大孔樹脂分離純化麥胚黃酮研究

劉宛玲,肖建輝,黃占旺,牛麗亞,*

(1.江西農業(yè)大學食品科學與工程學院,江西南昌 330045;2.江西農業(yè)大學工學院,江西南昌 330045)

大孔樹脂分離純化麥胚黃酮研究

劉宛玲1,肖建輝1,黃占旺2,牛麗亞1,*

(1.江西農業(yè)大學食品科學與工程學院,江西南昌 330045;2.江西農業(yè)大學工學院,江西南昌 330045)

在前期研究麥胚黃酮最佳浸提工藝基礎上,為探討麥胚黃酮純化工藝,本實驗選擇大孔樹脂對其進行分離純化。以吸附能力、吸附率及解吸率為考察指標,從7種型號大孔樹脂中篩選出分離純化麥胚黃酮效果優(yōu)的樹脂,并確定該樹脂的最佳工藝條件。結果表明,H103大孔樹脂的吸附率、吸附能力都較高,為麥胚黃酮最佳分離樹脂,其最佳工藝條件為上樣濃度約0.65 mg/mL、上樣速度2.0 BV/h、解吸乙醇濃度70%、解吸速度2.0 BV/h。經H103樹脂分離后的麥胚黃酮純度大大提高,為11.77%,比浸提液中麥胚黃酮純度0.96%提高了12.26倍。

麥胚黃酮,大孔樹脂,分離純化

麥胚是小麥籽粒的生命源泉,不僅含有豐富的脂肪、蛋白質,還含有多種微量元素和礦物質,被譽為“人類天然的營養(yǎng)寶庫”[1]。我國是世界上最大的小麥生產和消費國,每年可以開發(fā)利用的小麥胚芽潛藏量高達280～420萬噸[2-3]。但由于麥胚中含有豐富的脂肪酶和蛋白酶,影響面粉的穩(wěn)定性和烘焙品質[4]。因此,傳統(tǒng)的制粉工業(yè)一般都將表皮和胚芽作為動物飼料處理掉,使得麥胚資源未能得到充分、合理、有效的利用。

近些年隨食品工業(yè)的迅猛發(fā)展,帶動并促進了小麥提胚制粉技術的快速發(fā)展。小麥胚芽中豐富的營養(yǎng)與保健成分,也受到國內外研究學者的重視[2]。從麥胚中提取、分離純化黃酮類化合物,可為麥胚黃酮類化合物的應用奠定理論基礎,加速對麥胚資源綜合利用的研究,具有較高的經濟效益。

目前,麥胚中黃酮類化合物的提取工藝主要包括:溶劑浸提、超聲波輔助提取、生物酶解提取等。如于長青[5]等人采用水提法、加堿浸提法、醇提法分別從麥胚中提取黃酮,通過比較,發(fā)現(xiàn)醇提法的提取效果最好。張燕梁[6]等人采用纖維素酶酶法提取麥胚中的黃酮,最大提取率為0.602%。上述方法,雖然實現(xiàn)了麥胚中黃酮類化合物的提取分離,但黃酮的得率和純度都較低,且得到的均為粗提物,需進一步對其進行純化。目前國內外對于麥胚黃酮分離純化方法的研究很少,僅有杜敏華等[7]通過篩選得出AB-8大孔樹脂對麥胚黃酮有較好的吸附和解吸效果,但未對其純化效果作說明。

本文較為系統(tǒng)的比較了7種大孔樹脂對麥胚黃酮的吸附、解吸效果,并對最佳樹脂純化工藝進行了優(yōu)化,為麥胚黃酮的初步分離純化提供理論依據,并為麥胚資源的充分利用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

小麥胚芽 購自鄭州金苑面業(yè)有限公司;AB-8、D101、HPD100、HPD300、HPD500型大孔樹脂 購自滄州寶恩吸附材料科技有限公司;H103、X-5型大孔樹脂 購自天津南開大學樹脂有限公司;其他試劑 均為分析純,購自天津市福晨化學試劑廠。

