載脂蛋白C1表達(dá)與血管內(nèi)膜增生關(guān)系的初步研究

陳含冰，張雨晴，劉津堯，劉領(lǐng)弟，聶 磊，韓 梅

(河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，河北 石家莊 050017)

·論 著·

載脂蛋白C1表達(dá)與血管內(nèi)膜增生關(guān)系的初步研究

陳含冰，張雨晴，劉津堯，劉領(lǐng)弟，聶 磊，韓 梅*

(河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，河北 石家莊 050017)

目的探討載脂蛋白(apolipoprotein, APO)C1表達(dá)與血管重塑的關(guān)系。方法利用頸總動脈結(jié)扎術(shù)制備血管內(nèi)膜增生模型，采用HE染色檢測內(nèi)膜增生情況，采用Western blot檢測血管組織APOC1與SM22α蛋白表達(dá)水平，采用組織免疫熒光檢測APOC1在血管壁的分布。結(jié)果隨著結(jié)扎時間的延長，新生內(nèi)膜明顯增厚，小鼠頸總動脈結(jié)扎術(shù)后不同時間點，血管新生內(nèi)膜中SM22α表達(dá)量逐漸降低，APOC1表達(dá)量逐漸升高，兩者變化趨勢相反。免疫熒光染色亦顯示，在增厚的內(nèi)膜區(qū)，APOC1熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，與內(nèi)膜厚度呈正相關(guān)。結(jié)論APOC1表達(dá)上調(diào)可能參與平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化和血管重塑過程。

血管內(nèi)膜；載脂蛋白C類；肌，平滑

載脂蛋白C1是肝臟中表達(dá)的一種蛋白質(zhì)，是構(gòu)成血漿脂蛋白的主要蛋白質(zhì)成分，參與脂質(zhì)在血漿中的轉(zhuǎn)運。近來越來越多的研究表明，APOC1在糖尿病和動脈粥樣硬化中亦都扮演重要角色[1-3]。SM22α作為血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)早期的分化標(biāo)志物之一，不僅在細(xì)胞骨架組建和平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要作用[4]，而且還參與調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激、炎癥、遷移和增殖[5-8]，對穩(wěn)定血管內(nèi)環(huán)境具有重要意義。SM22α表達(dá)異常與動脈粥樣硬化有著密切的關(guān)系，是VSMC表型轉(zhuǎn)化和血管重塑的一種重要標(biāo)志物[7-9]。我室用轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序技術(shù)研究證實，SM22α基因敲除小鼠的血管炎性基因表達(dá)增強(qiáng)，其中APOC1是明顯上調(diào)的基因之一，發(fā)生動脈粥樣硬化的易感性增大[10]。血管內(nèi)膜增生是動脈粥樣硬化斑塊形成的一種常見病理表現(xiàn)，在此過程中，APOC1表達(dá)變化以及與SM22α的關(guān)系鮮有報道，本研究以此入手，利用頸總動脈結(jié)扎法制備血管內(nèi)膜增生小鼠模型，以SM22α表達(dá)變化作為生物標(biāo)志，探究APOC1與新生內(nèi)膜形成和血管重塑之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試劑和動物

1.1.1 實驗動物 野生型C57BL/6小鼠及專用標(biāo)準(zhǔn)鼠糧由河北省實驗動物中心提供，取8～12周齡小鼠建模。所有動物實驗均按照河北省實驗動物中心動物管理條例進(jìn)行。

1.1.2 主要試劑 SM α-actin抗體購自Epitomics公司(cat.no.1184-1)，APOC1抗體購自BBI公司(cat.no.AB21657b)，異氟烷購自魯南貝特制藥公司，PMSF購自Sigma公司，TritonX-100購自MP Biomedicals公司，其他化學(xué)試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器 小動物麻醉機(jī)(Matrx公司)，正置顯微鏡(Leica公司)，倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS公司)，F(xiàn)RESCO 17低溫離心機(jī)(Thermo公司)，冰凍切片機(jī)(Leica公司)，Odyssey紅外熒光成像系統(tǒng)(LICOR公司)，RC26Plus低溫離心機(jī)(SORVALL公司)，Centrifuge 5415D離心機(jī)(Eppendorf公司)，酶標(biāo)儀(Thermo公司)，超低溫冰箱(三洋公司)，水平搖床(Thermo公司)，制冰機(jī)(三洋公司)，高壓蒸汽滅菌鍋(三洋公司)。

