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    模擬生產(chǎn)工藝制作大腸桿菌苗課堂改革

    2017-03-09 10:18任平韓雙張凱華
    北方經(jīng)貿(mào) 2017年1期
    關(guān)鍵詞:大腸桿菌流程

    任平 韓雙 張凱華

    摘要:隨著高職教育課堂形式改革的不斷深入,理實一體化課堂形式已成為培養(yǎng)高職學(xué)生的主要運行模式。大腸桿菌疫苗的制作是《生物藥物制備技術(shù)課程》的主修內(nèi)容,具有實踐性和應(yīng)用性強的特點,為了使菌苗制作的工序過程更接近生產(chǎn)實際,讓學(xué)生“零距離”體驗生產(chǎn)崗位的操作標準,掌握操作過程的技能與技巧,經(jīng)過多年來的探索和實踐,總結(jié)出模擬生產(chǎn)工藝制作大腸桿菌鋁膠滅活苗的一些經(jīng)驗供相關(guān)學(xué)者參考。

    關(guān)鍵詞:模似生產(chǎn);流程;大腸桿菌

    中圖分類號:G71 文獻標識碼:A

    文章編號:1005-913X(2017)01-0143-02

    大腸桿菌疫苗制作的課堂教學(xué)在內(nèi)容設(shè)計上,由原來的零散實驗如:培養(yǎng)基的制作、菌種的培養(yǎng)、細菌的計數(shù)方法、鋁膠的配制、配苗和檢驗等,改為模擬大腸桿菌的生產(chǎn)工藝流程,按照生產(chǎn)崗位的操作標準,以生產(chǎn)上的工序過程,利用理實一體化課堂教學(xué)模式,完成大腸桿菌鋁膠滅活苗的制作和檢驗,全過程分基本知識介紹和基本技能操作兩部分。

    一、基本知識介紹

    讓學(xué)生課下復(fù)習大腸桿菌相關(guān)的理論知識,課堂上通過播放工業(yè)生產(chǎn)中大腸桿菌苗的視頻及課件了解大腸桿菌苗的整體制作過程;同時講清大腸桿菌每道工序操作的要點及注意事項。讓學(xué)生明晰在生產(chǎn)崗位所要從事的工作。

    二、基本技能操作訓(xùn)練

    整個操作過程分6道工序完成。將學(xué)生分成6個小組,按工序的順序進行實施。完成每一道工序時,按生產(chǎn)上的操作標準(模擬生產(chǎn)要求)執(zhí)行,同時按要求檢驗每道工序作品是否合格,合格后方可執(zhí)行下一道工序。

    (一)菌種的選擇與鑒定

    可選用購買的大腸桿菌標準菌種或按常規(guī)制作血液瓊脂平板或營養(yǎng)瓊脂平板,分離培養(yǎng)含大腸桿菌的病料(死于大腸桿菌病的動物心血、腹水、肝滲出物、氣囊附著物或正常動物的腸道內(nèi)容物),經(jīng)伊紅美蘭瓊脂平板培養(yǎng),挑選出黑色帶金屬光澤菌落;經(jīng)靛基質(zhì)試驗、甲基紅試驗,結(jié)果呈陽性,VP試驗,結(jié)果呈陰性;細菌經(jīng)涂片、革蘭氏染色、顯微鏡檢查,結(jié)果呈中等大小革蘭氏陰性(紅色)的桿菌;經(jīng)因子血清鑒定確定血清型后,可作為標準菌種使朋。菌種可保存在瓊脂斜面中(短期使用)或采用冷凍干燥法保存(長期使用),以免發(fā)生變異。

    (二)種子培養(yǎng)及菌液的制備

    取上述大腸桿菌菌種接種于伊紅美蘭瓊脂平板或麥康凱瓊脂平板上,置37℃溫箱中培養(yǎng)18~24 h,挑取單個典型菌落,移植于瓊脂斜面中作為種子。用滅菌吸管取5 mL馬丁肉湯加人大腸桿菌的瓊脂斜面中,用接種環(huán)刮取下菌體,研磨稀釋后倒入另一只滅菌試管中,置37%培養(yǎng)18~24h后,作為一級種子。將一級種子按10%的量再次接種馬丁肉湯中進一步擴大培養(yǎng)后,做為配苗菌液。取配苗菌液少量裝于滅菌試管中做菌數(shù)計數(shù),其余菌液滅活待做配苗用(強毒細菌須在殺菌后,再行計數(shù))。

    (三)采用活菌計數(shù)法或比濁計數(shù)法對配苗菌液進行計數(shù)