數顯恒溫磁力攪拌循環(huán)水箱 常州國華電器有限公司;TDL-5-A低速大容量離心機 上海安亭科學儀器廠;Scientz-10N冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司;V-5600型可見分光光度計 上海元析儀器有限公司;Milli-Q超純水機 廈門精藝興業(yè)科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 麥胚粗黃酮的制備 根據本課題組前期優(yōu)化實驗得到的麥胚粗黃酮制備方法,取一定質量的麥胚,用70%乙醇,60 ℃浸提2 h,重復兩次,合并濾液,4000 r/min離心10 min,取上清液旋轉蒸發(fā)濃縮至無醇味,得到浸提液,并置于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 檢測方法 準確稱取5 mg蘆丁,用30%的乙醇溶解并定容至25 mL,分別精密吸取0、0.5、1、1.5、2、2.5 mL置于25 mL容量瓶,加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL,靜置6 min,加入10%硝酸鋁溶液1 mL,靜置6 min,再加入4%氫氧化鈉溶液10 mL,并用30%乙醇定容,混勻,靜置15 min?？梢姺止夤舛扔嬙?10 nm波長下測定吸光度,繪制標準曲線[8]。根據蘆丁標準曲線(y=12.45x+0.003,R2=0.9994)計算麥胚黃酮樣液濃度。

1.2.3 大孔樹脂預處理 先用95%乙醇浸泡24 h,使其充分溶脹,并除去雜質至流出液加水不變渾濁為止。蒸餾水洗凈乙醇,再用2體積,5%NaOH水溶液浸泡3 h,蒸餾水洗至中性,2體積4% HCl水溶液浸泡3 h,蒸餾水洗至中性,保存?zhèn)溆肹9]。

1.2.4 大孔樹脂的篩選 準確稱取濕樹脂各1.0 g,加入25 mL樣液于100 mL錐形瓶中,在水浴搖床(25 ℃、100～120 r/min)上振蕩24 h,計算樹脂吸附率。然后用蒸餾水洗樹脂三次以除去表面殘留樣液,再加入50 mL,70%乙醇解吸24 h后計算解吸率[10-11]。考察大孔樹脂靜態(tài)吸附、解吸性能。

式中:C0為初始樣液濃度,C1為平衡濃度,C2為洗脫液濃度,V0為初始樣液體積,V2為洗脫液體積,M為樹脂干重。

1.2.5 大孔樹脂純化麥胚黃酮條件優(yōu)化

1.2.5.1 樣液pH對吸附效果的影響 用酸堿調節(jié)樣液pH分別為3.44、4.36、5.62(樣液本身pH)、6.43、7.70。準確稱取500 mg干樹脂,加入25 mL樣液于100 mL錐形瓶,在水浴搖床(25 ℃、100～120 r/min)上振蕩吸附5 h,計算樹脂吸附能力?？疾鞓右簆H對大孔樹脂吸附效果影響。

1.2.5.2 上樣濃度對吸附效果的影響 配制濃度分別為0.470、0.554、0.639、0.650、0.775、0.859、0.908、1.0 mg/mL的樣液,準確稱取1.0 g干樹脂,加入30 mL樣液于100 mL錐形瓶,在水浴搖床(25 ℃、100～120 r/min)上振蕩吸附5 h,計算樹脂吸附量及吸附率?？疾焐蠘訚舛葘Υ罂讟渲叫Ч挠绊憽?/p>

1.2.5.3 上樣速度對吸附效果的影響 取一定量處理好的大孔樹脂濕法裝柱,柱體積為30 mL,將一定濃度的樣液分別以1.0、2.0、3.0、4.0 BV/h速度上樣,每10 mL收集一次流出液,達到泄漏點時,停止上樣,測定流出液黃酮濃度。考察不同上樣速度對大孔樹脂吸附效果的影響。

1.2.5.4 解吸液濃度對解吸效果的影響 準確稱取500 mg干樹脂,加入25 mL樣液于100 mL錐形瓶,在水浴搖床(25 ℃、100～120 r/min)上振蕩吸附5 h,吸附平衡后先用3 BV蒸餾水沖洗,再用50 mL濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%的乙醇解吸5 h,計算解吸率[12]?？疾旖馕簼舛葘馕Ч挠绊?。

1.2.5.5 解吸速度對解吸效果的影響 取一定量處理好的大孔樹脂濕法裝柱,柱體積為30 mL,將50 mL樣液以2 BV/h速度經大孔樹脂吸附完全后,先用3 BV蒸餾水沖洗,再用150 mL,70%乙醇分別以1.0、2.0、3.0、4.0 BV/h速度解吸,計算解吸率?？疾旖馕俣葘馕Ч挠绊憽?/p>

