DNA甲基化在骨關(guān)節(jié)炎中的研究進(jìn)展

謝慶云，魏 萌

(解放軍成都軍區(qū)總醫(yī)院 a.骨科；b.腎臟(風(fēng)濕)科，四川 成都 610083)

·綜述·

DNA甲基化在骨關(guān)節(jié)炎中的研究進(jìn)展

謝慶云a，魏 萌b

(解放軍成都軍區(qū)總醫(yī)院 a.骨科；b.腎臟(風(fēng)濕)科，四川 成都 610083)

骨關(guān)節(jié)炎是一種最常見的肌肉骨骼系統(tǒng)疾病，但病因?qū)W尚不清楚。DNA甲基化狀態(tài)的改變可能參與了該病的病理生理學(xué)過程。現(xiàn)將對近期骨關(guān)節(jié)炎軟骨的靶向DNA甲基化分析，全基因組甲基化研究以及表觀遺傳治療在疾病中的應(yīng)用予以綜述。

骨關(guān)節(jié)炎；DNA甲基化；關(guān)節(jié)軟骨；病因?qū)W

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種慢性的肌肉骨骼系統(tǒng)疾病，可表現(xiàn)為不同程度的關(guān)節(jié)軟骨丟失、骨質(zhì)增生、軟骨下骨改變和滑膜炎等， 后期將出現(xiàn)疼痛、關(guān)節(jié)畸形及功能障礙。OA是全球性主要的致殘性疾病之一，70歲以上人群OA的發(fā)病率約為40%，估計全世界膝OA患者數(shù)量約為2.5億[1]。OA主要的危險因素包括應(yīng)力刺激、年齡、遺傳、炎癥、肥胖、損傷以及環(huán)境因素。到目前為止，OA的病因?qū)W尚不清楚，尤其是對發(fā)生影像學(xué)損害之前的早期分子生物學(xué)進(jìn)程知之甚少。近幾年，表觀遺傳學(xué)已經(jīng)成為OA嶄新且重要的研究領(lǐng)域。DNA甲基化作為一種重要的表觀遺傳修飾方式，在OA發(fā)病中的重要作用相繼被報道。本文將對DNA甲基化在骨關(guān)節(jié)炎中的研究進(jìn)展做一綜述。

1 表觀遺傳修飾

表觀遺傳修飾是指在沒有發(fā)生DNA序列變化的情況下，基因表達(dá)和(或)表型所發(fā)生的可遺傳的改變[2]。在機(jī)體發(fā)育和細(xì)胞分化的過程中，表觀遺傳修飾能對基因的表達(dá)產(chǎn)生整體、動態(tài)和穩(wěn)定的影響，使得細(xì)胞單位在有絲分裂過程中得以維持，細(xì)胞通過這種方式來調(diào)控基因的表達(dá)從而適應(yīng)環(huán)境的變化。因此，每種細(xì)胞或組織的表觀遺傳組都是其特有的，并且對飲食、鍛煉和吸煙等內(nèi)在或外在的環(huán)境因素產(chǎn)生時間和空間上的變化。

表觀遺傳修飾是通過調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄或者轉(zhuǎn)錄后環(huán)節(jié)來發(fā)揮作用，包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑和非編碼RNA(ncRNAs)。在哺乳動物中，DNA甲基化一般發(fā)生在胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸(CpG)，主要表現(xiàn)為胞嘧啶轉(zhuǎn)化為5-甲基胞嘧啶的現(xiàn)象。對于DNA甲基化功能的研究主要集中在基因的轉(zhuǎn)錄起始位點[3]。啟動子區(qū)域的甲基化可以抑制基因的表達(dá)，一方面CpG位點甲基化直接干擾轉(zhuǎn)錄因子與調(diào)控區(qū)DNA結(jié)合，另一方面甲基化的DNA與甲基化CpG結(jié)合區(qū)蛋白如MeCP2特異結(jié)合形成復(fù)合物，限制了轉(zhuǎn)錄因子達(dá)到它們結(jié)合部位的通道，從而抑制基因表達(dá)[4]。組蛋白修飾是指組蛋白在相關(guān)酶作用下發(fā)生甲基化、乙酰化、磷酸化、腺苷酸化、泛素化、ADP核糖基化等修飾的過程。基因的啟動子、增強子、轉(zhuǎn)錄區(qū)域和沉默區(qū)域都有其自身獨特的組蛋白標(biāo)記物，對轉(zhuǎn)錄組產(chǎn)生不同的影響[5]。ncRNA是一類能轉(zhuǎn)錄但不編碼蛋白質(zhì)且具有特定功能的RNA分子，指各種不翻譯成蛋白質(zhì)的RNA分子，包括微小RNA(miRNA)和長鏈非編碼RNA(lncRNA)等，通過影響轉(zhuǎn)錄、剪切或翻譯來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[6]。

