柯薩奇病毒B組4型河南分離株VP1區(qū)基因特征分析

許玉玲 王海霞 衛(wèi)海燕 黃學(xué)勇

450016 鄭州，河南省疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所 河南省傳染病病原生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

人類腸道病毒B組的柯薩奇B4病毒(CoxB4)感染機(jī)體后，可以導(dǎo)致無臨床癥狀的隱性感染，也可引起多種臨床疾病，如手足口病、腦膜炎、咽峽炎、發(fā)熱出疹性疾病、兒童多動(dòng)癥(ADHD)、胰腺炎和兒童I型糖尿病等。2013年從河南手足口病監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)分離出8株該病毒，對(duì)其進(jìn)行VP1區(qū)擴(kuò)增，分析序列特征，并與其他疾病CoxB4分離株進(jìn)行VP1區(qū)基因特征分析，查找可能與致病機(jī)制相關(guān)的基因特征，為手足口病的深入研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1樣本來源糞便標(biāo)本來自2013年河南省各地市疾病預(yù)防控制中心和醫(yī)院的手足口患兒，-70 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)按照手足口病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方案，對(duì)糞便進(jìn)行前處理，離心后取上清200 μl，用Qiagen公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒提取病毒RNA。江蘇碩士有限公司的單通道EV71、CA16和腸道通用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒檢測(cè)標(biāo)本。反應(yīng)體系為25 μl： RT-PCR反應(yīng)液7.5 μl，相應(yīng)反應(yīng)液4 μl，酶混合液5 μl，純水3.5 μl，模板RNA 5 μl，充分混勻，6 000×g離心60 s，使用BIORAD- iQ5儀器進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)。擴(kuò)增程序：50 ℃ 30 min；95 ℃ 5 min； 95 ℃ 10 s，55 ℃ 40 s(收集熒光)，45個(gè)循環(huán)，實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性和陽性對(duì)照，結(jié)合Ct值和擴(kuò)增曲線判讀結(jié)果。

1.3病毒分離和鑒定將腸道通用檢測(cè)陽性的標(biāo)本，每份選擇200 μl接種人橫紋肌肉瘤細(xì)胞(human rhabdomyosarcoma, RD) 和人喉癌上皮細(xì)胞(human laryngeal carcinoma, HEp-2)，置于5%CO2、36 ℃培養(yǎng)箱，連續(xù)培養(yǎng)3～7 d，每天觀察記錄細(xì)胞變化，每個(gè)標(biāo)本傳2代，若均沒有出現(xiàn)致細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect, CPE)，則判為陰性，只要一種細(xì)胞出現(xiàn)了腸道病毒特異CPE，則在CPE達(dá)到 +++時(shí)收獲細(xì)胞，并提取病毒RNA。先用通用引物008,013(見表1)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序、網(wǎng)上比對(duì)獲得基因型，選擇基因型為CoxB4的毒株進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.4VP1基因引物設(shè)計(jì)利用生物學(xué)軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)VP1區(qū)引物，序列參考CoxB4病毒中國分離株(KF781524)和原型株(X05690)的VP1序列，見表1。引物由上海生工生物科技有限公司合成。

表1 腸道病毒通用和CoxB4 VP1擴(kuò)增引物

1.5CoxB4毒株VP1區(qū)擴(kuò)增取出已鑒定為CoxB4的RNA，試劑用QIAgen onestep RT-PCR kit(Cat. No. 210212)，反應(yīng)體系50 μl：5×buffer 10 μl，Enzymix 2 μl，Rnasin 0.2 μl，上下游引物(25 μmol/L)各0.8 μl，dNTP 2 μl， RNA4 μl，H2O 29.2 μl。反應(yīng)條件為：50 ℃ 30 min；95 ℃ 15 min；94 ℃ 40 s，50 ℃ 50 s，72 ℃ 60 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。實(shí)驗(yàn)設(shè)立陰性對(duì)照。取PCR產(chǎn)物5 μl在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳分析，陽性產(chǎn)物送南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6生物信息學(xué)分析使用生物學(xué)軟件ATGC進(jìn)行序列拼接，Clustalx1.83進(jìn)行序列比對(duì)，BioEdit進(jìn)行VP1剪齊，Mega4.0軟件進(jìn)行同源性分析和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，對(duì)CoxB4原型株JVB、8株CoxB4河南分離株與其他28個(gè)代表株進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析。并選擇11株不同疾病來源的病毒分離株進(jìn)行VP1區(qū)氨基酸不同位點(diǎn)分析，參比序列來自GenBank已公布序列(只列出有疾病來源的毒株，部分基因分型毒株未列出)，見表2。