1.2.5.6 麥胚黃酮純度計算 在大孔樹脂最佳工藝條件下,對麥胚黃酮進行純化,得到的解吸液經真空冷凍干燥,計算純度。

式中:C為解吸液濃度,V為解吸液體積,G為解吸液冷凍干燥后固體質量

1.3 數據處理

應用SPSS19.0進行實驗數據處理。采用LSD法進行差異顯著性分析。圖中同一柱型的字母相同,表示差異不顯著(p>0.05),字母不同則表示差異顯著(p<0.05)。

2 結果與分析

2.1 不同類型大孔樹脂對麥胚黃酮吸附解吸的影響

大孔樹脂吸附效果主要跟樹脂極性及其孔徑大小有關[10]。由圖1可知,X-5、H103兩種非極性樹脂吸附率及吸附能力相對較高,且H103樹脂吸附率與其他6種樹脂之間均存在顯著性差異(p<0.05),這可能是因為麥胚乙醇提取液中黃酮的分子大小與X-5、H103兩種樹脂孔徑相當。同時7種樹脂解析率之間均無顯著性差異,因此,綜合考慮選擇H103進行后續(xù)實驗。

2.2 樣液pH對吸附效果的影響

表1 pH對吸附效果的影響Table 1 Effect of pH on adsorption capacity

圖1 7種大孔樹脂靜態(tài)吸附、解吸率比較Fig.1 Comparison of the static adsorption and desorption ratio of 7 different kinds of macroporous resin注：同一指標不同樹脂型號間進行差異顯著性分析，不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

注:字母相同,表示差異不顯著(p>0.05),字母不同則表示差異顯著(p<0.05);圖4、圖5同。由表1可知,樣液pH對樹脂吸附能力影響不大,調節(jié)pH為4.36、6.43及7.7時,H103樹脂對麥胚黃酮的吸附能力與pH為5.62(樣液自身pH)時無顯著性差異,調節(jié)pH為3.44時,吸附能力明顯增加,但此時樣液變得渾濁。Du H等[11]在用大孔樹脂分離純化毛雞骨草總黃酮的過程中也出現(xiàn)了類似的情況,這可能是因為pH過小時,強酸會使得樣液中一些物質的溶解度變小,析出使得樣液變渾濁。因此選擇5.62即樣品自身pH為最佳。

圖2 上樣濃度對吸附效果的影響Fig.2 Effect of sample concentration on adsorption capacity注：同一指標不同上樣液中黃酮濃度進行差異顯著性分析，不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

2.3 上樣濃度對吸附效果的影響

由圖2可知,麥胚乙醇提取液中黃酮濃度從0.47～1.00 mg/mL,樹脂吸附量逐漸增大,這是因為樣液中黃酮濃度越大,與樹脂單位表面積接觸的料液量越多,吸附量越大[12]。但在該濃度范圍內,樹脂的吸附率先增大后減小,且0.55～0.65 mg/mL,樹脂吸附量及吸附率增幅最大,黃酮濃度為0.65 mg/mL時吸附率達到最大,且與其他濃度下的吸附率均存在顯著性差異,可能是因為麥胚乙醇提取液中黃酮濃度超過0.65 mg/mL之后,濃度太大,導致在上樣過程中樣液還沒來得急被樹脂充分吸附就流出來了,使得吸附率降低。因此,從節(jié)約原料、提高效率角度考慮,確定0.65 mg/mL為最佳上樣濃度。

2.4 上樣速度對吸附效果的影響

由圖3可知,樣液上樣速度為1.0、2.0 BV/h時,泄漏點均出現(xiàn)在第110～120 mL;上樣速度為3.0、4.0 BV/h時,泄漏點均出現(xiàn)在第80～90 mL。因此考慮到樣液的利用率及當上樣速度為1.0 BV/h時,樹脂對樣液的分離效率較低,選擇2.0 BV/h為本實驗最佳的上樣速度。