2 OA軟骨的靶向DNA甲基化分析

目前OA的DNA甲基化研究主要聚焦于關(guān)節(jié)軟骨，因為關(guān)節(jié)軟骨是疾病進(jìn)程中受累的核心組織，易于在人工關(guān)節(jié)置換手術(shù)中獲取標(biāo)本。此外，關(guān)節(jié)軟骨是由軟骨細(xì)胞單一類型細(xì)胞所構(gòu)成，避免了多種細(xì)胞類型的組織會出現(xiàn)的遺傳異質(zhì)性。2005年Roach等[7]進(jìn)行的一項研究納入了晚期OA 16例和對照組10例，發(fā)現(xiàn)OA股骨頭關(guān)節(jié)軟骨的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)3、MMP9、MMP13以及ADAMTS4的表達(dá)增加，并且與這些基因啟動子區(qū)域特定CpG位點的去甲基化相關(guān)。這是最早提出DNA甲基化在OA的發(fā)病機(jī)制中具有潛在作用的一項研究。此后，多項靶向DNA甲基化研究選取了從功能學(xué)上可能參與OA發(fā)病的基因，分別檢測了軟骨組織、原代軟骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞系中靶基因啟動子的甲基化狀態(tài)和mRNA表達(dá)水平。研究發(fā)現(xiàn)，OA的關(guān)節(jié)軟骨或者分離出的軟骨細(xì)胞中瘦素(leptin)、GDF5、NOS2、PHLPP1、SOST和IL-8基因的啟動子或增強子特定部位的去甲基化與這些基因表達(dá)的增加相關(guān)[8-11]，而OA關(guān)節(jié)軟骨中SOX9、SOD2和COL9A1啟動子的甲基化水平增加會下調(diào)這些基因的表達(dá)[12]。

然而，這些研究結(jié)果還不足以證明軟骨細(xì)胞DNA甲基化的改變參與了OA的發(fā)病機(jī)制，還需要進(jìn)一步對這些關(guān)節(jié)軟骨樣本進(jìn)行縱向研究，以發(fā)現(xiàn)甲基化的改變與基因表達(dá)、疾病表型之間的因果關(guān)系。盡管如此，甲基化的體外研究以及軟骨細(xì)胞與去甲基化藥物共培養(yǎng)的結(jié)果表明，DNA甲基化能夠直接影響甲基化差異區(qū)域。此外，OA關(guān)節(jié)軟骨MMP13、GDF5、SOX9和COL9A1的啟動子區(qū)域，NOS2的增強子區(qū)域內(nèi)特定CpG位點的DNA甲基化狀態(tài)能夠改變轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，從而影響基因的轉(zhuǎn)錄[8-9，12-13]。

雖然這些研究提示了DNA甲基化異常在OA發(fā)病機(jī)制中的潛在作用，但這些靶向性分析具有一定的局限性。首先，并不是基因調(diào)節(jié)區(qū)域的每一個CpG位點都能夠進(jìn)行檢測，因此不能直接得出基因表達(dá)的差異與DNA甲基化的改變無關(guān)的結(jié)論。其次，這些研究關(guān)注的是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的與OA有關(guān)聯(lián)的基因，因此無法鑒定出可能在疾病過程中具有重要作用的新通路。正因為如此，近3年來全基因組DNA甲基化的研究迅速開展起來。

3 全基因組甲基化研究

到目前為止，已發(fā)表的OA甲基化組學(xué)的研究大多數(shù)都是使用Illumina人類甲基化27K和450K磁珠芯片[14-20]。27K芯片能檢測位于14 500個基因的27 000個CpG位點的甲基化水平，而450K芯片則覆蓋了99%的RefSeq基因的485 577個CpG位點。其他的OA甲基化組學(xué)研究的檢測方法包括：簡化代表性亞硫酸氫鹽測序法(RRBS)[21]，Agilent人類啟動子芯片244K陣列[22]，或5′-羥甲基胞嘧啶抗體免疫共沉淀后測序(5hmC Me-DIP-seq)[23]。目前，Illumina公司已研發(fā)出更高通量的MethylEPIC磁珠芯片(850K)，包含了853 397個CpG位點[24]，但目前尚未見該芯片用于OA甲基化組學(xué)研究的相關(guān)報道。