表3 不同疾病COXB4分離株VP1氨基酸不同位點(diǎn)分析

注：1～3為手足口病分離株，4～6為無菌性腦膜炎分離株，7～10為糖尿病分離株，11為胸腹痛分離株(原型株JVB)

Notes： 1-3 are isolates from HFMD, 4-6 are isolates from aseptic meningitis, 7-10 are isolates from diabetes patients, 11 is isolate from patient with chest and abdominal pain (prototype strain of JVB)

2 結(jié)果

2.1熒光RT-PCR檢測(cè)結(jié)果2013年檢測(cè)手足口病糞便標(biāo)本540份，其中EV71陽性標(biāo)本290份，CA16陽性98份，腸道通用陽性134份，通用陽性標(biāo)本構(gòu)成比24.8%。

2.2病毒分離與鑒定134份標(biāo)本經(jīng)兩種細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行病毒分離，出現(xiàn)明顯CPE現(xiàn)象的有35份標(biāo)本。將這些病毒提取RNA后用腸道通用引物PCR擴(kuò)增送測(cè)序比對(duì)，確定8份為CoxB4毒株。CoxB4陽性率5.9%。

2.3VP1區(qū)基因分析所有CoxB4河南分離株VP1區(qū)核苷酸長(zhǎng)度均為852個(gè)核苷酸，編碼284個(gè)氨基酸； VP1區(qū)核苷酸同源性分析，8株河南分離株與原型株JVB為83.2%～85.8%，與糖尿病分離株為80.3%～86.0%，與其他手足口病株為90.8%～97.0%。與糖尿病患者分離株E2核苷酸差異最大達(dá)19.7%，與手足口病分離株差異最小為3.0%。

2.4遺傳進(jìn)化分析37株代表株進(jìn)化樹見圖1，CoxB4共有Genotype I～V五種基因亞型，8株河南分離株與中國近年手足口病分離株、無菌性腦膜炎分離株分布一簇，屬于Genotype V亞型。11株不同疾病來源CoxB4代表株共有14個(gè)位點(diǎn)氨基酸發(fā)生改變，3株無菌性腦膜炎分離株在14個(gè)位點(diǎn)中有12個(gè)位點(diǎn)氨基酸編碼一致，4株糖尿病分離株有6個(gè)位點(diǎn)一致，原型株JVB與糖尿病分離株Tuscany編碼位點(diǎn)完全一致，進(jìn)化樹也在一個(gè)分支，3株手足口病患者分離株有8個(gè)位點(diǎn)完全一致。手足口病分離株與糖尿病病毒株僅在氨基酸編碼位點(diǎn)575完全不同，手足口病株在該位點(diǎn)均編碼丙氨酸，而糖尿病株編碼絲氨酸，其他位點(diǎn)沒有明顯規(guī)律和特點(diǎn)，見表3。

注：▲代表CoxB4河南分離株圖1 CoxB4基于VP1區(qū)的遺傳進(jìn)化分析Note:▲ indicates Henan CoxB4 isolatesFig.1 Phylogenetic analysis based on the Cox.B4 VP1 nucleotide sequence

3 討論

腸道病毒型別有100多種，很多都可引起手足口病。 EV71和CA16一直是手足口病的主要病原體，2013年末非EV71非CA16的其他腸道病毒呈上升趨勢(shì)，CA6一度成為西安、云南、杭州等地的優(yōu)勢(shì)毒株[1-2]，CA10、CoxB5、CoxB4、Eco11等也經(jīng)常出現(xiàn)在手足口病監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)中。

