人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞神經(jīng)向分化與去分化基因表達(dá)譜分析

焦揚(yáng)趙洪波劉平付旭鋒陳國(guó)棟羅曉曦桑雄波鄭冰蓉

·論著·

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞神經(jīng)向分化與去分化基因表達(dá)譜分析

焦揚(yáng)1,2趙洪波2劉平1付旭鋒1陳國(guó)棟1羅曉曦1桑雄波1鄭冰蓉1

目的 用生物信息學(xué)方法從公共基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)(GEO)中初步篩選出與人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（hUC-MSCs）神經(jīng)向分化和去分化相關(guān)的生物學(xué)功能和對(duì)應(yīng)的信號(hào)通路，分析蛋白互作關(guān)系，為進(jìn)一步開(kāi)展hUC-MSCs神經(jīng)向分化和去分化的實(shí)驗(yàn)研究提供指導(dǎo)信息。方法 在公共基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)GEO中搜尋hUC-MSCs神經(jīng)向分化與去分化的基因芯片數(shù)據(jù)，用R和Bioconductor軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，篩選差異基因；用GeneAnalytics在線分析工具進(jìn)行GO分析和通路分析；用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行差異表達(dá)基因?qū)?yīng)的蛋白互作關(guān)系分析。結(jié)果 共篩選得到影響神經(jīng)向分化和去分化過(guò)程的670個(gè)上調(diào)基因和1 458個(gè)下調(diào)基因；進(jìn)一步對(duì)這些差異基因進(jìn)行功能富集分析，發(fā)現(xiàn)上調(diào)過(guò)程的功能集中表現(xiàn)為促血管生成和細(xì)胞黏附，下調(diào)的生物學(xué)過(guò)程則主要和代謝相關(guān)；上調(diào)通路主要有與細(xì)胞增殖、分化、凋亡有關(guān)的ERK、血管生成和Akt等通路，下調(diào)通路主要有與細(xì)胞代謝和生物合成相關(guān)的萜類(lèi)化合物骨架生物合成、Cholesterot Biosynthesis II和磷酸肌醇代謝等通路，其中特別的是，維持胚胎干細(xì)胞多能性的Nanog通路出現(xiàn)在下調(diào)通路中；蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，與血管生成、細(xì)胞黏附相關(guān)的蛋白VEGFA、IL-6、FGF2、MMP和IL-8有較高的degree值。結(jié)論 影響hUC-MSCs神經(jīng)向分化和去分化的因素很多，其中，促進(jìn)血管生成、細(xì)胞黏附及細(xì)胞繁殖相關(guān)的基因、生物反應(yīng)過(guò)程、信號(hào)通路及相關(guān)蛋白起著重要作用。上述基于生物信息學(xué)的篩查分析結(jié)果為進(jìn)一步開(kāi)展hUC-MSCs神經(jīng)向分化與去分化實(shí)驗(yàn)研究提供了一定的參考信息。

計(jì)算生物學(xué)； 臍帶； 間質(zhì)干細(xì)胞； 細(xì)胞分化； 細(xì)胞去分化； 基因表達(dá)譜

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenchymal stromal cells，hUC-MSCs）取材容易，增殖力強(qiáng)[1]，免疫原性低[2]，優(yōu)于其他來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞，且不涉及倫理問(wèn)題，是干細(xì)胞臨床治療理想的種子細(xì)胞，特別對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)疾病。在體外，hUC-MSCs已經(jīng)被成功地向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化，并且發(fā)現(xiàn)，當(dāng)hUC-MSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化的同時(shí)，還會(huì)分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子[3-4]?，F(xiàn)今，已有將hUCMSCs用于帕金森病[5-6]、缺血性腦損傷[7]、脊髓損傷[8]等神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療的相關(guān)報(bào)道。但是，移植后的間充質(zhì)干細(xì)胞存活率較低，限制了其在臨床中的應(yīng)用。

