清熱解毒扶正顆粒對(duì)ETM大鼠血清IL—1β、IL—12及TNF—α含量的影響

萬啟南+韋袞政+李黔云

摘要：目的 探討清熱解毒扶正顆粒對(duì)ETM大鼠血清IL-1β、IL-12及TNF-α含量的影響。方法 90只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型對(duì)照組、西藥組以及中藥低、中、高劑量組，采用腹腔注射脂多糖法（LPS）復(fù)制大鼠內(nèi)毒素血癥模型。正常組、模型對(duì)照組予生理鹽水1ml/100g灌胃，每天1次；西藥組給甲基強(qiáng)的松龍1.17mg/100g灌胃，每天1次；中藥組給清熱解毒扶正顆粒1ml/100g灌胃，每天1次；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用ELISA法測(cè)定各組血清IL-1β、IL-12、TNF-α的水平。結(jié)果 與模型組比較，各治療組均有效降低了血清中IL-1β濃度（P<0.05）；甲強(qiáng)龍組、中藥組高、中劑量組能有效降低血清IL-12濃度（P<0.05），低劑量組則不能有效降低血清IL-1β濃度（P>0.05）；中藥中、高劑量組能有效降低血清TNF-α濃度（P<0.05），低劑量組、甲強(qiáng)龍組不能有效降低血清TNF-α濃度（P>0.05）。結(jié)論 清熱解毒扶正顆粒中、高劑量組能有效下調(diào)ETM大鼠血清中IL-1β、IL-12等炎性因子的含量，從而在某種程度上達(dá)到對(duì)內(nèi)毒素血癥的治療作用。

關(guān)鍵詞：清熱解毒扶正顆粒；內(nèi)毒素血癥；白介素-1β；白介素-12；腫瘤壞死因子-α

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1007-2349（2017）02-0087-03

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，內(nèi)毒素血癥（Endotoxeamia，ETM）發(fā)生原因是在嚴(yán)重創(chuàng)傷、感染等應(yīng)激狀態(tài)下全身的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)功能障礙，免疫機(jī)能下降，腸腔革蘭陰性細(xì)菌內(nèi)毒素從腸道移位進(jìn)入血液及機(jī)體組織，誘導(dǎo)內(nèi)毒素血癥及全身免疫反應(yīng)的發(fā)生，導(dǎo)致機(jī)體組織、細(xì)胞的損傷，造成機(jī)體死亡[1]。其誘導(dǎo)的大量炎性介質(zhì)失控性釋放所致的全身炎性反應(yīng)綜合征（SIRS），以及進(jìn)一步惡化發(fā)展成為的多臟器功能失常綜合征（MODS）是嚴(yán)重感染患者走向死亡的主要途徑，而該惡性進(jìn)展的關(guān)鍵啟動(dòng)因子為內(nèi)毒素及其誘導(dǎo)的失控性大量炎性介質(zhì)。因此，拮抗內(nèi)毒素及調(diào)控其誘導(dǎo)的失控性大量炎性介質(zhì)具有重要臨床意義。本研究通過腹腔注射脂多糖（lipopo-lysaccharide，LPS）誘導(dǎo)大鼠內(nèi)毒素血癥模型，觀察各處理組大鼠血清中白介素-1β（IL-1β）、白介素-12（IL-12）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的濃度水平，旨在了解清熱解毒扶正顆粒對(duì)大鼠ETM模型中炎性介質(zhì)的影響，并探討其部分藥效?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇Wistar大鼠（SCXK{川}2013-24，001643）90只，體重（200±20）g。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 LPS（sigma公司，L2630），大鼠（Rat）白介素1β（IL-1β）、白介素12（IL-12）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA檢測(cè)試劑盒（Biocalvin，蘇州卡爾文生物科技有限公司，20250802A）。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥品 ①清熱解毒扶正顆粒：由翼首草，荷葉頂，魚腥草，柴胡，葛根，太子參，麥冬，丹皮，薏苡仁等14味藥組成。以上14味藥由云南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中藥房鑒定為正品；薏苡仁、葛根、丹皮粉碎成細(xì)粉，其余翼首草等11味加水煎煮3次，每次1 h，合并煎液，濾過，濃縮至相應(yīng)密度為1.30～1.35（500C）的浸膏1份，蔗糖3份，糊精1份，及上述細(xì)粉混勻，制成顆粒，干燥既得。1 g相當(dāng)于原生藥1.26 g。相當(dāng)于15 g/袋含生藥18.9 g，1日服生藥56.7 g。低劑量組含生藥為0.5 g/ml，中劑量組含生藥為1 g/mL，高劑量組含生藥為2 g/mL。4℃保存；②甲基強(qiáng)的松龍（國藥集團(tuán)容生制藥有限公司，40 mg，國藥準(zhǔn)字H20030727）。

1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備 ①酶標(biāo)儀（450nm，spectraMax i3x，美國MOLECULAR DEVICES公司）。②恒溫箱（3111，美國Thermo公司）。③離心機(jī)（1.0R，美國Thermo公司）。④電子天平（YP3000型，上海精科天平廠）。