    活菌計數(shù)法可選用平板表面涂布法或傾注平板培養(yǎng)法。

    1.活菌計數(shù)?;罹嫈?shù)法是將待測菌液精確地作一系列稀釋,然后吸取一定量某稀釋度的菌液樣品,選用適當?shù)姆椒ㄟM行培養(yǎng)。一個活的細菌經(jīng)培養(yǎng)后,在平板培養(yǎng)基上大量繁殖可形成一個肉眼可見的菌落,從長出的菌落數(shù)及稀釋倍數(shù),換算出每毫升待測菌液中的活菌數(shù)即細菌總數(shù)。

    (1)平板表面涂布法

    制備營養(yǎng)瓊脂平板。用商品化的營養(yǎng)瓊脂粉,按常規(guī)方法制作營養(yǎng)瓊脂平板8個,用前將營養(yǎng)瓊脂平板倒置在37℃溫箱中烘干1h,使其表面的水分蒸發(fā)。取出后將其分為4組,每組2個平板,第4組為對照組。

    稀釋菌液。根據(jù)待測菌液中菌數(shù)含量的多少,在做培養(yǎng)之前,用普通肉湯或生理鹽水將被測菌液作10倍遞進稀釋即10-1、10-2、10-3、10-4……。稀釋方法為:取滅菌試管6~10支,分別標明稀釋倍數(shù);每支試管中加入滅菌生理鹽水或肉湯9mL;另取滅菌吸管吸取待測菌液1mL,加入第1支試管中,充分混勻,稀釋倍數(shù)為10-1;從第1支試管中吸取稀釋菌液1mL加入到第2支試管中,充分混勻,稀釋倍數(shù)為10-2,如此一直稀釋到最后一支試管。

    涂樣。另取三支滅菌吸管,分別吸取后三個稀釋度試管中的菌懸液0.1mL,對應(yīng)加在3組營養(yǎng)瓊脂平板上,每一個稀釋度菌液接種2個平板,用滅菌L形玻璃棒將菌液涂勻。在平皿底作好與試管稀釋度相同的標記。第4組作對照,加稀釋液0.1mL。

    培養(yǎng)。將上述各組的平板置37℃溫箱中培養(yǎng)1~2h,使菌液滲透于培養(yǎng)基內(nèi),然后倒置培養(yǎng)24h。

    計數(shù)。從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)皿,用肉眼觀察計算每個平板上的菌落數(shù),必要時可用5-10倍放大鏡觀察,以免遺漏。一般選擇菌落數(shù)在30~300之間的平皿用以計數(shù),每個稀釋度應(yīng)取其菌落平均數(shù),并求3個稀釋度之和再取其平均值,得出每毫升待測菌液所含的活菌數(shù)。按下式計算活菌數(shù)。

    活菌數(shù)/mL=2個平板平均菌落數(shù)×10×稀釋倍數(shù)。舉例:在10-8稀釋的平板中所得平均菌落數(shù)為85個。計算結(jié)果:85×10×108=8.5×1010個活菌/mL

    說明:對照組應(yīng)無菌落生長,否則試驗結(jié)果不準確,應(yīng)重做。

    前一稀釋度的平均菌落數(shù)應(yīng)大致為后一稀釋度平均菌落數(shù)的10倍左右,如差別太大,則說明試驗不準確,應(yīng)重做。

    (2)傾注平板培養(yǎng)法

    待檢菌液稀釋方法同上。分別吸取后三個稀釋度試管中的菌懸液1mL加在滅菌平皿中,然后取預(yù)先融化且冷卻至50℃~55℃的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基分別傾入上述平皿中,立即搖勻平放,待其冷凝后,置37℃培養(yǎng)24h。統(tǒng)計平皿上長出的菌落數(shù),乘以稀釋倍數(shù),計算出三個稀釋度的平均數(shù),即為每毫升待測菌液所含的活菌數(shù)。

    2.比濁計數(shù)法

    比濁計數(shù)法是通過對比待測菌液與標準比濁管的濁度,求出大致的細菌總數(shù)。標準比濁管由國家生物制品檢定部門提供,每套包括一支細菌比濁標準管、數(shù)支對照空管和一張比濁用的圖片,說明書上注明標準管相當于不同細菌種類的菌數(shù),使用期為1年。也可自行制作標準比濁管。比濁計數(shù)法節(jié)時方便,但誤差大。

