槲皮素對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植聯(lián)合腎移植所誘導(dǎo)的免疫耐受的影響

楊軍 陳花 石韶華 馬永文 王振興 武小桐

·論著·

槲皮素對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植聯(lián)合腎移植所誘導(dǎo)的免疫耐受的影響

楊軍 陳花 石韶華 馬永文 王振興 武小桐

目的 探討槲皮素對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）誘導(dǎo)腎移植免疫耐受的影響。方法 在對(duì)腎移植后的大鼠給予BMSCs治療的基礎(chǔ)上，同時(shí)給予不同劑量的槲皮素，觀(guān)察其誘導(dǎo)免疫耐受的效果。建立大鼠腎移植模型，隨機(jī)分為4 組：對(duì)照組、BMSC組、MSC+高/低劑量槲皮素干預(yù)組。Western blot檢測(cè)各組腎組織中Janus激活激酶（JAK）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3（STAT3）、p-STAT3的蛋白表達(dá)水平，ELISA檢測(cè)血清中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）水平。收集BMSC組腎小管上皮細(xì)胞，干擾及過(guò)表達(dá)STAT3的同時(shí)予以槲皮素干預(yù)，使用Western blot檢測(cè)JAK、STAT3、p-STAT3及TGF-β1表達(dá)。采用單因素方差分析比較各組間數(shù)據(jù)差異，組間數(shù)據(jù)兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。結(jié)果 大鼠經(jīng)腎移植后，對(duì)照組血清中TGF-β1蛋白表達(dá)（19 162±223）pg/ml高于其他組，BMSC組（12 106±163）pg/ml、MSC+高槲皮素干預(yù)組（9 113±110）pg/ml、MSC+低槲皮素干預(yù)組（9 024±133）pg/ml。3組分別與對(duì)照組比較P均< 0.01。對(duì)照組腎組織中JAK、p-STAT3的蛋白相對(duì)表達(dá)量（1.5±0.2，10.7±0.5）均高于其他各組[MSC組（0.9±0.3，8.5±0.2；P均< 0.01）、MSC+高槲皮素干預(yù)組（0.7±0.2，6.1±0.3；P均< 0.01）、MSC+低槲皮素干預(yù)組（0.7±0.3，5.8±0.1；P均< 0.01）]。干擾STAT3后腎小管上皮細(xì)胞中p-STAT3和TGF-β1蛋白相對(duì)表達(dá)量（0.7±0.1，0.3±0.1）均少于其他各組[對(duì)照組（8.2±0.4，7.1±0.5；P均< 0.01）、槲皮素干預(yù)組（5.6±0.3，4.8±0.4；P均< 0.01）、空白對(duì)照組（5.7±0.3，4.5±0.4；P均< 0.01）]。過(guò)表達(dá)STAT3后中p-STAT3和TGF-β1蛋白相對(duì)表達(dá)量（10.5±0.6，8.4±0.5）高于槲皮素干預(yù)組[（5.7±0.3，5.4±0.3）；P均< 0.01]和空白對(duì)照組[（6.1±0.1，5.6±0.4）；P均< 0.01]。結(jié)論 大鼠腎移植時(shí)在給予BMSCs注射的同時(shí)給予槲皮素干預(yù)，可有效地抑制免疫排斥反應(yīng)，改善腎功能；JAK/STAT3/TGF-β1可能參與了槲皮素誘導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)。

槲皮素； 骨髓； 間充質(zhì)干細(xì)胞； 腎移植； 免疫耐受

器官移植后需要機(jī)體長(zhǎng)期呈現(xiàn)免疫抑制狀態(tài)，以保證移植器官的存活。免疫抑制劑可抑制機(jī)體對(duì)移植器官的免疫反應(yīng)，因此廣泛應(yīng)用于臨床。然而，傳統(tǒng)的免疫抑制劑可導(dǎo)致機(jī)體非特異性免疫抑制，長(zhǎng)期使用可引起感染、腫瘤等并發(fā)癥，嚴(yán)重時(shí)危及生命[1]。目前臨床中普遍使用的免疫抑制方案并不能解決慢性排斥反應(yīng)導(dǎo)致的移植物功能進(jìn)行性喪失。除此之外，長(zhǎng)期使用免疫抑制劑時(shí)患者常由于藥物毒性耐受性較差，影響了患者的依存性。由此可見(jiàn)，為了進(jìn)一步提高器官移植的治療效果，需要不斷尋求新的治療方案，以避免長(zhǎng)期應(yīng)用免疫抑制所引起的副反應(yīng)、器官移植后的急性排斥反應(yīng)和慢性移植物失功。因此，如何誘導(dǎo)移植后的免疫耐受，以期進(jìn)一步提高器官移植的治療效果，正逐漸得到廣泛關(guān)注。