關(guān)節(jié)軟骨的甲基化組學(xué)的研究策略主要有4種：①比較非OA關(guān)節(jié)軟骨和OA關(guān)節(jié)中未損傷的軟骨[15-16]；②比較髖OA和膝OA關(guān)節(jié)中完好的未被侵蝕的軟骨[16-17]；③比較同一個關(guān)節(jié)中完整的軟骨和被侵蝕的軟骨[18-19，22，25]；④比較體外培養(yǎng)的OA患者和非OA病例的軟骨細(xì)胞[23]。除了關(guān)節(jié)軟骨/軟骨細(xì)胞的甲基化組學(xué)，還有研究比較了骨質(zhì)疏松患者和OA患者的股骨頭骨小梁[16]，以及相同關(guān)節(jié)中完整軟骨和被侵蝕軟骨所對應(yīng)的軟骨下骨[20]。盡管只檢測了人類基因組2 800萬個CpG位點中的很小一部分，但這些研究為闡明OA相關(guān)的甲基化改變的基因組區(qū)域、這些改變所涉及的基因和通路提供了重要的信息。

這些研究所鑒定出的差異化甲基化CpG位點(DMSs)或差異化甲基化區(qū)域(DMRs)，大多數(shù)不在基因的啟動子區(qū)域，而是集中位于基因體、基因間隔區(qū)或增強子區(qū)域。基因的增強子可能是調(diào)控另一個完全不同的基因的表達(dá)，而基因體的甲基化可能與mRNA的剪接和其他啟動子的轉(zhuǎn)錄相關(guān)[3-4]。這也許能解釋為什么髖OA和膝OA軟骨的DMRs中只有10%與所在基因的差異化表達(dá)相關(guān)[17]。因此，在對非啟動子區(qū)域含有DMSs/DMRs的基因進(jìn)行基因本體和通路分析時需要考慮到這些因素，闡明甲基化的變化對基因表達(dá)的作用是一項充滿挑戰(zhàn)的工作。

盡管各項研究存在技術(shù)和生物學(xué)上的差異，但根據(jù)目前已發(fā)表的全基因組甲基化研究可以得出幾個關(guān)鍵性的結(jié)論。①髖和膝關(guān)節(jié)軟骨的甲基化組學(xué)是不同的，且與疾病的狀態(tài)或關(guān)節(jié)損害的程度無關(guān)[16-17]，甚至患者的相同關(guān)節(jié)也具有不同的表觀遺傳組學(xué)[15-16，26]。這些結(jié)果對疾病的診斷、治療和組織工程研究具有重要意義。②OA與非OA關(guān)節(jié)軟骨相比較[15-16]或者相同關(guān)節(jié)中完整軟骨和受侵蝕的軟骨相比較[18]，DMSs均富集位于具有免疫學(xué)功能的基因上。此外，髖OA和膝OA患者亞組的炎癥基因的甲基化發(fā)生改變[15-16]，對髖OA進(jìn)行炎癥性聚類分析發(fā)現(xiàn)，這些變化與腫瘤壞死因子(TNF)、白細(xì)胞介素(IL)1A、IL6、MMP13、ADAMTS5和鋅轉(zhuǎn)運體基因的轉(zhuǎn)錄增加相關(guān)[26]。這些研究提示DNA甲基化在調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨的炎癥中具有重要的作用。轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)通路是OA重要的信號通路，該通路的組成部分及其下游靶基因富集了許多與OA疾病狀態(tài)[16]、疾病進(jìn)展[19]、軟骨侵蝕有關(guān)的DMSs，而軟骨下骨也會發(fā)生甲基化的改變[18，20]，OA的軟骨細(xì)胞呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài)[23]。③甲基化組學(xué)的研究為骨骼發(fā)育、肢體形態(tài)生成在OA易感性方面的作用提供了依據(jù)。編碼同源盒轉(zhuǎn)錄因子基因(包括在肢體發(fā)育中至關(guān)重要的Hox基因)的甲基化狀態(tài)在髖和膝關(guān)節(jié)軟骨之間[16-17]、晚期膝OA[19]和OA患者的股骨頭骨小梁[14]中均存在差異。④關(guān)節(jié)軟骨退變也會影響鄰近的軟骨下骨的甲基化組學(xué)，關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨中ERK/MAPK，PI3K和NFAT信號相關(guān)的基因也出現(xiàn)了與損害相關(guān)的甲基化改變[20]。