圖3 上樣速度對吸附效果的影響Fig.3 Effect of sample flow rate on adsorption capacity

2.5 解吸液濃度對解吸效果的影響

由圖4可知乙醇濃度從40%～95%,對麥胚乙醇提取液中黃酮解吸效果先增大再減小,70%時最佳且與乙醇濃度為40%、50%、90%及95%時的解析效果存在顯著性差異?？赡芤驗镠103樹脂屬于非極性樹脂,乙醇溶液極性越小,對有效成分的解吸效果越好,但乙醇濃度過高,解吸出的醇溶性雜質增多,使得解吸率降低。因此,確定70%為最佳解吸乙醇濃度。

2.6 解吸速度對解吸效果的影響

由圖5可知,當解吸速度為1.0、2.0 BV/h時,解吸率均高于80%,而解吸速度為3.0、4.0 BV/h時,解吸率顯著降低。這是由于一定用量的乙醇解吸,當解吸速度太大時,會因為被樹脂吸附的有效成分沒有足夠的時間完全溶于乙醇而造成解吸率較低;而當解吸速度太低時,雖然解吸率較高,但解吸所耗費時間較長,效率太低,且會因為流出的解吸液不夠集中而導致拖尾現(xiàn)象的出現(xiàn)[13]。因此,選擇2.0 BV/h為最佳解吸速度。

2.7 吸附透過曲線、解吸曲線

由圖6可知,大孔樹脂柱在連續(xù)吸附25 BV樣液后,流出液中黃酮濃度基本趨于穩(wěn)定,說明H103型大孔樹脂在最佳分離工藝條件下可以處理約25 BV樣液而不發(fā)生穿透現(xiàn)象,處理量較大。由圖7可知,大孔樹脂吸附完全之后用3 BV,70%乙醇可基本解吸完全,第4 BV解吸液中黃酮解吸量較低,之后無拖尾現(xiàn)象。從節(jié)省時間跟試劑方面考慮,選擇3 BV為最佳解吸液用量。

圖6 吸附透過曲線Fig.6 The curve of adsorption leakage

圖7 解吸曲線Fig.7 The curve of desorption

2.8 麥胚黃酮經大孔樹脂純化后純度測定

經大孔樹脂最佳工藝,即上樣濃度約0.65 mg/mL、上樣速度2 BV/h、用3 BV 70%乙醇以2 BV/h速度解吸后得到的麥胚黃酮純度為11.77%,相較于浸提液中麥胚總黃酮純度0.96%,提高了12.26倍。

3 結論

H103大孔樹脂對麥胚黃酮吸附量大,易解吸,適用于麥胚黃酮的分離純化。且在最佳分離純化工藝條件下,能處理約25 BV樣液而不發(fā)生泄露,3 BV,70%乙醇能基本完全洗脫而無拖尾現(xiàn)象。經H103大孔樹脂純化后的麥胚黃酮純度為11.77%,相較于浸提液中麥胚總黃酮純度0.96%,提高了12.26倍。

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Purification of flavonoids from wheat germ by macroporous resin

LIU Wan-ling1,XIAO Jian-hui1,HUANG Zhan-wang2,NIU Li-ya1,*

(1.School of Food Science and Engineering,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,China;2.School of Engineering,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,China)

Based on the previous study of the extraction of flavonoids from wheat germ(FWG),the purification of FWG was performed by macroporous resin. Seven kinds of macroporous resin were selected to compare their purification ability by using adsorption and desorption rate as the indicators. Furthermore,the best one was used to optimize the separation process. The data indicated that H103 had better adsorption and desorption property for purification. The optimal adsorption parameters were as follows:the sample concentrations was about 0.65 mg/mL,the flow rate was 2.0 BV/h,the desorption solution concentration was 70% ethanol,the desorption rate was 2.0 BV/h. After one run treatment with H103 resin,the extraction of FWG was increased 12.26 times,and the content of flavonoids was up to 11.77% from 0.96%.

wheat germ flavonoids;macroporous resin;purification

2016-07-25

劉宛玲(1988-)，女，碩士研究生，研究方向：天然產物提取及其功能性研究，E-mail:446038874@qq.com。

*通訊作者:牛麗亞(1984-)，女，博士研究生，講師，研究方向：功能性食品，E-mail:nly8483@163.com。

國家自然科學基金資助項目(31401484)；江西省青年科學基金計劃(20142BAB214002)。

TS210.1

B

1002-0306(2017)02-0293-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.048