免疫排斥反應(yīng)主要由T細(xì)胞介導(dǎo)，成年受體中含有大量的成熟T細(xì)胞，若要成功形成混合嵌合體，達(dá)到免疫耐受的目的，則必須首先清除受體中成熟的T細(xì)胞[2]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）是骨髓中的非造血細(xì)胞集落，具有低免疫原性、免疫抑制的特性[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，人腎移植供者來(lái)源的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在體外能顯著抑制受體—供體的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，顯著抑制腎移植受體移植前和移植后T細(xì)胞的增殖。已有研究表明，聯(lián)合腎—骨髓聯(lián)合移植可誘導(dǎo)大鼠免疫耐受：在大鼠腎移植時(shí)連續(xù)給予1× 107個(gè)細(xì)胞濃度的BMSCs可誘導(dǎo)受體免疫耐受[1]。近10年來(lái)，非清髓性干細(xì)胞移植已在臨床中廣泛應(yīng)用，該方法能夠通過(guò)建立混合嵌合體，使受體產(chǎn)生特異性免疫耐受的同時(shí)，保留自身免疫功能[2]。

槲皮素（quercetin，Que）是一類(lèi)廣泛分布于被子植物花葉部分的黃酮類(lèi)化合物，研究發(fā)現(xiàn)槲皮素具有包括免疫調(diào)節(jié)在內(nèi)的多方面作用。活化T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的IL-2的免疫放大效應(yīng)是急性免疫排斥反應(yīng)發(fā)生的重要機(jī)制，槲皮素能夠抑制T細(xì)胞的增殖，從而減少I(mǎi)L-2產(chǎn)生[5]。TGF-β1是重要的免疫調(diào)節(jié)因子，參與多個(gè)生物過(guò)程，其過(guò)度表達(dá)可在多種腎病下引起不可逆的腎間質(zhì)纖維化[6-9]。移植腎后腎功能進(jìn)行性喪失的患者，TGF-β1表達(dá)明顯升高[6]。JAK是STAT的上游共有激酶，STAT3是一條重要的跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，STAT3異?；罨梢鸲喾N下游基因的異常表達(dá)，引起腎臟病變[7]。JAK-STAT信號(hào)通路可轉(zhuǎn)導(dǎo)多種其他細(xì)胞因子、甚至非免疫介質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，涉及免疫、細(xì)胞凋亡、炎癥等多種病理生理過(guò)程[7]。已有研究表明，槲皮素能夠明顯降低血液中STAT3及TGF-β1蛋白表達(dá)水平，改善缺血腎、肝、腦等多器官的功能，但目前對(duì)槲皮素影響B(tài)MSCs誘導(dǎo)腎移植免疫耐受的作用尚未有研究[10-11]。基于槲皮素藥理作用廣泛，本研究以腎移植大鼠作為研究對(duì)象，研究槲皮素通過(guò)調(diào)節(jié)JAK/STAT3及TGF-β1信號(hào)通路對(duì)BMSCs誘導(dǎo)腎移植免疫耐受的影響，深入研究槲皮素調(diào)節(jié)腎移植免疫功能的作用機(jī)制。

材料與方法

一、材料

SD大鼠20只，9～11周齡，體質(zhì)量240～280 g，作為供體；另取成年雄性Wistar大鼠20只，9～11周齡，體質(zhì)量250～300 g，作為受體。另外5只5周齡雄性SD大鼠用作提取BMSCs。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。主要試劑包括低糖DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone公司），胎牛血清（美國(guó)Gibco公司），lipofectamine 2000（lipo2000，美國(guó)Invitrogen公司），STAT3的干擾RNA（si-STAT3，廣州銳博公司），STAT3的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（吉?jiǎng)P基因公司）。

二、方法

1.分組：將20只大鼠隨機(jī)分為 4 組，每組5只。對(duì)照組，僅進(jìn)行單純腎移植，未給予藥物治療；BMSC組：關(guān)腹前左骼靜脈注射1×107/kg BMSCs，第2天起尾靜脈注射等量細(xì)胞，治療共持續(xù)10 d；MSC+高/低槲皮素干預(yù)組：除給予BMSCs外，以100或50 mg/kg槲皮素溶液灌胃，共10 d。