去分化指分化細(xì)胞失去特有的結(jié)構(gòu)和功能，變?yōu)榫哂形捶只?xì)胞特性的細(xì)胞的過(guò)程。去分化的細(xì)胞具有原始干細(xì)胞特性，且再分化的速度和效率都有提高[9]。張慧等[10]在對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化研究中證實(shí)，去分化的間充質(zhì)干細(xì)胞具備間充質(zhì)干細(xì)胞的特征，并且體外再次生骨效率明顯提高。因此，如果直接用去分化的細(xì)胞做移植治療，很可能可以提高治療效果。

為了系統(tǒng)地了解hUC-MSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化后去分化的分子機(jī)制，筆者希望從生物信息學(xué)角度，利用公共基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)（GEO）中的芯片數(shù)據(jù)，挖掘體外培養(yǎng)的hUC-MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化后去分化的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，通過(guò)GO分析、KEGG信號(hào)通路分析和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，獲得影響hUC-MSCs神經(jīng)向去分化的相關(guān)基因、生物學(xué)過(guò)程、信號(hào)通路和重要蛋白等信息，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究hUC-MSCs神經(jīng)向去分化的機(jī)制提供前期基礎(chǔ)和理論支持。

材料與方法

一、基因表達(dá)數(shù)據(jù)的獲得

本研究選用的是GSE65631芯片數(shù)據(jù)。GSE65631是由Zhou等[11]人提交的hUC-MSCs未分化及其向神經(jīng)樣細(xì)胞分化、去分化和再分化的數(shù)據(jù)集。GSE65631芯片數(shù)據(jù)獲得的過(guò)程如下：從重慶干細(xì)胞庫(kù)購(gòu)買(mǎi)hUC-MSCs，用DMEM/F12完全培養(yǎng)基+10﹪胎牛血清（FBS）培養(yǎng)到第5代，用1 μm/L的全反式維甲酸（ATRA）預(yù)處理24 h，然后用改良神經(jīng)元誘導(dǎo)液（modi fi ed neuronal induction media，MNM）誘導(dǎo)分化成神經(jīng)樣細(xì)胞；將MNM換回DMEM/F12完全培養(yǎng)基+10﹪胎牛血清（FBS）培養(yǎng)24 h，使分化了的 hUC-MSCs去分化；最后，再用MNM誘導(dǎo)去分化的細(xì)胞再分化。抽取不同階段（未分化、分化、去分化、再分化）hUC-MSCs的總RNA，生物素標(biāo)記之后用基因芯片檢測(cè)體外培養(yǎng)的hUC-MSCs未分化、神經(jīng)向分化-去分化-再分化過(guò)程的基因表達(dá)情況。采用的分析平臺(tái)是Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array。

本研究從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中下載GSE65631芯片數(shù)據(jù)集[11]。因本研究主要是為了解 hUC-MSCs神經(jīng)向分化后細(xì)胞去分化的情況，因此僅選取了分化和去分化的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

二、數(shù)據(jù)預(yù)處理及差異表達(dá)基因篩選

用R軟件（3.2.3）和Bioconductor（3.2）項(xiàng)目對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析：將所得數(shù)據(jù)先用RMA（Robust Multichip Averaging）計(jì)算，進(jìn)而用affy軟件包背景校正、標(biāo)準(zhǔn)化、log2轉(zhuǎn)化，最后用limma包篩選差異表達(dá)基因[12]。設(shè)置FDR < 0.05，|log（FC）| > 1為標(biāo)準(zhǔn)。

三、功能注釋和通路分析

將得到的差異表達(dá)顯著的上調(diào)和下調(diào)基因，分別提交到GeneAnalytics在線分析工具進(jìn)行GO分析和通路分析[13]。

四、蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)分析差異表達(dá)基因存在的蛋白互作關(guān)系[14]。STRING數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)通過(guò)收集蛋白質(zhì)互作關(guān)系、基因調(diào)控關(guān)系以及文獻(xiàn)挖掘分析和蛋白質(zhì)共表達(dá)分析等計(jì)算得到物理互作和預(yù)測(cè)互作關(guān)系的數(shù)據(jù)庫(kù)。且可通過(guò)計(jì)算給不同基因（蛋白質(zhì)）之間的互作關(guān)系打分，并建立蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，再根據(jù)每個(gè)節(jié)點(diǎn)degree的大小選擇關(guān)鍵蛋白。