1.2 實驗方法 ①小鼠頸總動脈結(jié)扎模型制備動物手術(shù)全程于小動物麻醉機(jī)下進(jìn)行，異氟烷吸入式麻醉。小鼠頸部常規(guī)備皮消毒，使用眼科剪于頸部正中作一約1 cm左右切口，體式顯微鏡下尋找左側(cè)頸總動脈，小心分離迷走神經(jīng)，于左側(cè)頸總動脈分叉處近心端結(jié)扎?？p合切口。分別于結(jié)扎前和結(jié)扎后7、14、21和28 d取結(jié)扎處血管，用于后續(xù)實驗。②血管組織冰凍切片與HE染色取術(shù)后不同時間點小鼠經(jīng)乙醚吸入麻醉后，分離血管，剝離周圍結(jié)締組織，迅速用OCT冰凍切片包埋劑包埋，隨后轉(zhuǎn)移至液氮中快速冷凍。將包埋好的樣品放至已預(yù)冷的冰凍切片機(jī)冷凍室內(nèi)(-25 ℃)，固定于樣品托上，切成5 μm厚的切片，置于-80 ℃低溫冰箱保存。取出低溫凍存的切片，用預(yù)冷的丙酮溶液固定5 min后水洗4 min，蘇木精染核1～2 min后水洗3次，每次3 min。然后將切片放入1%鹽酸乙醇溶液中3～5 s，之后水洗4 min。用伊紅染液染色3～5 s后水洗3次，每次3 min，之后用70%乙醇，80%乙醇，90%乙醇，95%及無水乙醇梯度脫水。再用二甲苯透明后封片。用正置顯微鏡觀察并拍照。③免疫熒光染色分析將冰凍切片置于預(yù)冷的丙酮溶液固定5 min后用TBS緩沖液洗次，每次5 min。而后用5%標(biāo)準(zhǔn)山羊血清封閉30 min，加入抗APOC1抗體(1∶100)于4 ℃濕盒中過夜。TBS緩沖液洗滌后加入熒光二抗(1∶50)濕盒中避光30 min。再用TBS緩沖液洗滌，1∶20 000 DAPI 染核。TBS緩沖液洗滌后80 %甘油封片。用熒光顯微鏡觀察并拍照。④細(xì)胞總蛋白提取與Western blot分析將血管組織用裂解液充分勻漿后離心收集上清，用改良的Lowry法進(jìn)行蛋白定量。取等量蛋白樣品加入5×SDS上樣緩沖液于100 ℃沸水浴加熱5 min使蛋白變性。冷卻后，用微量加樣器上樣于10 %凝膠加樣孔內(nèi)。90 V穩(wěn)壓電泳約30 min，待溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后，換用120 V穩(wěn)壓電泳，至溴酚藍(lán)前緣移動到凝膠底部，取出凝膠。用25 V恒壓進(jìn)行半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜20～30 min。取出聚偏氟乙烯膜用含5 %脫脂奶粉的TTBS封閉液37℃封閉2 h后用一抗4 ℃封閉過夜。用TTBS溶液洗膜3×5 min后，二抗避光封閉1 h，再用TTBS溶液洗膜3×5 min后Odyssey紅外熒光成像系統(tǒng)直接掃描成像。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料比較分別采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 頸總動脈結(jié)扎誘導(dǎo)內(nèi)膜增生 HE染色結(jié)果顯示，小鼠頸總動脈結(jié)扎術(shù)后7 d時，血管內(nèi)膜粗糙，可見不規(guī)則增生，內(nèi)膜細(xì)胞形態(tài)不一，血管中膜血管平滑肌(vascular smooth muscle cell,VSMC)排列紊亂。隨結(jié)扎時間延長，增生內(nèi)膜逐漸增厚，管腔逐漸狹窄(圖1)。

圖1 小鼠頸總動脈結(jié)扎術(shù)后不同時間點，血管內(nèi)膜增生情況(HE染色×400)

2.2 SM22α和APDC1表達(dá) 小鼠頸總動脈結(jié)扎術(shù)后不同時間點，血管新生內(nèi)膜中SM22α表達(dá)量逐漸降低，結(jié)扎各組均低于結(jié)扎前，結(jié)扎時間越長表達(dá)量越低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。APOC1表達(dá)與SM22α的表達(dá)相反，Western blot分析以及組織免疫熒光染色結(jié)果均顯示，小鼠頸總動脈結(jié)扎術(shù)后不同時間點，APOC1表達(dá)量隨結(jié)扎時間延長逐漸升高，各結(jié)扎組均高于結(jié)扎前，結(jié)扎時間越長，表達(dá)量越高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；但結(jié)扎7 d組與結(jié)扎14 d組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1，圖2。

免疫熒光染色亦顯示，在增厚的內(nèi)膜區(qū)，APOC1熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，與內(nèi)膜厚度呈正相關(guān)(圖3A，3B)。結(jié)果提示APOC1可能與VSMC增殖具有因果關(guān)系。

表1 SM22α及APOC1表達(dá)比較Table 1 Comparison of protein expression of SM22α，APOC1

*P<0.05與結(jié)扎前比較 #P<0.05與結(jié)扎7 d比較 △P<0.05與結(jié)扎14 d比較 ☆P<0.05與結(jié)扎21 d(SNK-q檢驗)