2.大鼠BMSCs的分離與培養(yǎng)：將SD大鼠頸椎脫臼處死后無(wú)菌條件下取脛骨和股骨，保持骨髓腔無(wú)菌封閉狀態(tài)置于體積分?jǐn)?shù)75﹪乙醇浸泡3 min，洗去多余的組織，用注射器抽取4 ml DMEM培養(yǎng)液，穿刺入骨髓腔，反復(fù)沖洗骨髓3～5次，收集至15 ml離心管，制成細(xì)胞懸液，離心半徑8 cm，1 000 r/min，離心5 min，棄去上清液；用含體積分?jǐn)?shù)20﹪胎牛血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以1× 107個(gè)接種于培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5﹪的CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取第3代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.建立大鼠腎移植模型：麻醉大鼠后，游離左右腎，腹主動(dòng)脈插入灌注針，勻速灌注含肝素鈉的腎保養(yǎng)液，分離出雙腎，置于4 ℃生理鹽水保存，將雙腎移植至腎臟已被切除的大鼠體內(nèi)，縫合血管。

4.腎移植后大鼠腎小管上皮細(xì)胞原代細(xì)胞分離與培養(yǎng)[12-13]：采用腎小管節(jié)段貼塊法分離腎小管上皮細(xì)胞原代細(xì)胞，可觀(guān)察到上皮樣細(xì)胞從節(jié)段周邊長(zhǎng)出。待細(xì)胞呈指數(shù)性增長(zhǎng)達(dá)到80﹪~ 90﹪融合時(shí)，進(jìn)行傳代，取第3代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

5.腎移植后大鼠腎小管上皮細(xì)胞原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組：（1）干擾RNA轉(zhuǎn)染：細(xì)胞生長(zhǎng)至30﹪即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基稀釋1 μg siRNA，室溫孵育5 min，無(wú)血清DEME培養(yǎng)基稀釋3 μl lipofectamine 2 000，室溫孵育5 min，上述液體輕柔混勻并于室溫孵育15 min，培養(yǎng)細(xì)胞6～8 h后使用10﹪胎牛血清的培養(yǎng)基給細(xì)胞換液，繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜后加入適當(dāng)刺激條件。實(shí)驗(yàn)分組：正常對(duì)照組，槲皮素干預(yù)組，空白對(duì)照組，si-STAT3組；（2）過(guò)表達(dá)STAT3轉(zhuǎn)染：細(xì)胞生長(zhǎng)至30﹪即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基稀釋1 μg質(zhì)粒，室溫孵育5 min，無(wú)血清DEME培養(yǎng)基稀釋3 μl lipofectamine 2 000，室溫孵育5 min，上述液體輕柔混勻并于室溫孵育15 min，培養(yǎng)細(xì)胞6～8 h后使用10﹪胎牛血清的培養(yǎng)基給細(xì)胞換液，繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜后加入適當(dāng)刺激條件。實(shí)驗(yàn)分組：正常對(duì)照組，槲皮素干預(yù)組，空白對(duì)照組，過(guò)表達(dá)STAT3組。

6.主要觀(guān)察指標(biāo)：使用Western blot檢測(cè)大鼠腎組織中JAK、STAT3，以及原代腎小管上皮細(xì)胞中JAK、STAT3、p-STAT3、TGF-β1的蛋白相對(duì)表達(dá)量。酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)大鼠血清中TGF-β1水平。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，大鼠血清中ELISA測(cè)定TGF-β1蛋白表達(dá)水平，大鼠腎組織中各蛋白及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分各蛋白相對(duì)表達(dá)量均符合正態(tài)分布、方差齊性，以±s表示，采用單因素方差分析比較各組間數(shù)據(jù)差異，組間數(shù)據(jù)兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量分析：納入大鼠23只，成功率為87﹪，建模成功20只，建模失敗3只，最終進(jìn)入結(jié)果分析20只。