結(jié) 果

一、差異表達(dá)基因分析

通過(guò)limma方法，將hUC-MSCs去分化和分化進(jìn)行比較，篩選得到影響去分化過(guò)程的1 046個(gè)上調(diào)探針和2 385個(gè)下調(diào)探針，它們分別對(duì)應(yīng)670個(gè)上調(diào)基因（P < 0.05）和1 458個(gè)下調(diào)基因（P < 0.05）。

二、生物學(xué)過(guò)程分析

用GeneAnalytics分析與hUC-MSCs神經(jīng)向去分化過(guò)程相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程。發(fā)現(xiàn)在上調(diào)過(guò)程中，血管生成、細(xì)胞黏附等起主要作用，下調(diào)的生物學(xué)過(guò)程主要是和代謝相關(guān)。前5個(gè)上調(diào)生物學(xué)過(guò)程和前5個(gè)下調(diào)生物學(xué)過(guò)程見(jiàn)表1。

三、通路分析

經(jīng)GeneAnalytics分析，與hUC-MSCs神經(jīng)向去分化過(guò)程相關(guān)的上調(diào)通路主要有細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）、血管生成和Akt等信號(hào)通路；下調(diào)通路主要是與細(xì)胞代謝和生物合成相關(guān)的萜類(lèi)化合物骨架生物合成、Cholesterot Biosynthesis Ⅱ和磷酸肌醇代謝等通路。維持胚胎干細(xì)胞多能性的Nanog基因出現(xiàn)在下調(diào)通路中。排名前五的上調(diào)通路和下調(diào)通路見(jiàn)表2。

表1 與hUC-MSCs去分化密切相關(guān)的生物過(guò)程

表2 與hUC-MSCs去分化密切相關(guān)的通路

表3 排名前10的與hUC-MSCs去分化相關(guān)的上調(diào)和下調(diào)蛋白

四、蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)建立蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，上調(diào)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖1，下調(diào)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖2。根據(jù)degree進(jìn)行排序，排名前10的蛋白見(jiàn)表3。其中，VEGFA，IL-6，F(xiàn)GF2，MMP和IL-8蛋白與血管生成和細(xì)胞黏附有關(guān)。STAT3與Nanog基因共同作用維持胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ES）的自我更新能力。

圖1 上調(diào)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

討 論

細(xì)胞去分化過(guò)程是活體生物在發(fā)生炎性反應(yīng)、遭受創(chuàng)傷以后發(fā)生的一種自我更新、修復(fù)的過(guò)程。隨著細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展及干細(xì)胞臨床治療研究的深入，人們對(duì)干細(xì)胞去分化的關(guān)注日趨增多。去分化的間充質(zhì)干細(xì)胞保留了干細(xì)胞的特性，與原始干細(xì)胞相比，在體外存活時(shí)間更長(zhǎng)，分化潛能更高[9]。hUC-MSCs由于具有取材容易、增殖力強(qiáng)、免疫原性低、不涉及倫理問(wèn)題等特點(diǎn)，優(yōu)于其他來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞，成為臨床治療理想的種子細(xì)胞。而去分化的細(xì)胞除具有原始干細(xì)胞特性外，其再分化的速度和效率都較原始干細(xì)胞有提高。因此如果將去分化的hUC-MSCs用于臨床治療，則可望有更好的效果。但是hUC-MSCs去分化的機(jī)制目前還遠(yuǎn)不清楚。因此，嘗試用生物信息學(xué)方法、從hUC-MSCs神經(jīng)向去分化切入，分析hUC-MSCs神經(jīng)向分化和去分化基因的表達(dá)差異及其相關(guān)的生物學(xué)功能、對(duì)應(yīng)的生物信號(hào)通路及蛋白互作關(guān)系，以初步探討hUC-MSCs神經(jīng)向去分化的機(jī)制。