圖2 小鼠頸總動脈結(jié)扎術(shù)后不同時間，SM22α表達(dá)量逐漸降低

圖3 小鼠頸總動脈結(jié)扎術(shù)后不同時間，APOC1表達(dá)量逐漸升高

3 討 論

APOC1在肝臟、肺、腎臟、腦組織、脾臟、皮膚、脂肪組織、中央神經(jīng)系統(tǒng)等各種器官和組織中均有表達(dá)，并且在脂質(zhì)代謝中扮演多種角色[11]，APOC1還參與了多種疾病的發(fā)生和發(fā)展。Ko等[12]發(fā)現(xiàn)，APOC1在晚期肺癌中高表達(dá)，并認(rèn)為APOC1將能作為肺癌新的診斷和預(yù)后的生物標(biāo)記。蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組分析表明APOC1和腹主動脈瘤(abdominal aortic aneurysm，AAA)具有相關(guān)性，APOC1可能是AAA一種新型的生物標(biāo)志物[13]。另有研究表明APOC1基因多態(tài)性與晚發(fā)性阿爾茨海默癥患者的認(rèn)知功能障礙有關(guān)[14-16]。APOC1是膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白(cholesteryl ester transfer protein，CETP)的主要血漿抑制劑，主要抑制脂蛋白結(jié)合到LDL和VLDL受體上。有研究表明，在“磷脂流出”過程中有19項途徑都與APOC1的升高相關(guān)，而“磷脂流出”與動脈粥樣硬化進(jìn)程有著密切關(guān)系[10-11,17-18]。此外，另有研究顯示，人類APOC1轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟和皮膚膽固醇含量升高、血清三酰甘油和游離脂肪酸的水平增加[19]，APOC1可能有助于動脈粥樣硬化的發(fā)生[20]。SM22α是血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的敏感標(biāo)志物，血管內(nèi)膜損傷局部釋放的炎性因子和細(xì)胞因子等可誘導(dǎo)中膜平滑肌細(xì)胞去分化轉(zhuǎn)變成合成型并獲得增殖和遷移能力，而在合成型的平滑肌細(xì)胞中低表達(dá)或不表達(dá)SM22α。

本研究利用頸總動脈結(jié)扎術(shù)建立小鼠血管內(nèi)膜增生模型，觀察到SM22α的表達(dá)活性隨著新生內(nèi)膜形成而逐漸減少，其變化趨勢與APOC1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。由于實驗重復(fù)次數(shù)較少，樣本量不足等原因?qū)е翧POC1在結(jié)扎7 d與結(jié)扎14 d的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，后續(xù)我們將進(jìn)一步加大樣本量以減小實驗誤差。根據(jù)SM22α表達(dá)水平的變化可以判斷血管重構(gòu)過程，是衡量血管穩(wěn)態(tài)與血管重構(gòu)進(jìn)程的客觀指標(biāo)，具有對外界刺激敏感、變化幅度大、易檢出的特點，其參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能和刺激應(yīng)答，既是細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白，又是多種信號途徑的調(diào)節(jié)分子，鑒于其在血管穩(wěn)態(tài)與血管疾病中的功能，研究者們已將其作為研究血管生物學(xué)和血管病理機(jī)制的良好靶分子。關(guān)于SM22α表達(dá)降低與APOC1表達(dá)升高之間是否具有因果關(guān)聯(lián)，以及在內(nèi)膜增生中的意義和作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

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(本文編輯：劉斯靜)

The preliminary study on correlation between APOC1 and vascular neointimal formation

CHEN Han-bing， ZHANG Yu-qing， LIU Jin-yao， LIU Ling-di， NIE Lei， HAN Mei*

(DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,CollegeofBasicMedicine,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China)

Objective To discuss the correlation of apolipoprotein (APO) C1 expression and neointimal formation. Methods The intimal hyperplasia model of the mice was prepared by the common carotid artery ligation. HE staining was used to test the neointima. Western blot was used to detect the protein expression of APOC1 and SM22α, Immunofluorescence was used to detect the protein expression and distribution of APOC1. Results With the extension of time of ligation,the intimal hyperplasia was observed in the carotid arteries of mice after the ligation. At different time points of the common carotid artery ligation. the expression of SM22α was decreased in neointimal region. The expression of APOC1 was gradually increased, which was contrary to that of SM22. Immunofluorescence staining also showed that the fluorescence intensity of APOC1 was enhanced in the area of thickened intima, and it is positively correlated with the thickness of intima. Conclusion The expression of APOC1 may be involved in vascular smooth muscle cell switching and vascular remodeling.

tunica intima; apolipoproteins C; muscle, smooth

2016-05-18；

2016-06-16

國家自然科學(xué)基金課題(91439114，31271222)

陳含冰(1994-)，女，河北衡水人，河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院2012級臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)本科生。

*通訊作者。E-mail:hanmei@hebmu.edu.cn

R341

A

1007-3205(2017)02-0125-04

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.02.001