軟骨細(xì)胞的甲基化組學(xué)具有異質(zhì)性，受到關(guān)節(jié)來源、疾病狀態(tài)等因素的影響，因此要明確甲基化組學(xué)的差異如何通過分子生物學(xué)機(jī)制來改變軟骨細(xì)胞的表型，將是一項充滿挑戰(zhàn)性的工作。每一項甲基化組學(xué)研究都會鑒定出成百上千個DMSs/DMRs，因此很難確定選擇其中哪些位點或區(qū)域進(jìn)行后續(xù)的功能學(xué)研究。選取DMSs/DMRs的方法之一，是選擇在多項相似試驗設(shè)計的研究中均被證實的位點或區(qū)域。但是，要比較不同的甲基化檢測技術(shù)所鑒定出的DMSs/DMR非常困難，因為需要對芯片技術(shù)和RRBS、MeDIP-seq等測序方法檢測出來的CpG位點的甲基化數(shù)據(jù)進(jìn)行重疊，而這些數(shù)據(jù)并不是都能公開獲取。即使是同樣使用450K芯片的研究，由于探針的排除標(biāo)準(zhǔn)，P值的校正和閾值，判斷最小甲基化差異的顯著性水平都有所不同，這些研究所鑒定出的DMSs/DMRs也不能直接進(jìn)行比較。盡管存在這些問題，數(shù)據(jù)庫中使用相似試驗設(shè)計的450K芯片所鑒定出的DMSs也有明顯的重疊部分。例如，兩項獨立研究鑒定出的髖OA和膝OA關(guān)節(jié)軟骨DMSs中，有34.1%的差異性位點是重疊的，并且表現(xiàn)為相同趨勢和相似程度的甲基化差異[16-17]。同樣，髖OA完整軟骨和被侵蝕軟骨的DMSs中約有71%在髖和膝樣本數(shù)據(jù)聯(lián)合分析時仍然存在甲基化水平的差異[18，25]。盡管髖和膝關(guān)節(jié)軟骨具有不同的表觀遺傳學(xué)特征，但非OA和OA膝關(guān)節(jié)軟骨的DMSs中有超過1/3的差異性位點在非OA和OA髖關(guān)節(jié)軟骨中表現(xiàn)出相同趨勢的甲基化改變[16]。由于關(guān)節(jié)軟骨樣本來自于不同的地理位置，那么這些研究中重疊的部位在很大程度上是獨立于環(huán)境因素的。因此，不受關(guān)節(jié)部位、OA亞型或者生活方式的影響，始終表現(xiàn)為相同甲基化改變的DMSs，是今后靶向研究的良好候選位點。

4 表觀遺傳治療在OA疾病中的應(yīng)用

表觀遺傳修飾是不改變基因序列的修飾，相對基因治療更加安全。目前已有很多關(guān)于表觀遺傳修飾治療疾病的報道，主要是用于腫瘤及血液疾病的治療。目前最主要的修飾DNA甲基化的藥物是5-雜氮胞苷(5-AzaC)和5-雜氮-2′-脫氧胞苷(5-Aza-dC)，先后于2004年和2006年被美國食品藥品監(jiān)督局(FDA)批準(zhǔn)用于血液系統(tǒng)腫瘤的治療。這兩種藥物均為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)抑制劑，通過與DNMT共價結(jié)合，降低DNMT的生物活性，使抑癌基因去甲基化而被重新表達(dá)，因而已被成功用于血液系統(tǒng)疾病的治療[27]。在DNA甲基化修飾藥物的研究過程中，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)治療心血管疾病的藥物具有一定的去甲基化作用，例如抗高血壓藥物肼屈嗪、抗心律失常藥物普魯卡因胺等[28-29]，此外研究發(fā)現(xiàn)中藥單體姜黃素具有抑制DNMT的作用[30]。但這些藥物去甲基化作用較弱，且作用機(jī)制不清，存在較多爭議，限制了其在臨床的應(yīng)用。

目前已有部分學(xué)者嘗試將5′-雜氮-2′-脫氧胞嘧啶(5-Aza-dC)用于OA軟骨細(xì)胞的體外干預(yù)。Iliopoulos等[9]發(fā)現(xiàn)，5-Aza-dC能夠使軟骨細(xì)胞leptin啟動子甲基化水平降低、mRNA表達(dá)增加，繼而激活MMP-13。Kim等[31]報道OA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞與10 μmol/L 5-Aza-dC共培養(yǎng)8天后，軟骨細(xì)胞 SOX-9啟動子區(qū)域的6個CpG島甲基化水平降低，定量PCR提示SOX-9 mRNA表達(dá)增加，蛋白印跡(Western-blot)檢測SOX-9蛋白表達(dá)增加。此外，5-Aza-dC與股骨頸骨折患者的軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)5周后，COL9A1mRNA表達(dá)明顯升高，啟動子區(qū)域的CpG位點甲基化程度變化趨勢不一。而與OA軟骨細(xì)胞體外共培養(yǎng)的過程中，5-Aza-dC能降低COL9A1的DNA甲基化水平，增加COL9A1的表達(dá)[12]。但是，這兩種藥物對于DNMT沒有選擇性，特異性低，化學(xué)穩(wěn)定性差，同時還具有腎毒性、骨髓毒性等副作用。因此，進(jìn)一步研發(fā)高特異性、高選擇性、低毒性的DNA甲基化修飾藥物，靶向調(diào)節(jié)特定基因的DNA甲基化水平，啟動或抑制特定基因的表達(dá)，從而達(dá)到疾病的緩解，將是今后藥物開發(fā)的熱點。