圖2 下調(diào)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

本研究通過(guò)對(duì)用公共基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)GEO搜尋，并用R和Bioconductor軟件分析篩選出來(lái)的差異表達(dá)的上調(diào)基因P53、ITGA2、VEGFA等和下調(diào)基因ACACA、JUN和PTEN等進(jìn)行功能富集分析發(fā)現(xiàn)：血管生成、細(xì)胞黏附在去分化過(guò)程中起重要作用。眾多的研究證實(shí)：血管生成是腫瘤在生長(zhǎng)、遷移過(guò)程中的一種基本活動(dòng)，能為腫瘤提供氧氣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)因子等，并能控制止血因子，為腫瘤細(xì)胞的散布提供適合的微環(huán)境[15]。在hUC-MSCs的去分化過(guò)程中，也伴隨著與腫瘤細(xì)胞類(lèi)似的細(xì)胞自我增殖能力、遷移力的恢復(fù)。因此，血管生成、細(xì)胞黏附等生物學(xué)過(guò)程也為hUC-MSCs的去分化提供了適合的促進(jìn)性微環(huán)境。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析得到與血管生成、細(xì)胞黏附相關(guān)的蛋白VEGFA，IL-6，F(xiàn)GF2，MMP和IL-8均有較高的degree值。因此，這些蛋白可以作為研究血管生成、細(xì)胞黏附影響hUC-MSCs去分化過(guò)程的作用機(jī)制的重要蛋白。

ERK信號(hào)通路已被證實(shí)與細(xì)胞去分化密切相關(guān)。對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在Schwann細(xì)胞去分化過(guò)程中ERK信號(hào)通路起著核心調(diào)控作用[16]。本研究的基因芯片數(shù)據(jù)分析結(jié)果同樣顯示，在去分化的hUC-MSCs中，ERK信號(hào)通路上調(diào)，并且在所有上調(diào)通路中Score值最高，進(jìn)一步證實(shí)了ERK信號(hào)通路在細(xì)胞去分化過(guò)程中的重要性。P13K/AKT信號(hào)通路與細(xì)胞增殖和存活相關(guān)。此通路的活性被類(lèi)脂磷酸酶PTEN負(fù)調(diào)控[17]。并且P13K能夠通過(guò)激活PAK進(jìn)而激活ERK信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞去分化。另外，Rac/PAK信號(hào)通路還能不依賴(lài)ERK和P13K/AKT信號(hào)通路，影響細(xì)胞黏附、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞周期進(jìn)程及細(xì)胞轉(zhuǎn)化[18-19]。本研究的基因芯片數(shù)據(jù)分析結(jié)果與之對(duì)應(yīng)良好：在去分化的hUCMSCs中，P13K/AKT和Rac/PAK信號(hào)通路均上調(diào)，而P13K/AKT信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控蛋白PTEN表達(dá)量下調(diào)。說(shuō)明P13K/AKT和Rac/PAK信號(hào)通路在hUC-MSCs去分化過(guò)程中同樣起著重要作用。

TP53、ACACA、JUN蛋白在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析中有較大的degree值（均大于100），說(shuō)明它們?cè)趆UC-MSCs去分化過(guò)程中的作用比較大，事實(shí)上，這些蛋白是與細(xì)胞周期、血管生成密切相關(guān)的。因此，在今后的研究工作中這些蛋白可以重點(diǎn)關(guān)注。

本次研究一個(gè)值得特別注意的結(jié)果是：在hUC-MSCs去分化過(guò)程中，Nanog基因下調(diào)，同時(shí)，STAT3蛋白也下調(diào)。在關(guān)于胚胎干細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)：Nanog與LIF/STAT3共同作用可以維持胚胎干細(xì)胞的自我更新能力[20]；Nanog在具有高度增殖能力和多相分化潛能的組織和細(xì)胞中高表達(dá)[21]；在Nanog缺乏的細(xì)胞團(tuán)中，細(xì)胞開(kāi)始分化；在已分化的胚胎干細(xì)胞中Nanog消失[21]。去分化是已分化的細(xì)胞回到具有未分化細(xì)胞狀態(tài)的過(guò)程。而在hUCMSCs去分化過(guò)程中，Nanog基因的表達(dá)并未增加，STAT3蛋白量也在減少，說(shuō)明去分化的過(guò)程并未使hUC-MSCs完全恢復(fù)到最初的具有干細(xì)胞完全干性的狀態(tài)，而保留了一些分化過(guò)的狀態(tài)。這可能是去分化細(xì)胞再分化的速度和效率都更高的原因。