2 方法

2.1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模 除正常組外，其余大鼠根據(jù)文獻(xiàn)[1]采用腹腔注射脂多糖（LPS）致大鼠內(nèi)毒素血癥模型。具體操作方法是先每日測(cè)量大鼠體溫（肛溫）2次，連續(xù)2 d，取2次體溫的平均值記為基礎(chǔ)體溫。單次體溫超過38℃或2次體溫差超過0.5℃的動(dòng)物剔除。實(shí)驗(yàn)前6 h禁食不禁水。然后腹腔注射LPS，誘導(dǎo)動(dòng)物發(fā)熱，注射LPS后每隔30 min測(cè)一次體溫，連續(xù)測(cè)8h。

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理 90只大鼠進(jìn)行編號(hào)，查隨機(jī)數(shù)字表分為正常組、模型對(duì)照組、西藥組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組。（1）正常組每日予生理鹽水1ml /100g灌胃，每天1次；（2）其余大鼠均腹腔注射脂多糖（LPS）制成大鼠內(nèi)毒素血癥模型，脂多糖用生理鹽水配制成10mg/ml溶液，參照文獻(xiàn)1造模方法造模成功后分為模型對(duì)照組、西藥組、中藥低、中、高劑量組。①模型對(duì)照組予生理鹽水1ml/100g灌胃，每天1次；②西藥組給甲基強(qiáng)的松龍：1.17mg/100g體重灌胃，每天1次；③中藥組每日灌胃1次，按照人與大鼠劑量換算標(biāo)準(zhǔn)并適當(dāng)調(diào)整確定灌胃劑量：給藥劑量（g/kg）=給出的人的劑量（g）×系數(shù)（0.018）/所求動(dòng)物體重（kg）；1ml/100g灌胃，每天1次；中藥低、中、高劑量分別相當(dāng)于5、10、20g/kg。分別于3d、7d和14d每組各處死大鼠1只，4周后（28天）處死所有大鼠。

2.3 觀察檢測(cè)指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將抽取的小鼠血液放入血清分離管中，室溫放置30min，以3000r·min-1離心10min分離血清，吸取血清放入1.5mL 離心管中，4℃保存，用ELISA法測(cè)定血清IL-1β、IL-12、TNF-α的水平。嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟操作。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 結(jié)果以（x±s）表示，采用One-Way ANOVA檢驗(yàn)并對(duì)樣本進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)；樣本方差不具有齊性時(shí)，采用Kruskal-Wallis H test進(jìn)行檢驗(yàn)，并進(jìn)行組間的多重比較[2]。數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 IL-1β各組間比較 經(jīng)One-Way ANOVA檢驗(yàn)，方差不具有齊性，組間多重比較采用Kruskal-Wallis H test進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果如下：P<0.05，各組之間差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

各組間兩兩比較（Kruskal-Wallis H test）：各組與模型組比較，均表現(xiàn)出了顯著差異性（P<0.05）；各組與空白對(duì)照組比較，除模型對(duì)照組外（P<0.01），差異均不顯著（P>0.05），提示中藥組和甲強(qiáng)龍組均有效降低了血清中IL-1β濃度；甲強(qiáng)龍組和中藥組比較，與中藥高劑量組差異不顯著（P>0.05），與中、低劑量組差異顯著（P<0.05），提示甲強(qiáng)龍組降低血清IL-1β濃度作用優(yōu)于中藥中、低劑量組；中藥組之間兩兩比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），亦提示中藥組高、中、低劑量對(duì)于均有效降低了血清中IL-1β濃度。

3.2 IL-12各組組間比較 經(jīng)One-Way ANOVA檢驗(yàn)，方差不具有齊性，組間多重比較采用Kruskal-Wallis H test進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果如下：P<0.05，各組之間差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

各組間兩兩比較（Kruskal-Wallis H test）：各組與模型組比較，除低劑量組外（P>0.05）均表現(xiàn)出了顯著差異性（P<0.05），提示甲強(qiáng)龍組、中藥組高、中劑量組能有效降低血清IL-12濃度，低劑量組則不能有效降低血清IL-12濃度。各組與空白對(duì)照組比較，高劑量組、中劑量組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；甲強(qiáng)龍組、低劑量組均差異顯著（P<0.05），表明中藥組高、中劑量組調(diào)控血清IL-12濃度效果要優(yōu)于甲強(qiáng)龍組；甲強(qiáng)龍組和中藥組比較，與中藥中、高劑量組差異不顯著（P>0.05），與低劑量組差異顯著（P<0.05），提示甲強(qiáng)龍組降低血清IL-12濃度作用優(yōu)于低劑量組。中藥各組兩兩比較，[HJ2mm]中藥高、中劑量組未見明顯差異（P>0.05），表明2組降低血清IL-12濃度的作用無明顯差異，兩組與低劑量組比較差異均顯著（P<0.05），亦提示低劑量組不能有效降低血清IL-12濃度。

3.3 TNF-α各組組間比較 經(jīng)One-Way ANOVA檢驗(yàn)，方差不具有齊性，組間多重比較采用Kruskal-Wallis H test進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果如下：P<0.05，各組之間差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