    (1)標準比濁管的制備

    選取口徑和管壁厚薄一致的潔凈試管10支,分別加入1%氯化鋇溶液,然后加入1%濃硫酸溶液,使各管總液量為10mL,加塞并用石蠟封固,保存?zhèn)溆谩8鞴芗右毫考皾岫葐挝灰姳?。

    (2)比濁方法

    取待測菌液1mL加入空試管中,與標準管并列緊貼在圖片前,使兩管受光均勻,透過兩管管壁對比觀察,目測圖片的清晰度。比濁時標準管與待測菌液管應(yīng)經(jīng)常搖勻。若待測菌液管較標準管過濃時,可在待測管中加適量生理鹽水進行調(diào)整,直至兩管背后的圖片清晰度相同為止。

    例如:測定大腸桿菌的菌數(shù),若1mL菌液加入4mL的生理鹽水后,與標準管的濁度相同,即表示該菌液經(jīng)5倍稀釋后相當于標準管。大腸桿菌標準管的菌數(shù)相當于8億個/mL,故被測菌數(shù)為8×5=40億個/mL,

    (四)滅活與檢驗

    滅活在疫苗制造上是將細菌及其產(chǎn)生的毒素用物理或化學(xué)方法處理,使其喪失毒力或致病性,而保留其抗原性的過程。滅活時,根據(jù)細菌的特性選用有效的滅活劑和最適的滅活條件。甲醛是大腸桿菌滅活中最有效的滅活劑,向上述培養(yǎng)的大量菌液中加人終濃度0.3%甲醛溶液,置37℃溫箱滅活24~48h。取少量滅活后菌液接種于營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)3天,檢查無細菌生長,證明滅活完全。

    (五)配制氫氧化鋁膠與配苗

    將滅活后的菌液按5份菌液加入1份氫氧化鋁膠進行配苗,大腸桿菌的菌液濃度為100億-400億個/ml。配苗時應(yīng)充分振蕩,加入0.01%硫柳汞防腐,置2~8℃靜置2-3天,抽棄上清液,濃縮成全量的60%。塞上膠塞,用固體石蠟溶化封口,貼上標簽,注明菌苗名稱,使用前充分搖勻。在菌液中加入氫氧化鋁膠(佐劑),是為了增強免疫效果。

    氫氧化鋁膠的制作:先用去離子水將無水A1Cl3配成25%溶液,加熱溶化,使用時稀釋成8%的溶液;另配4%NaOH溶液,將兩種溶液同時加溫至56℃~60℃。在此溫度下,將NaOH溶液緩慢加入于8%AlCl3溶液中,邊加邊攪拌,當pH值達5.6-6.0時,即為終點,繼續(xù)攪拌10分鐘,置高壓滅菌器內(nèi)121.3℃滅菌20分鐘,氫氧化鋁膠呈透明略帶乳光液體,保存期不超過3個月。

    (六)成品檢驗

    1.無菌檢查

    取1ml鋁膠苗加入49ml硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基中,培養(yǎng)72h后,移植于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中和酪胨瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天,檢查無細菌生長。

    2.安全檢驗

    取1月齡健康易感雞5只,各頸部皮下或肌肉注射鋁膠苗2ml,同時設(shè)不接種疫苗的對照組,與免疫組同條件飼養(yǎng),觀察14天,應(yīng)健康存活,剖檢時,內(nèi)臟器官及注射部位應(yīng)無損傷。

    3.效力檢驗

    取1月齡健康非免疫雞5只,各頸部皮下注射鋁膠苗0.5ml,21天后,連同條件的對照組雞5只,各腹腔注射致病性大腸桿菌的肉湯培養(yǎng)物0.5ml(含活菌2億~5億個)。攻毒后觀察14天,對照組雞應(yīng)全部發(fā)病或死亡,剖檢后具有典型病變;免疫組雞保護率在70%以上,為合格。

    通過對學(xué)生模擬生產(chǎn)工藝制作大腸桿菌鋁膠滅活苗的理實一體化的課堂訓(xùn)練,不僅讓學(xué)生掌握生產(chǎn)大腸桿菌疫苗的操作技巧,學(xué)會細菌性滅活苗的制作,同時讓學(xué)生感受到自己是在生產(chǎn)崗位上工作,即是學(xué)習,又是工作,鍛煉了學(xué)生對應(yīng)職工作崗位的認知和了解。又因為是小組共同完成任務(wù),又培養(yǎng)了學(xué)生共處共生、團結(jié)協(xié)助的關(guān)系。為學(xué)生今后走向工作崗位打下堅實基礎(chǔ)。

    [責任編輯:馬欣]

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