2.分離培養(yǎng)的大鼠BMSCs形態(tài)：原代細(xì)胞培養(yǎng)1周后，細(xì)胞由圓形逐漸變?yōu)槎嘟切?，梭形，形成?xì)胞集落。培養(yǎng)2周時(shí)，梭形細(xì)胞逐漸變長(zhǎng)，增多，呈漩渦狀生長(zhǎng)，細(xì)胞邊界逐漸聯(lián)合不清，濃度達(dá)到80﹪~ 90﹪融合，此為原代細(xì)胞（P0）。第3代（P3）時(shí)多以梭形細(xì)胞為主，細(xì)胞形態(tài)均一。

3.腎移植后大鼠血清中TGF-β1蛋白的表達(dá)：采用ELISA法檢測(cè)腎移植后大鼠血清中TGF-β1蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，對(duì)照組中TGF-β1明顯高于其他各組（P < 0.01）；兩種劑量的槲皮素干預(yù)組中TGF-β1明顯低于BMSC組（P < 0.01）；槲皮素劑量高低并未明顯影響TGF-β1表達(dá)（P = 0.28，表1）。

表1 腎移植后大鼠血清中TGF-β1蛋白的表達(dá)

4.腎移植后大鼠腎臟中JAK/STAT3的蛋白表達(dá)水平：采用Western blot法檢測(cè)腎移植后大鼠腎臟中JAK/STAT3的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，對(duì)照組腎組織中JAK、p-STAT3的蛋白相對(duì)表達(dá)量（1.5±0.2，10.7±0.5）均高于其他各組[BMSC組（0.9±0.3，8.5±0.2；q = 5.262，q = 15.75；P均< 0.01）、MSC+高槲皮素干預(yù)組（0.7±0.2，6.1±0.3；q = 7.016，q = 32.94；P均< 0.01）、MSC+低槲皮素干預(yù)組（0.7± 0.3，5.8±0.1；q = 7.016，q = 35.09；P均 < 0.01）]。MSC+高/低槲皮素干預(yù)組p-STAT3蛋白表達(dá)均低于BMSC組（q = 17.19，q = 19.34；P均< 0.01），JAK蛋白表達(dá)與BMSC組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q = 1.745，q = 1.745；P均> 0.05）；在分別聯(lián)合不同劑量槲皮素干預(yù)后，兩組間JAK、p-STAT3蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q = 0，q = 2.148；P均> 0.05）。各組間STAT3蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 0.7901，P > 0.05，圖1）。

圖1 腎移植后大鼠腎臟中JAK/STAT3的蛋白表達(dá)（n = 4）

5. BMSCs聯(lián)合腎移植大鼠腎小管上皮細(xì)胞中抑制JAK/STAT3后TGF-β1的表達(dá)：使用STAT3的干擾RNA轉(zhuǎn)染腎小管上皮細(xì)胞，予以槲皮素干預(yù)后，檢測(cè)細(xì)胞中JAK和TGF-β1表達(dá)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染si-STAT3后，si-STAT3組中STAT3表達(dá)減少70﹪，p-STAT3表達(dá)減少91﹪。轉(zhuǎn)染si-STAT3后，si-STAT3組與槲皮素干預(yù)組和空白對(duì)照組相比，JAK表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；干擾STAT3組中p-STAT3和TGF-β1蛋白相對(duì)表達(dá)量（0.7±0.1，0.3±0.1）均少于其他各組[對(duì)照組（8.2±0.4，7.1± 0.5；q = 50.71，q = 35.72；P均< 0.01）、槲皮素干預(yù)組（5.6±0.3，4.8±0.4；q = 33.13，q = 23.64；P均 < 0.01）、空白對(duì)照組（5.7±0.3，4.5±0.4；q = 33.81，q = 22.06；P均< 0.01），圖2]。

圖2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合腎移植大鼠腎小管上皮細(xì)胞中抑制JAK/STAT3后TGF-β1的表達(dá)（n = 4）

6. BMSCs聯(lián)合腎移植大鼠腎小管上皮細(xì)胞中過(guò)表達(dá)JAK/STAT3后TGF-β1的表達(dá)：使用STAT3的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染腎小管上皮細(xì)胞后，再予以槲皮素干預(yù)，檢測(cè)細(xì)胞中JAK和TGF-β1表達(dá)。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)STAT3時(shí)，過(guò)表達(dá)STAT3組中p-STAT3和TGF-β1蛋白相對(duì)表達(dá)量（10.5± 0.6，8.4±0.5）高于槲皮素刺激組[（5.7±0.3，5.4± 0.3）；q = 27.59，q = 14.70；P均< 0.01]和空白對(duì)照組 [（6.1±0.1，5.6±0.4）；q = 25.29，q = 13.72；P均< 0.01，圖3]。