各組間兩兩比較（Kruskal-Wallis H test）：各組與模型組比較，中劑量組、高劑量組表現(xiàn)出了顯著差異性（P<0.05），低劑量組、甲強(qiáng)龍組差異不顯著（P>0.05）；各組與空白對(duì)照組比較，高劑量組、中劑量組無明顯差異（P>0.05），甲強(qiáng)龍組、低劑量組差異顯著（P<0.05），提示中藥中、高劑量組能有效降低血清TNF-α濃度，中藥低劑量組、甲強(qiáng)龍組則不能有效降低血清TNF-α濃度；中藥各組與甲強(qiáng)龍組比較，均差異顯著（P<0.05），提示中藥組低劑量組降低血清TNF-α濃度亦顯著優(yōu)于甲強(qiáng)龍組；中藥各組兩兩比較，中藥高、中劑量組未見明顯差異（P>0.05），表明兩組降低血清TNF-α濃度的作用無明顯差異，2組與低劑量組比較差異均顯著（P<0.05），亦提示低劑量組不能有效降低血清TNF-α濃度。

4 討論

內(nèi)毒素血癥多與中醫(yī)學(xué)“溫病”、“瘟疫”、“熱毒”等過程的一些重癥相似。其病例特點(diǎn)多屬初時(shí)邪盛而正氣抵抗力亦強(qiáng)，形成高熱；其后熱盛耗損津液，劫灼營陰，直至動(dòng)血耗血，終至氣陰耗竭。故內(nèi)毒素血癥在病機(jī)上屬“正虛邪實(shí)”，對(duì)應(yīng)的治療原則應(yīng)是“扶正”和“祛邪”并舉。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中單純抗生素的應(yīng)用只能解決“祛邪”的問題，而忽視了“扶正”的保護(hù)性治療的重要性。所以不少醫(yī)家提出熱毒內(nèi)盛、瘀血阻滯、氣陰兩虛是內(nèi)毒素血癥的重要病機(jī)，當(dāng)治以清熱解毒、活血化瘀、益氣養(yǎng)陰[3]。

本研究在中醫(yī)的整體論指導(dǎo)下，從整體上把握疾病“證”的變化，制定出以扶正祛邪為治療原則，以清熱解毒、涼血化瘀、益氣養(yǎng)陰為治法的復(fù)方中藥制劑——清熱解毒扶正顆粒，為感染性疾病的中醫(yī)藥治療提供了有效方法。本制劑由翼首草、芙蓉葉、魚腥草、麥冬、太子參、丹參等14味中藥組成，臨床觀察對(duì)外感高熱、肺炎等具有較好的療效[4-5]。方中君藥翼首草為藏藥，生長于高寒地區(qū)如西藏各地、青海、四川西部和北部、云南西北部等，具有清熱解毒、祛風(fēng)濕、止痛等作用，有研究表明對(duì)急性炎癥的滲出和水腫有明顯的抑制作用，因此具有顯著的抗炎活性[6]。麥冬中的麥冬皂苷及麥冬多糖可顯著增加小鼠器官胸腺、脾臟重量，并激活小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬功能，提高血清溶血素抗體水平.增加機(jī)體的免疫力[7]。太子參多糖具有抗疲勞、抗應(yīng)激和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用[8]。丹參有效成分丹參酮、丹酚酸類化合物有改善血液循環(huán)、抗菌和抗炎、抗氧化、抗凝血和細(xì)胞保護(hù)等作用[9]。另外魚腥草、芙蓉葉等不僅具有抗病毒、抗菌、抗炎等功效，且均有調(diào)節(jié)免疫功能的作用。

本次研究結(jié)果表明，甲基強(qiáng)的松龍能有效降低血清IL-12濃度，且在降低血清IL-1β濃度方面優(yōu)于中藥中、低劑量組，和中藥高劑量組則無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但甲基強(qiáng)的松龍?jiān)诒敬窝芯恐形匆娒黠@降低血清中TNF-α的水平的作用，甚至在部分ETM大鼠血清中有所升高，這可能與甲基強(qiáng)的松龍對(duì)ETM大鼠的免疫抑制引起的免疫調(diào)控系統(tǒng)紊亂有關(guān)。清熱解毒扶正顆粒中、高劑量組均能有效降低血清中IL-1β、IL-12及TNF-α的濃度水平，且在調(diào)控血清IL-12水平方面優(yōu)于甲基強(qiáng)的松龍，低劑量組能有效降低血清中IL-1β的水平，而對(duì)于IL-12及TNF-α則無明顯效果，結(jié)合本藥的解熱、抗炎作用的前期研究[4-5]，表明清熱解毒扶正顆粒可以通過調(diào)節(jié)血清中IL-1β、TNF-α等炎性因子在機(jī)體的平衡達(dá)到對(duì)內(nèi)毒素血癥的治療作用。關(guān)于本藥治療內(nèi)毒素血癥的分子機(jī)制及其作用靶點(diǎn)，尚有待于進(jìn)一步研究探索。

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（收稿日期：2016-10-31）