通過(guò)對(duì)hUC-MSCs神經(jīng)向分化和去分化差異表達(dá)基因分析，本研究得到了與hUC-MSCs神經(jīng)向去分化相關(guān)的重要生物過(guò)程、信號(hào)通路和重要蛋白。其中，ERK信號(hào)通路、P13K/AKT和Rac/PAK信號(hào)通路已經(jīng)證實(shí)與細(xì)胞去分化相關(guān)，血管生成、細(xì)胞黏附在細(xì)胞去分化過(guò)程中的作用研究還較少，而TP53、ACACA、JUN蛋白在細(xì)胞去分化過(guò)程中的作用尚無(wú)報(bào)道。因此，關(guān)于hUC-MSCs神經(jīng)向去分化的機(jī)制還有很多未知的內(nèi)容值得關(guān)注。本研究為進(jìn)一步探討hUC-MSCs去分化機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究提供了一些可供參考的線索和信息。

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Gene expression profile analysis of neural differentiation and dedifferentiation process in human umbilical cord mesenchymal stem cells

iao Yang1,2, Zhao Hongbo2, Liu Ping1, Fu Xufeng1,Chen Guodong1, Luo Xiaoxi1, Sang Xiongbo1, Zheng Bingrong1.1the Medical School of Y unnan University, Kunming 650091,China;2Stem Cell and Regenrative Laboratory of Y unnan Province of the Kunming Medical University, Kunming 650500,China

Zheng Bingrong, Email: zhengbr@ynu.edu.cn

ObjectiveTo provide information for further experimental study, we analysed the biological function and signal pathways related to neural differentiation and dedifferentiation of human umbilical cord mesenchymal stromal cells（hUC-MSCs）and investigated the protein-protein interaction based on the chip data in public gene chip database GEO using bioinformatics methods.MethodsMicroarray data of neural differentiation and dedifferentiation in hUC-MSCs from public GEO gene chip databases were analyzed by R and Bioconductor package to screen out the differential expressed genes. Signal pathway was analyzed by online analysis tool GeneAnalytics and protein interactions of differential expressed gene were analyzed with STRING database.ResultsA total of 670 up-regulated and 1458 down-regulated genes in differentiation and dedifferentiation process were identified. Up-regulated genes are mainly involved in angiogenesis and cell adhesion, and down-regulated genes are mainly related to metabolism. Up-regulated pathways includes ERK pathway, angiogenesis pathway and Akt pathways, which are involved in cell proliferation, differentiation and apoptosis,while down-regulated pathways are related to metabolism and biosynthesis including terpenoids skeleton biosynthesis pathway, Cholesterot Biosynthesis II and Phosphoinositide metabolism pathway. It is noted that Nanog pathway which maintain the pluripotence of embryonic stem cells is also down regulated. Protein interaction network analysis found that VEGFA, IL-6, FGF2, MMP and IL-8, which are involved in angiogenesis and cell adhesion,have the higher degree value.ConclusionMany factors can influence neural differentiation and dedifferentiation in hUCMSCs, and proteins that can promote angiogenesis, cell adhesion and cell proliferation play more important role. In our future experiments, we will focus on the role of angiogenesis, cell adhesion and cell proliferation in the neural differentiation and dedifferentiation of human umbilical cord mesenchymal stromal cells.

Computational biology; Umbilical cord; Mesenchymal stem cells; Cell differentiation; Cell dedifferentiation; Gene expression profile

2016-08-02）

（本文編輯：李少婷）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2017.01.006

國(guó)家自然科學(xué)基金（81560043）

650091 昆明，云南大學(xué)醫(yī)學(xué)院1；650500 昆明醫(yī)科大學(xué) 云南省干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2

鄭冰蓉，Email：zhengbr@ynu.edu.cn

焦揚(yáng)，趙洪波，劉平，等. 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞神經(jīng)向分化與去分化基因表達(dá)譜分析[J/CD].中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志（電子版）, 2017, 7(1):29-34.