討 論

間充質(zhì)干細(xì)胞主要存在于骨髓組織中，具有自我更新、橫向分化和免疫調(diào)節(jié)功能。近年來(lái)在各種創(chuàng)傷修復(fù)、組織功能重建的研究領(lǐng)域中，BMSCs具有廣泛的應(yīng)用前景。器官移植后需要機(jī)體長(zhǎng)期呈現(xiàn)免疫抑制狀態(tài)，以保證移植器官的存活。移植具有低免疫原性、免疫抑制特性的BMSCs能夠通過(guò)建立混合嵌合體，使受體產(chǎn)生特異性免疫耐受的同時(shí)，保留自身免疫功能[14]。

圖3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合腎移植大鼠腎小管上皮細(xì)胞中過(guò)表達(dá)JAK/STAT3后TGF-β1的表達(dá)（n = 4）

槲皮素具有包括免疫調(diào)節(jié)在內(nèi)的多方面作用，能夠通過(guò)減少I(mǎi)L-2從而抑制急性免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生[5]。TGF-β1是腎臟中表達(dá)最多的一種TGF-β異構(gòu)體，由腎小球和腎小管的上皮細(xì)胞分泌，是TGF-β家族中最具特征性的分子。TGF-β1是重要的免疫調(diào)節(jié)因子，參與多個(gè)生物過(guò)程，特別是其過(guò)度表達(dá)與組織纖維化密切相關(guān)；當(dāng)腎出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷時(shí)，TGF-β1表達(dá)也明顯增加。TGF-β1是各種腎病腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展的必要因子[6]。

本次研究發(fā)現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)中腎移植后的大鼠給予BMSCs治療后，TGF-β1的蛋白表達(dá)顯著低于對(duì)照組，提示BMSCs在腎移植大鼠體內(nèi)可下調(diào)大鼠體內(nèi)TGF-β1的表達(dá)，推測(cè)其原因可能是BMSCs移植誘導(dǎo)了免疫耐受。實(shí)驗(yàn)同時(shí)給予BMSCs和槲皮素后，TGF-β1的蛋白表達(dá)明顯低于單給予BMSCs的大鼠，提示槲皮素能夠進(jìn)一步促進(jìn)BMSCs移植引起的免疫耐受。

JAK激酶與其下游的 STAT組成了重要的信號(hào)途徑。在腎臟損傷中可有 STAT3蛋白的異常激活[7]。STAT3蛋白主要通過(guò)酪氨酸磷酸化被激活，是JAK的底物，能夠誘導(dǎo)某些與免疫、細(xì)胞凋亡、炎癥等多種生理、病理生理過(guò)程密切相關(guān)的關(guān)鍵基因產(chǎn)物的表達(dá)，通過(guò)各種途徑影響腎臟的功能。

研究結(jié)果顯示，腎-BMSCs聯(lián)合移植后腎組織中JAK、p-STAT3表達(dá)較對(duì)照組減低，提示BMSCs可能通過(guò)影響JAK蛋白的表達(dá)水平進(jìn)而影響JAK/ STAT3信號(hào)通路發(fā)揮誘導(dǎo)免疫耐受的作用。予以槲皮素處理后，腎組織中p-STAT3表達(dá)進(jìn)一步減低，而JAK和STAT3蛋白表達(dá)未受影響，這一結(jié)果提示槲皮素刺激可能通過(guò)抑制STAT3蛋白激酶的活化起到抑制JAK/STAT3信號(hào)通路的作用，而槲皮素對(duì)JAK的表達(dá)并無(wú)影響。