5 今后OA DNA甲基化的研究方向

近幾年來OA關(guān)節(jié)軟骨的DNA甲基化研究尤其是甲基化芯片技術(shù)的應(yīng)用，使我們對表觀遺傳學(xué)在OA中的作用有了更加深刻的理解。今后該領(lǐng)域的研究可以從以下幾個方面進(jìn)行更加深入的探索。

第一，由于甲基化組學(xué)研究及其鑒定出的DMSs/DMRs的數(shù)量不斷增多，建立能夠整合研究結(jié)果的數(shù)據(jù)庫顯得尤為必要。鑒于大多數(shù)甲基化組學(xué)研究都使用Illumina芯片技術(shù)，應(yīng)當(dāng)對探針排除標(biāo)準(zhǔn)、基因注釋、多重檢驗校正方法、界定DMSs的P值和甲基化差異的閾值等達(dá)成共識。這將有利于研究間的直接比較，一項研究的數(shù)據(jù)可以用于另一項獨立樣本研究的驗證分析。此外，更高通量的MethylEPIC磁珠芯片(850K)的誕生和應(yīng)用[24]，將為OA的DNA甲基化研究提供更多的信息和數(shù)據(jù)。

第二，整合遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和甲基化組學(xué)的研究數(shù)據(jù)。甲基化狀態(tài)和基因表達(dá)之間應(yīng)當(dāng)是相關(guān)的，但是某些相關(guān)性的缺失可能是由于過去認(rèn)為對細(xì)胞沒有調(diào)控作用的因素造成的。這將有助于我們對基因表達(dá)臨時調(diào)控的認(rèn)識。同樣，DNA基因型與不同的甲基化是否有關(guān)也需要進(jìn)行評估。如果在OA遺傳學(xué)危險因素有關(guān)的DNA多態(tài)性位點上，等位基因的類型能影響到鄰近區(qū)域CpG位點的甲基化狀態(tài)，這將有助于解釋基因多態(tài)性如何影響OA的易感性。

第三，DNA甲基化研究應(yīng)該擴(kuò)展到關(guān)節(jié)其他組織。滑膜、軟骨下骨等其他受累部位也可能會提供有用的信息。此外，DNA甲基化的研究還應(yīng)該擴(kuò)展到比軟骨更易獲取的組織。人類組學(xué)研究的目標(biāo)之一，就是能夠在更易獲取的組織中例如血液、唾液，檢測到在病變組織中所觀察到的異常改變，從而鑒別出尚未發(fā)病的易感人群。

第四，進(jìn)一步研發(fā)具有特異性靶向作用的表觀遺傳修飾藥物。目前已有的DNA甲基化傳修飾藥物，其去甲基化作用缺乏特異性，不能靶向作用于某個特定基因并改變其DNA甲基化狀態(tài)，穩(wěn)定性較差，毒副作用明顯，嚴(yán)重限制了其在疾病治療中的應(yīng)用。因此，研發(fā)高效力、高選擇性的新一代DNA甲基化修飾藥物，靶向調(diào)節(jié)特定基因的表達(dá)，從而達(dá)到疾病的緩解，是今后藥物開發(fā)的方向之一。

今后，研究者們將通過遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和甲基化組學(xué)對參與OA發(fā)病的基因和區(qū)域進(jìn)行更加詳細(xì)的功能學(xué)特征的闡明?？傊?，這些研究將有可能鑒定出OA新的病因?qū)W通路、疾病表型，發(fā)現(xiàn)新的診斷和預(yù)后的生物標(biāo)記物，以及新的治療靶點。

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四川省科技廳重點研發(fā)項目(2017SZ0128);四川省衛(wèi)生廳基金項目(130322)

魏萌，Email: weimengwm@sina.com

R684.3

A

1004-583X(2017)09-0824-05

10.3969/j.issn.1004-583X.2017.09.023

2017-05-22 編輯:武峪峰