàng)面愈合[17-19]。

4.2 APG中纖維蛋白的作用 APG中富含纖維蛋白，由凝血酶激活A(yù)PRP中纖維蛋白原而形成的四分子結(jié)構(gòu)纖維蛋白，其分子結(jié)構(gòu)彈性好，與生理性凝集的三分子結(jié)構(gòu)纖維蛋白相比，可有效地網(wǎng)羅大量的細(xì)胞成分和生長因子[20]。纖維蛋白交聯(lián)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可填補(bǔ)創(chuàng)面缺損并封閉潰瘍竇道，避免外周不利環(huán)境因素刺激，同時作為生物支架，為生長因子和趨化細(xì)胞的聚焦提供附著場所。創(chuàng)面局部應(yīng)用APG后， 一部分生長因子釋放后被纖維支架內(nèi)基質(zhì)蛋白黏附并綁定[3]，這不僅可防止生長因子、細(xì)胞因子等生物活性物質(zhì)在創(chuàng)面的大量流失，還可以延長APG在創(chuàng)面局部作用時間。

4.3 APG的抗菌作用 近年來體外研究表明APG對敏感金黃色葡萄球菌具有抗菌作用[14-15]，受試者均為健康成人。Chen等[14]通過體外研究，抽取糖尿病慢性難愈合創(chuàng)面受試者全血制備的APG的抗菌作用，結(jié)果顯示APG對敏感金黃色葡萄球菌具有抗菌活性。其發(fā)揮抗菌作用可能與APG中富含活化的血小板有關(guān)，其分泌生長因子同時，可釋放血小板殺菌蛋白(platelet microbicidal proteins,PMPs)，PMPs包含一系列抗菌活性物質(zhì)，如血小板因子-4、結(jié)締組織活性肽-3、血小板堿性蛋白、纖維蛋白肽等。PMPs通過接觸細(xì)菌細(xì)胞膜并改變其通透性，然后進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)抑制大分子物質(zhì)合成，發(fā)揮抗菌作用[14]。血小板活化后還可釋放趨化因子、組胺、腺苷、免疫球蛋白等生物活性物質(zhì)，可直接誘導(dǎo)血小板聚集，也可通過間接趨化白細(xì)胞發(fā)揮殺菌、滅菌作用[21-23]。

4.4 APG可維持MMPs系統(tǒng)平衡 糖尿病合并嚴(yán)重細(xì)菌感染的慢性創(chuàng)面，常伴有大量組織失活，組織異常炎性反應(yīng)產(chǎn)生持續(xù)高濃度的前炎性因子，導(dǎo)致創(chuàng)面產(chǎn)生MMPs水平異常升高、TIMP產(chǎn)生失衡，在失活組織被降解的同時，也破壞大量生長因子和細(xì)胞因子。相關(guān)研究表明，局部應(yīng)用APG后，創(chuàng)面內(nèi)TIMP-1濃度增高、MMPs與TIMP-1比例下降[7,16]。其作用過程可能與局部組織中TGF-β1水平上調(diào)導(dǎo)致MMPs產(chǎn)生受抑、TIMP-1合成增加有關(guān)[16,24]。MMPs與TIMP-1比例下降可減少局部膠原、細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞因子和生長因子的降解，加快創(chuàng)面愈合。