為了進(jìn)一步探討槲皮素作用靶點(diǎn)，明確是否通過(guò)作用于STAT3影響其信號(hào)通路，分離BMSCs聯(lián)合腎移植后大鼠腎小管上皮細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)槲皮素刺激可抑制STAT3蛋白的磷酸化，以及TGF-β1的表達(dá)減少，而對(duì)JAK蛋白表達(dá)無(wú)影響；在干擾STAT3蛋白表達(dá)后予以槲皮素刺激時(shí)，TGF-β1的表達(dá)呈現(xiàn)進(jìn)一步減少；當(dāng)STAT3蛋白過(guò)表達(dá)時(shí)，予以槲皮素刺激后發(fā)現(xiàn)TGF-β1表達(dá)有所增加。綜合這一結(jié)果考慮，認(rèn)為在BMSCs聯(lián)合腎移植后，槲皮素誘導(dǎo)免疫耐受主要是通過(guò)抑制STAT3蛋白激酶的活化進(jìn)行的。這一結(jié)果與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀(guān)察結(jié)果相一致。Li等[15]發(fā)現(xiàn)，在克羅恩病中，STAT3能夠與被IL-6激活，引起TGF-β1表達(dá)增加，提示克羅恩病中，由于免疫異?？赡艹霈F(xiàn)多種分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。Kinjyo等[16]發(fā)現(xiàn)激活的STAT3能夠結(jié)合于TGF-β1啟動(dòng)子，當(dāng)STAT3激活后，促進(jìn)了TGF-β1的表達(dá)。本次研究中發(fā)現(xiàn)，磷酸化STAT3表達(dá)水平與TGF-β1表達(dá)水平相一致，提示在BMSCs治療腎移植后的腎小管上皮細(xì)胞中，TGF-β1表達(dá)水平可能受到STAT3的調(diào)控。是否STAT3能夠直接影響TGF-β1表達(dá)，仍需進(jìn)一步研究。

總之，本次實(shí)驗(yàn)首次對(duì)槲皮素聯(lián)合BMSCs治療腎移植后的免疫排斥反應(yīng)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)槲皮素能促進(jìn)BMSCs更有效地進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)，達(dá)到免疫耐受，減少腎慢性損傷的發(fā)生，保護(hù)腎功能。

1 Sykes M. Immune tolerance in recipients of combined haploidentical bone marrow and kidney transplantation[J]. Bone Marrow Transplant, 2015, 50(2):S82-S86.

2 Casiraghi F, Cortinovis M, Perico NA. Recent advances in immunosuppression and acquired immune tolerance in renal transplants [J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2016, 310(6):F446-F453.

3 陳選才, 李建軍. 免疫耐受的研究現(xiàn)況及在腎移植中的應(yīng)用[J]. 社區(qū)醫(yī)學(xué)雜志, 2014, 12(23):20-23.

4 陳正. BM-MSC誘導(dǎo)移植免疫耐受和修復(fù)慢性移植腎損傷的初步研究[D]. 長(zhǎng)沙: 中南大學(xué), 2013.

5 駱明旭, 羅丹, 趙萬(wàn)紅. 槲皮素藥理作用研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)民族民間醫(yī)藥, 2014 (17):12-14.

6 羅皓. TGFβ1-ILK下游信號(hào)分子及C-C類(lèi)趨化因子在慢性移植腎失功發(fā)病機(jī)制中的作用及其意義的研究[D]. 廣州: 南方醫(yī)科大學(xué),2013.

7 郭虹,馬宏,殷愛(ài)云.腎間質(zhì)損傷早期信號(hào)蛋白JAK-2/STAT-3與TGF-β-1表達(dá)趨勢(shì)及相關(guān)性[J].臨床醫(yī)藥實(shí)踐雜志, 2008, 17(12): 963-965.

8 王平賢, 方麗, 黃赤兵, 等. 移植腎TGF-β1表達(dá)與遠(yuǎn)期腎功能關(guān)系的臨床研究[J]. 醫(yī)學(xué)臨床研究, 2005, 22(1):1-4.

9 王平賢, 黃秀英, 王安靜, 等. 移植腎轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1與遠(yuǎn)期腎功能的關(guān)系[J]. 中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2004, 29(6):700-703.

10 陳嬌, 張蔚, 敖良飛, 等. 槲皮素對(duì)宮頸癌HeLa 細(xì)胞STAT3的表達(dá)及其信號(hào)通路的影響[J/CD]. 中華臨床醫(yī)師雜志:電子版, 2011, 5(19):5656-5661.

11 郝惠惠, 邵珠民, 杜倩, 等. 槲皮素對(duì)糖尿病大鼠氧化應(yīng)激及TGF-β1/ CTGF的影響[J]. 中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志, 2012, 32(13): 1012-1016.

12 杜勝華, 唐德燊, 劉華鋒. SD大鼠腎小管上皮細(xì)胞兩種原代培養(yǎng)及傳代方法的比較[J]. 廣東醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2005, 23(1):10-13.

13 王光蘭, 陳爽, 張麗紅, 等. 大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)和鑒定[J]. 中國(guó)老年學(xué)雜志, 2010, 30(3):334-336.