CoxB4病毒屬于較易分離到的一種人類腸道病毒，和其他人腸道病毒一樣，傳播途徑為糞口和接觸傳播，兒童衛(wèi)生習(xí)慣稍差，抵抗力較低，是此類病毒的易感人群。CoxB4病毒常引起嬰幼兒腦炎、腦膜炎、心肌炎、手足口病和糖尿病[3-5]，嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)致全身多系統(tǒng)衰竭而死亡。該病毒的原型株JVB于1951年分離于美國一個(gè)胸腹痛患者的糞便標(biāo)本，1958年在糖尿病患者糞便標(biāo)本中獲得E2株，此后研究發(fā)現(xiàn)E2的變異株E2b及從糖尿病患者的胰腺組織里獲得的Tuscany分離株，近年從腦炎患者及手足口病患者中分離出多株CoxB4病毒株。全球均有該病毒暴發(fā)或散在病例的報(bào)導(dǎo)，中國臺(tái)灣在跨入2000年后，曾有多次散發(fā)和暴發(fā)報(bào)道，2004和2008年都有CoxB4感染的暴發(fā)，患者多有心肌炎癥狀[6]；2010年廣西報(bào)道一例手足口病患者感染該病毒致死亡病例[7]；同年內(nèi)蒙古從手足口病監(jiān)測(cè)系統(tǒng)中分離出多株CoxB4病毒[8]；美國、法國、丹麥、芬蘭等多個(gè)國家研究者都有該病毒發(fā)現(xiàn)的研究報(bào)道。

CoxB4病毒進(jìn)化樹基因分型的研究報(bào)道不一致，有研究者將之劃分為基因亞型I～VIII[6]，有研究者將之分為基因型I～V 5種基因亞型[8]?？赡軆烧哌x擇的基因片段并不一致，本文采用VP1全長(zhǎng)基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，與2014年內(nèi)蒙古的研究結(jié)果一致，所有CoxB4病毒共分為基因型I～V 5種基因亞型，這8株河南分離株與2010年廣西手足口病分離株遺傳距離最近，與云南、山東省無菌性腦膜炎患者分離株同源性較高，處于同一簇分支，屬于基因型V基因亞型；與糖尿病病毒分離株E2b和E2遺傳距離較遠(yuǎn)，糖尿病分離株大都位于基因型II亞型；而原型株JVB分離于胸腹痛患者，它與2007年美國一糖尿病患者分離株在同一分支，同屬于基因型I亞型。

CoxB4病毒可引起的疾病譜廣泛，有糖尿病、兒童多動(dòng)癥、手足口病、心肌炎、腦膜炎、胸腹痛等。周密報(bào)道引起糖尿病的病毒株在基因非結(jié)構(gòu)蛋白3 A區(qū)氨基酸變異與原型株有多個(gè)位點(diǎn)不同，提示3 A蛋白的變異可能會(huì)改變病毒復(fù)制增殖的能力[9]。VP1是決定腸道病毒血清分型的主要部位，屬于高度變異區(qū)，本研究選擇幾種不同疾病分離獲得的病毒株進(jìn)行VP1核苷酸和氨基酸異同分析，嘗試發(fā)現(xiàn)糖尿病株、手足口病分離株、胸腹痛分離株(原型株JVB)、腦膜炎分離株等在主要抗原決定簇中的基因差別。分析發(fā)現(xiàn)，CoxB4河南分離株VP1區(qū)均為852 bp，與GenBank公布的其他分離株VP1核苷酸相似性為80.3%～97.0%，氨基酸相似性96.1%～100%；與糖尿病患者分離株E2核苷酸差異最大達(dá)19.7%，與手足口病分離株差異最小為3.0%。VP1基因序列的改變導(dǎo)致氨基酸編碼改變，手足口病分離株、糖尿病分離株和原型株在VP1氨基酸編碼中共有14個(gè)位點(diǎn)不一致，而同種疾病來源的病毒株VP1氨基酸編碼不相同位點(diǎn)較少，糖尿病分離株間、手足口病分離株間氨基酸同源性可達(dá)98%以上，糖尿病和手足口病分離株僅在位點(diǎn)575是完全不同的，手足口病株在該位點(diǎn)均編碼丙氨酸，而糖尿病株均為絲氨酸，是否此位點(diǎn)氨基酸的改變引起不同疾病的發(fā)生還需要大量病毒株基因序列的比對(duì)及后續(xù)更深入的研究。患者臨床疾病的出現(xiàn)由病毒的致病力、發(fā)病機(jī)制決定，但也與個(gè)人體質(zhì)有一定關(guān)系，需要對(duì)病毒進(jìn)行更為深入的研究，才能有更好的解釋。

該研究通過河南省手足口病CoxB4分離株VP1基因分析，對(duì)不同疾病來源的病毒株繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析這些病毒該序列氨基酸差異，有助于完善我國CoxB4病毒株的基因信息，加強(qiáng)病毒變異檢測(cè)，為后續(xù)深入研究奠定基礎(chǔ)。

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