5 APG治療糖尿病皮膚慢性難愈合創(chuàng)面的臨床療效

局部應(yīng)用APG聯(lián)合糖尿病基礎(chǔ)治療及潰瘍局部處理等綜合措施治療糖尿病皮膚慢性創(chuàng)面過程中，APG可加速創(chuàng)面愈合、減少創(chuàng)面疼痛、減少出血和分泌物滲出[11]。Lan等[25]通過前瞻性、隨機(jī)對照研究，將符合標(biāo)準(zhǔn)的117例糖尿病皮膚慢性難愈合創(chuàng)面隨機(jī)分為APG組和對照組，每兩周進(jìn)行1次治療評估，療程12周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)創(chuàng)面愈合面積減少比率大于或等于80%，APG組為96.6%，對照組為72.4%；達(dá)到完全愈合或者慢性創(chuàng)面經(jīng)治療后植皮達(dá)完全愈合者，APG組為84.8%，對照組為69.0%(P=0.026)。Driver等[26]通過前瞻性、隨機(jī)對照雙盲法研究，將符合標(biāo)準(zhǔn)的72例糖尿病皮膚慢性難愈合創(chuàng)面患者隨機(jī)分為APG組和對照組，每兩周進(jìn)行1次治療評估，療程12周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)潰瘍愈合率，APG組為68.4%，對照組為42.9%，矯正潰瘍面積大小極端值后APG組為81.3%，對照組為42.1%(P=0.036)。以上研究均未發(fā)現(xiàn)與治療相關(guān)嚴(yán)重不良事件發(fā)生。結(jié)果表明，局部應(yīng)用APG可改善創(chuàng)面愈合等級、縮短創(chuàng)面愈合時間、加快創(chuàng)面愈合速度。局部應(yīng)用APG治療糖尿病皮膚慢性難愈合創(chuàng)面安全有效，聯(lián)合糖尿病基礎(chǔ)治療及潰瘍局部處理等綜合治療，可作為促進(jìn)糖尿病皮膚慢性難愈合創(chuàng)面愈合的有效治療手段。

綜上所述，局部應(yīng)用APG治療糖尿病皮膚慢性難愈合創(chuàng)面安全有效，需建立在糖尿病綜合治療及創(chuàng)面局部處理基礎(chǔ)之上，如控制高血糖、高血脂、高血壓，根據(jù)創(chuàng)面分泌物培養(yǎng)結(jié)果選用敏感抗菌藥物，創(chuàng)面徹底清創(chuàng)，必要時采用血管重建術(shù)或介入手術(shù)改善嚴(yán)重缺血，戒煙戒酒等[27]。創(chuàng)面局部應(yīng)用APG主要通過活化的血小板脫顆粒釋放多種生長因子促進(jìn)創(chuàng)面愈合，創(chuàng)面局部應(yīng)用APG治療3 d后，肉芽組織中的PDGF-bb、VEGF、IGF-1、EGF、TGF-b1水平較前升高兩倍，第9天時達(dá)高峰，15 d后下降至原有水平，生長因子濃度的改變正好與創(chuàng)面面積的減少重疊[25]。APG中血小板活性物質(zhì)、纖維蛋白等也在創(chuàng)面愈合中發(fā)揮作用。APG由自身外周靜脈血制備，可避免傳染性疾病傳播及免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生，治療過程中未發(fā)現(xiàn)與治療相關(guān)嚴(yán)重不良事件發(fā)生。然而，局部組織內(nèi)各種生物活性物質(zhì)觀測較為困難，少有研究報告生長因子以外的生物活性物質(zhì)在創(chuàng)面局部的變化，生長因子間、生長因子與修復(fù)細(xì)胞間相互作用的機(jī)制不甚明確，現(xiàn)有證據(jù)不能證實(shí)APG在慢性難愈合創(chuàng)面治療中的全部作用機(jī)制，需進(jìn)一步探索。臨床制備APRP大多采用手工分離，血小板濃度是治療效果的關(guān)鍵，何種血小板濃度促進(jìn)創(chuàng)面愈合療效最佳，目前尚無確切數(shù)據(jù)。糖尿病皮膚慢性難愈合創(chuàng)面合并低清蛋白、低血小板、低血紅蛋白等情況，自體或健康受試者全血制備的富血小板凝膠療效是否存在差異，需進(jìn)一步大樣本隨機(jī)對照研究證實(shí)。

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劉風(fēng)(1991-)，碩士，主要從事糖尿病足研究?！?/p>

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10.3969/j.issn.1671-8348.2017.06.042

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2016-10-16

2016-11-16)