14 王耘川. BMSCs聯(lián)合骨髓移植建立嵌合體并誘導(dǎo)免疫耐受形成的機(jī)制研究[D]. 西安: 第四軍醫(yī)大學(xué), 2012.

15 Li C, Iness A, Yoon J, et al. Noncanonical STAT3 activation regulates excess TGF-β1 and collagen I expression in muscle of stricturing Crohn's disease[J]. J Immunol, 2015 194 (7):3422-3431.

16 Kinjyo I, Inoue H, Hamano S, et al. Loss of SOCS3 in T helper cells resulted in reduced immune responses and hyperproduction of interleukin 10 and transforming growth factor-beta 1[J]. J Exp Med, 2006, 203(4):1021-1031.

楊軍,陳花,石韶華,等. 槲皮素對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植聯(lián)合腎移植所誘導(dǎo)的免疫耐受的影響[J/CD].中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志（電子版）, 2017, 7(1):23-28.

Effects of quercetin on immune tolerance induced by bone marrow mesenchymal stem cells in kidney transplantation

Yang Jun, Chen Hua, Shi Shaohua, Ma Y ongwen, Wang Zhenxing, Wu Xiaotong. Kidney Tranplant Center of the Second People's Hospital of Shanxi Pr ovince, Taiyuan 030012, China

Yang jun, Email: yj240026293@163.com

ObjectiveThe study was to investigate the effects of different concentrations of quercetin on bone marrow mesenchymal stem cells（BMSCs）-induced immune tolerance in rats after kidney transplantation.Methodshe rats were randomly divided into four groups after kidney transplantation: control group, BMSCs group, MSC+ low-dosage quercetin group and MSC+ high-dosage quercetin group. Janus-activated kinase（JAK）, Signal transducer and activator of transcription 3（STAT3）, p-STAT3 protein expression in kidney tissue were detected by Western blot. Serum transforming growth factor-β1（TGF-β1）was detected by ELISA assay. We collected the proximal tubule epithelial cells from the MSC group, and cultured them with or without stimulation of quercetin. Expressions of JAK, STAT3, p-STAT3, and TGF-β1 were detected by Western blotafter STAT3 was inhibited and overexpressed in these cells, respectively.ResultsAfter kidney transplantation, TGF-β1 in serum in the control group（19 162±223）pg/ml was higher than any of other groups（BMSC group, 12 106±163 pg/ml; MSC+ high dosage of quercetin groups, 9 113±110 pg/ml; MSC+ low dosage of quercetin groups, 9 024±133 pg/ml）. When compared to the control group, the q values of these groups were 96.88, 138.0, 139.2, respectively（P < 0.01）. Protein expression of JAK and p-STAT3 in the kidney tissue（1.5±0.2, 10.7±0.5）were significantly higher in control group than in the other groups: BMSC group（0.9±0.3, 8.5±0.2; P = 0.0059）, MSC+ high dosage of quercetin groups（0.7±0.2, 6.1±0.3; P = 0.0002）, and MSC+ low dosage of quercetin groups（0.7±0.3, 5.8±0.1; P = 0.0011）. In group with inhibition of STAT3, relative protein expression of p-STAT3 and TGF-β1（0.7±0.1, 0.3±0.1）in the proximal tubule epithelial cells were significantly reduced compared to the other groups: control group（8.2±0.4, 7.1±0.5; P < 0.0001, P < 0.0001）, quercetin group（5.6±0.3, 4.8±0.4; P < 0.0001, P < 0.0001）, and si-control group（5.7±0.3, 4.5±0.4; P < 0.0001, P < 0.0001）. In group with overexpression of STAT3, relative protein expression of p-STAT3 and TGF-β1（10.5±0.6, 8.4±0.5）were significantly higher than those in the quercetin group（5.7±0.3，5.4±0.3; P < 0.0001, P < 0.0001）and vector plasmid group（6.1±0.1, 5.6±0.4; P < 0.0001, P = 0.0001）.ConclusionSimultaneous administration of quercetin and transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells can effectively inhibit rejection and improve renal function in rats with kidney transplantation. Quercetin may regulate immune function through JAK/STAT3/ TGF-β1 pathway.

Quercetin; Bone marrow; Mesenchymal stem cells; Kidney transplantation; Immune tolerance

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2017.01.005

030012 太原，山西省第二人民醫(yī)院腎移植中心

楊軍，Email：yj240026293@163.com